endocitosis

Oct 21, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5524 (2022) Citar este artículo

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Se cree ampliamente que la transferencia horizontal de genes en bacterias se produce a través de la conjugación, la transducción y la transformación. Estos mecanismos facilitan el paso del ADN a través de la pared celular protectora utilizando maquinaria sofisticada. Aquí, informamos que las bacterias deficientes en la pared celular pueden engullir el ADN y otro material extracelular a través de un proceso similar a la endocitosis. Específicamente, mostramos que las formas L del actinomiceto filamentoso Kitasatospora viridifaciens pueden absorber ADN plasmídico, polisacáridos (dextrano) y nanopartículas lipídicas de 150 nm. El proceso implica la invaginación de la membrana citoplasmática, lo que lleva a la formación de vesículas intracelulares que encapsulan el material extracelular. La captación de ADN no se ve afectada por la eliminación de genes homólogos a comEC y comEA, que son necesarios para la transformación natural en otras especies. Sin embargo, la azida de sodio o la incubación a 4 °C inhiben la absorción, lo que sugiere que el proceso depende de la energía. Los materiales encapsulados se liberan en el citoplasma tras la degradación de la membrana de la vesícula. Dado que las bacterias deficientes en la pared celular se consideran un modelo para las formas de vida tempranas, nuestro trabajo revela un posible mecanismo para que las células primordiales adquieran alimentos o material genético antes de la invención de la pared celular bacteriana.

Las bacterias están constantemente expuestas a condiciones ambientales cambiantes y dependen de su envoltura celular para su protección. La envoltura celular consiste en una membrana celular y una pared celular para separar el ambiente interno del externo. La membrana celular es una bicapa de fosfolípidos que encierra el citoplasma y funciona como una barrera selectiva. La pared celular consta de una capa gruesa de peptidoglicano (PG) para las bacterias Gram-positivas y una capa más delgada de PG rodeada por una membrana externa para las bacterias Gram-negativas. La capa de peptidoglicano es una estructura similar a una malla importante que no solo brinda protección contra el estrés mecánico y la presión de la turgencia, sino que también define la forma y la rigidez de las células.

Para facilitar el paso selectivo de macromoléculas a través de la envoltura celular, las bacterias han desarrollado sistemas de transporte especializados y sofisticados1. Por ejemplo, las bacterias naturalmente transformables se basan en complejos de proteínas para la absorción de ADN, con componentes similares a los pili tipo IV o los sistemas de secreción tipo II. El transporte activo de ADN a través de la pared celular se ve facilitado por la retracción de las estructuras del pilus que se unen al ADN2,3. A continuación, se utilizan proteínas de unión al ADN y formadoras de poros para trasladar el ADN a través de la membrana celular.

Aunque la pared celular es una estructura vital para la mayoría de las bacterias, algunas bacterias carecen naturalmente de una pared celular o pueden desprenderse de su pared bajo condiciones específicas. Los ejemplos incluyen a los miembros de Mollicutes, que son parásitos y viven en entornos osmóticamente protectores específicos, como las superficies mucosas humanas o los tubos de tamiz del floema de las plantas4. La exposición prolongada a factores estresantes ambientales, como los agentes que atacan la pared celular, genera las llamadas formas L, que son células que pueden proliferar sin sus paredes celulares. La reproducción de las formas L es independiente de la maquinaria de división canónica basada en FtsZ5 y está impulsada por un desequilibrio en la relación entre el área superficial y el volumen de las células causado por la regulación al alza de la síntesis de membrana que conduce a la formación de ampollas, tabulación y formación de vesículas espontáneas6,7. Estas características de células primitivas hacen de las formas L un sistema modelo atractivo para estudiar la evolución de la vida temprana8,9.

Algunos actinomicetos filamentosos, como el formador de micelio Kitasatospora viridifaciens, tienen la capacidad de mudar transitoriamente su pared celular en condiciones de estrés hiperosmótico (Fig. 1a)7. A diferencia de las formas L, las células S no pueden proliferar sin su pared celular, aunque estas células pueden volver al modo de crecimiento micelial después de reconstruir su pared celular. Las células temporalmente deficientes en la pared celular también pueden generarse artificialmente a partir de bacterias con paredes mediante la eliminación enzimática de la pared celular, por ejemplo, mediante la acción de la lisozima que degrada el peptidoglicano. Esto conduce a la formación de protoplastos o esferoplastos, que se utilizan ampliamente con fines de ingeniería genética, a menudo implicando el uso de polietilenglicol (PEG) para permitir la entrada de ADN en la célula10. Aunque esta transformación basada en PEG es una técnica ampliamente utilizada para la transformación de actinomicetos filamentosos, nunca se ha demostrado sin ambigüedades si las células con paredes de K. viridifaciens, o sus células naturales deficientes en la pared celular, son capaces de una transformación genética natural sin usar PEG. Se desconoce cómo la ausencia de la pared celular afecta la absorción natural de macromoléculas como el ADN del medio ambiente.

a Representación esquemática de la generación de células deficientes en la pared celular de K. viridifaciens. Las células deficientes temporales en la pared incluyen protoplastos, obtenidos a partir de células miceliales por la acción de la lisozima, y ​​células S, extruidas de las puntas de las hifas en un medio con alta presión osmótica. Las formas L permanentemente deficientes en la pared se generan después de una incubación prolongada del micelio bajo una presión osmótica alta (línea M1), con la suplementación opcional de lisozima (Lys) y penicilina G (PenG) (líneas alfa y delta). b Micelio (n = 3), protoplastos (n = 5 de dos experimentos), células S (n = 7 de dos experimentos) y líneas en forma de L alfa (n = 3 para células de 4 y 6 días ), delta (n = 2 para células de 3 y 7 días) y M1 (n = 1 para células de 3 días) se incubaron con ADN plasmídico (pRed*) durante 18 a 24 h, se sembraron en medio selectivo e incubado a 30 °C para seleccionar las células transformadas. Se da un primer plano de la morfología de la colonia de las formas L. Las barras de escala indican 1 mm. Tenga en cuenta que solo las formas L muestran una captación de ADN constante. c Eficiencia de transformación basada en polietilenglicol (PEG) de micelio, protoplastos, células S y formas L de K. viridifaciens usando ADN plasmídico (pRed*) como se indica en el porcentaje de colonias transformadas. n = 3 réplicas biológicas a excepción de las células S (n = 4). d Eficiencia de transformación de alfa y alfaΔcomEA/EC de 7 días de edad después de 24 h de incubación con pFL-ssgB. UFC = unidades formadoras de colonias. ns = no significativo (n = 5 réplicas biológicas, prueba t independiente bilateral, t (8) = 1,572, P = 0,155). e Eficiencia de transformación de alfa de 1, 3 y 7 días después de 24 h de incubación con pFL-ssgB. Los asteriscos (**) indican P ≤ 0,01 (n = 4 réplicas biológicas, ANOVA unidireccional, F (2, 9) = 12,16, prueba post hoc de Tukey, P = 0,006 (1–3 días) y 0,005 (1–7 día)). f Eficiencia de transformación de alfa de 7 días incubada con pRed* durante 6, 24 o 48 h. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa entre la incubación de 6 y 24 h (prueba bilateral de Kruskal-Wallis, H(2) = 8,769, P = 0,012 con la prueba por pares de Dunn, incluida la corrección de Bonferroni, da P = 0,010 para 6 y 24 h, P = 0,233 para 6 y 48 h y P = 0,718 para 24 y 48 h). ns no significativo. n = 4 réplicas biológicas. g Polarización generalizada (GP) como medida de la fluidez de la membrana de alfa de 1, 3 y 7 días utilizando el colorante de membrana Laurdan. Un GP más bajo indica una mayor fluidez de la membrana. n = 3 réplicas biológicas. Los datos en (c-g) se representan como media ± SD con puntos de datos individuales. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En este trabajo mostramos que las formas L del actinomiceto filamentoso K. viridifaciens pueden tomar ADN independientemente de la maquinaria de transformación genética natural canónica. En cambio, la captación se ve facilitada por un mecanismo de transferencia horizontal de genes que implica la invaginación de la membrana celular que conduce a la formación de vesículas internas. Además, mostramos que este mecanismo es robusto y también permite la absorción no específica de otras macromoléculas del medio ambiente. Dado que las formas L se consideran un modelo para la vida celular temprana, nuestro trabajo proporciona información sobre cómo estas células antiguas pueden haber adquirido biomoléculas y nanopartículas grandes del medio ambiente sin la necesidad de maquinarias de transporte complejas.

Se desconoce si las células con paredes o sin paredes de K. viridifaciens son capaces de una transformación genética natural. Para analizar esto, las células miceliares con paredes, las células S sin paredes temporales y los protoplastos, y las formas L (alfa) sin paredes permanentes se recolectaron recientemente y se resuspendieron en un medio LPB osmóticamente estable. Posteriormente, las células se incubaron durante 18 a 24 h con ADN plasmídico (pRed*) que contenía un casete de resistencia a antibióticos y se colocaron en placas en medios selectivos y no selectivos para permitir la detección de células transformadas. En particular, las formas L pudieron absorber ADN de manera consistente, a diferencia del micelio, los protoplastos y las células S (Fig. 1b). La captación de ADN no se limitó a una línea en forma de L, sino que se observó con distintas líneas celulares en forma de L obtenidas de células con paredes de K. viridifaciens cultivadas en medio LPB con (líneas alfa y delta) o sin (línea M1) penicilina y lisozima7 ,11. No se obtuvieron transformantes con alfa cuando se usó ADN genómico intacto o fragmentado, o cuando se usó plásmido metilado (Figura complementaria 1a, b). Si bien la transformación genética natural estaba restringida a las formas L, todas las células con pared deficiente podían transformarse químicamente usando polietilenglicol (PEG), con protoplastos, células S y formas L con una eficiencia de transformación promedio de entre 1,7 y 2,5 % (Fig. .1c). La adición de PEG también permitió la transformación de alfa con ADN genómico, incluso si estaba presente en un extracto celular crudo (Fig. 1c complementaria). Por otro lado, el uso de ADN metilado impidió la transformación química, lo que indica que la transformación basada en PEG es posible con diferentes tipos de ADN, pero está limitada por la presencia de un patrón de metilación diferente. Por el contrario, las células amuralladas no pudieron transformarse con o sin PEG (Fig. 1b, c). Estos resultados muestran que, en estas condiciones, las formas L pueden absorber ADN de forma natural, a diferencia de las células con paredes, las células S y los protoplastos.

Las bacterias transformables de forma natural utilizan una maquinaria de translocación de ADN especializada con similitudes con los pili de tipo IV o los sistemas de secreción de tipo II para captar el ADN externo2. Componentes similares de este sistema canónico también podrían estar involucrados en la captación de ADN por las formas L. Una búsqueda BlastP utilizando la proteína de unión al ADN ComEA y la proteína de canal ComEC de la bacteria transformable naturalmente Bacillus subtilis str. 168 contra K. viridifaciens produjo dos éxitos significativos: BOQ63_029625 (proteína que contiene el dominio hélice-horquilla-hélice) y BOQ63_029630 (proteína de competencia de la familia ComEC/Rec2), respectivamente (Tabla complementaria 1 y Figura complementaria 1d). La translocasa de helicasa/ADN de B. subtilis ComFA dio como resultado un acierto en un gen codificante de Mfd putativo (BOQ63_020315), una proteína bacteriana ampliamente conservada que interviene en la reparación del ADN acoplado a la transcripción12. No se encontraron otros ortólogos que se correlacionaran con las proteínas involucradas en el transporte de ADN a través de la envoltura celular para B. subtilis, el Gram-negativo Neisseria gonorrhoeae13, o para el sistema de captación de ADN relacionado con T4SS de Helicobacter pylori14 (Tabla complementaria 1). Las formas L carecen de una pared celular intacta basada en peptidoglicano y, por lo tanto, el ADN solo debe cruzar la membrana celular para la internalización. En bacterias naturalmente transformables, ComEA y ComEC funcionan en el transporte de ADN a través de la membrana celular13,15,16. Aunque se desconoce el papel de los genes putativos comEC y comEA en K. viridifaciens, ya que sus células amuralladas no mostraban captación de ADN, nos preguntamos si estas proteínas podrían estar involucradas en la captación de ADN en formas L. Por lo tanto, reemplazamos los genes putativos comEC y comEA en la cepa alfa en forma de L por un casete de resistencia a la apramicina (Figura complementaria 1d, e). Sorprendentemente, la eliminación simultánea de los genes comEA y comEC no afectó la eficiencia de transformación (prueba t independiente bilateral, t(8) = 1,572, P = 0,155), lo que indica que la absorción de ADN por las formas L se produce independientemente de los genes homólogo a esta maquinaria canónica de translocación de ADN (Fig. 1d).

La capacidad de captar ADN para la transformación natural se regula de manera diferente entre las bacterias transformables de forma natural y puede ser constitutivamente activa o restringida a una fase de crecimiento específica, según lo revisado por Blokesch (2016)17. Uno de los factores que controlan el desarrollo de la competencia para la captación de ADN en B. subtilis es la fase de crecimiento18,19. Para estudiar si la edad del cultivo también afecta la capacidad de absorción de ADN de las formas L, se sometieron células de cultivos de diferentes edades a un ensayo de transformación. Las células de cultivos alfa de 1 día captan ADN más fácilmente que las de cultivos de 3 o 7 días (ANOVA unidireccional, F (2,9) = 12,16, prueba post hoc de Tukey, P = 0,006 y 0.005 respectivamente) (Fig. 1e). Para probar si los tiempos de incubación más cortos o más largos afectan la absorción de ADN, se determinó la eficiencia de transformación de alfa de 7 días después de 6, 24 y 48 horas de incubación con ADN (Fig. 1f). La transformación se detectó después de 6 h de incubación y aumentó después de 24 h (prueba bilateral de Kruskal-Wallis, H(2) = 8,769, P = 0,012 y la prueba de pares de Dunn con corrección de Bonferroni da P = 0,010 para 6 y 24 h, P = 0,233 para 6 y 48 h, y P = 0,718 para 24 y 48 h). No es improbable que las diferencias en las propiedades de la membrana que ocurren durante el crecimiento celular puedan, a su vez, afectar la capacidad de absorción del ADN. La fluidez de la membrana es una medida de la viscosidad promedio de la bicapa lipídica, que puede afectar el posicionamiento y el movimiento de proteínas y lípidos dentro de la membrana20. Una mayor fluidez de la membrana se caracteriza por un mayor trastorno de los ácidos grasos, un menor empaquetamiento de lípidos y mayores tasas de difusión, lo que puede conducir a una mayor permeabilización de la membrana21,22. El análisis de la fluidez de la membrana de los cultivos de diferentes edades indicó que la mayor capacidad de captación de ADN puede correlacionarse positivamente con la fluidez de la membrana, como se deduce de la polarización generalizada (GP, un GP más bajo indica una mayor fluidez)23 (Fig. 1g), aunque no se observaron diferencias estadísticamente significativas (ANOVA unidireccional de Welch, F(2, 2,798) = 13,226, P = 0,038, con prueba post hoc de Games-Howell: 1–3 días P = 0,068; 1–7 días P = 0,134 ; 3-7 días P = 0,711, n = 3). Una fluidez relativamente baja podría explicar por qué los protoplastos y las células S deficientes en la pared temporal no pueden absorber el ADN de forma natural. Sin embargo, la fluidez de los protoplastos estuvo dentro del rango de cultivos de 1 a 7 días de edad, medidos con un ensayo en placa (Fig. 2a complementaria). El análisis posterior de la GP mediante imágenes de microscopía de fluorescencia mostró que, aunque los protoplastos y las células S tienden a tener membranas menos fluidas, estos valores se mantienen dentro del rango de fluidez de la membrana de las formas L de 1 a 7 días (Fig. 2b). Por lo tanto, aunque la fluidez de la membrana puede contribuir a la absorción eficiente del ADN, no es suficiente para explicar este proceso.

Para investigar más a fondo el mecanismo que facilita la absorción de ADN por las formas L, agregamos ADN plasmídico marcado con Cy5 a las formas L que expresan eGFP citoplasmático. Después de 3 días de incubación, se encontró ADN de plásmido marcado en el exterior de la membrana celular en forma de L o dentro de una vesícula interna aparente (Fig. 2a, Película complementaria 1 y control de la Fig. 3a complementaria). Como estas vesículas internas carecían de eGFP, razonamos que podrían haberse originado por un proceso de invaginación de la membrana, por el cual el material extracelular queda atrapado dentro de las vesículas. Para probar esto directamente, incubamos formas L que expresan eGFP con el tinte fluorescente SynapseRed C2M (SynapseRed). Dado que los tintes de estiril, como SynapseRed (equivalente a FM5-95), no pueden difundirse a través de las membranas celulares24,25, cualquier señal fluorescente en las membranas que rodean las vesículas internas sería un argumento sólido de que dichas vesículas se derivaron de la membrana celular. De hecho, se descubrió que SynapseRed no solo tiñe la membrana celular de las formas L, sino también las membranas de las vesículas internas después de la incubación durante la noche (Fig. 2b). La tinción con SYTO 9 indicó además que el ADN cromosómico estaba presente en el citoplasma pero no dentro de las vesículas internas (Fig. 2c). La incubación de protoplastos que producen eGFP citoplasmática con SynapseRed mostró que las áreas con menos fluorescencia de eGFP citoplasmática fueron causadas por la presencia de estructuras de membrana interna en lugar de por la formación de vesículas internas (Fig. 2d). Una incubación similar de células S mostró la presencia de estructuras internas similares a vesículas desprovistas de eGFP citoplásmica. Sin embargo, a diferencia de las formas L, la tinción posterior de las células S que producen mCherry citoplasmático con SYTO 9 indicó que estas regiones oscuras estaban llenas de ADN cromosómico. Como SynapseRed es un tinte impermeable a la membrana, la tinción de las estructuras de la membrana en las células S puede reflejar una mayor permeabilidad de la membrana en lugar de la tinción debido a la invaginación de la membrana celular. Para probar la difusión del tinte a través de la membrana celular, se incubaron células en forma de L y S con SynapseRed a 30 °C y a 4 °C para permitir y prevenir una posible invaginación de la membrana, respectivamente. Mientras que la membrana interna se tiñó en las células S tanto a 30 °C como a 4 °C, esto solo se observó a 30 °C para las formas L (Fig. 3b complementaria). Esto sugiere que la tinción de una membrana en las células S por SynapseRed se debe a la permeabilidad de la membrana celular para el tinte, en contraste con las formas L, en las que la tinción es el resultado de la invaginación de la membrana celular.

una micrografía de fluorescencia representativa de alfa pIJ82-GFP (eGFP citoplasmático; verde) incubada con ADN de plásmido marcado con Cy5 (pFL-ssgB; magenta) durante 3 días (n = 3 observaciones de un experimento). BF de campo claro. Consulte también la película complementaria 1. b Incubación de alfa pIJ82-GFP después de la incubación durante la noche con el colorante impermeable a la membrana SynapseRed C2M (SynapseRed; magenta), que muestra dos cortes en Z a diferentes alturas de una célula en forma de L. Se muestra una micrografía representativa de seis observaciones de un experimento. c Micrografía representativa de alfa (n = 7 observaciones de una incubación) y alfa pRed* (n = 9 observaciones de una incubación) teñidas con SYTO 9 (verde) para indicar ADN cromosómico. alfa se tiñe con SynapseRed C2M (SynapseRed; magenta) para visualizar las membranas celulares, mientras que (ausencia de) mCherry citoplasmático para alfa pRed* (magenta) indica la presencia de una vesícula interna. Se tomaron imágenes de las células directamente después de la adición de los tintes fluorescentes. d Imágenes representativas de protoplastos y células S de K. viridifaciens pIJ82-GFP que producen eGFP citoplasmático incubado con SynapseRed (SR) durante 72 h (filas superiores, al menos seis observaciones de dos experimentos independientes con células S y protoplastos), y S -células de K. viridifaciens pRed* que producen mCherry citoplasmático incubadas con SynapseRed y SYTO 9 durante 72 h (fila inferior, tres observaciones de un experimento). Tenga en cuenta que la presencia de estructuras de membrana interna y/o ADN puede causar una reducción en la emisión de fluorescencia citoplasmática. e Imágenes fijas de un experimento de imágenes de lapso de tiempo de 950 minutos de alfa que produce DivIVA-eGFP (alfa pKR2) (verde) incubado con 3 kDa Dextrano-Texas Red (D-TR; magenta) (n = 1). Las flechas indican la localización de DivIVA-eGFP. Consulte también la película complementaria 2. f Micrografía representativa de la formación de focos y estructuras de anillo de DivIVA-eGFP en alfa pKR2 (verde) después de la incubación durante la noche con D-TR (magenta) (más de 50 observaciones de un experimento). Tenga en cuenta que las formas L pueden absorber ADN teñido con fluorescencia y dextrano mediante la formación de vesículas internas. g Eficiencia de transformación de alfa y alfaΔdivIVA de 7 días usando pFL-ssgB. ns no significativo (prueba t independiente bilateral, t(8) = 0,489, P = 0,638). Unidades formadoras de colonias de UFC. Los datos se representaron como media ± SD con puntos de datos individuales, n = 5 repeticiones biológicas. Las formas h L sin DivIVA pueden producir vesículas internas como se muestra para alfaΔdivIVA pIJ82-GFP de 5 días de edad que produce eGFP citoplasmático (n = 2 observaciones de un cultivo). Las barras de escala indican 2 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para comparar la presencia de estructuras vesiculares internas putativas en los diferentes tipos de células, se cuantificó el porcentaje de formas L, protoplastos y células S con estas estructuras. Las células que producen mCherry citoplasmático (alfa pRed* o células S y protoplastos derivados de K. viridifaciens pRed*) se incubaron con SynapseRed durante 0 y 3 días para teñir las membranas. El ADN se visualizó con SYTO 9 antes de la toma de imágenes. Se cuantificó el número de células con regiones que carecen de emisión de fluorescencia del citoplasma, el ADN y la membrana, lo que podría indicar la presencia de vesículas internas (Tabla complementaria 2). Con este método, las formas L tienen entre 6 y 11 veces más presencia de dichas regiones que las células S (formas L: 24,5 y 14,7 %; células S: 2,2 y 2,6 % después de 0 y 3 días de incubación, respectivamente), y rara vez se observaron vesículas putativas para los protoplastos (<0,5%). Si estas regiones en las células S y los protoplastos fueran vesículas internas reales, es probable que su aparición no sea suficiente para detectar una transformación consistente con el ADN. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que las vesículas observadas dentro de las formas L se originan a partir de la invaginación de la membrana celular, por lo que el ADN extracelular puede quedar atrapado dentro de dichas vesículas, mientras que esto no es evidente para las células S y los protoplastos.

En eucariotas, la endocitosis es un proceso que permite la captación de carga externa a través de la formación de vesículas internas, que finalmente se degrada o recicla26,27. Los dextranos marcados con fluorescencia se utilizan ampliamente como marcadores de endocitosis en eucariotas, ya que no pueden atravesar la membrana celular28,29. Para identificar si un proceso similar a la endocitosis podría estar presente en formas L y para visualizar la absorción de materiales externos, incubamos las células con Dextrano-Texas Red (D-TR) y realizamos imágenes de lapso de tiempo. La cepa en forma de L utilizada también expresa DivIVA-eGFP, que tiene una fuerte afinidad por las regiones de membrana con curvatura negativa (alfa pKR2)30. Se espera que dichas regiones se formen tras la invaginación de la membrana. Después de 290 minutos de incubación, D-TR era visible dentro de la forma de L y comenzaron a aparecer puntos débiles de DivIVA-eGFP adyacentes a esta región (Fig. 2e y Película complementaria 2). Esto progresó a un claro abultamiento hacia el interior de la membrana celular con dos focos de DivIVA-eGFP a cada lado de la membrana invaginada y una entrada de D-TR (t = 560 min). Después de 640 min se formó una vesícula interna que contenía D-TR. En otras células, DivIVA-eGFP parecía formar una estructura similar a un anillo, que a veces envolvía la membrana invaginante (Fig. 2f celda 1 y 2). La presencia de DivIVA cerca del sitio de invaginación implica la presencia de regiones curvadas negativamente en la membrana. En particular, no se requiere DivIVA para la formación de vesículas o la captación de ADN, ya que la eliminación de divIVA (alfaΔdivIVA) no tuvo efecto sobre la transformación (prueba t independiente bilateral, t(8) = 0,489, P = 0,638) (Fig. 2g ), y esta cepa todavía formaba vesículas internas (Fig. 2h). Además, también se observó la internalización de D-TR en formas L que no expresaban DivIVA-eGFP, lo que indica que la absorción no es una consecuencia de la presencia de la proteína de fusión (Fig. 3c complementaria). La incubación de protoplastos y células S con D-TR hasta 72 h no dio como resultado una encapsulación clara de D-TR en vesículas internas (Fig. 3d complementaria). Para cuantificar esto, las células que producen eGFP citoplasmática se incubaron con D-TR o PBS durante 72 h. Se contó el porcentaje de células con regiones que carecen de eGFP pero que contienen D-TR en esta región. La incubación repetida (duplo) dio como resultado la absorción de D-TR en alrededor del 6 % de las células en forma de L y ninguna absorción para el control con PBS (Tabla complementaria 3). No se observó una captación clara para las células S y los protoplastos incubados con D-TR en comparación con las células de control incubadas con PBS (células S: 0,9 y 1,7 % con D-TR versus 0 y 2,1 % con PBS; protoplastos: 0 y 1,1 % con D-TR versus 0 y 0,8% con PBS). En conjunto, estos resultados muestran que la invaginación de la membrana celular de formas L puede conducir a la formación de vesículas internas y puede representar un mecanismo similar a la endocitosis que permite la absorción de moléculas, incluido el ADN, del medio ambiente.

Las nanopartículas lipídicas (LNP) son partículas no virales que se utilizan para administrar ácidos nucleicos y fármacos a las células humanas a través de la endocitosis31. Los LNP no tienen una estructura de bicapa lipídica, sino que consisten en un núcleo hidrofóbico denso en electrones de lípidos que encapsulan ácidos nucleicos mediante interacciones electrostáticas y están rodeados por una capa de PEG-lípidos31. Los LNP internalizados se encuentran en endosomas que son orgánulos unidos a la membrana de la vía endocítica. La acidificación posterior hace que los lípidos ionizables de las LNP se carguen positivamente, lo que permite que la LNP desestabilice la membrana endosómica y entregue su carga a la célula. Los LNP también se pueden marcar con fluorescencia mediante la incorporación de fosfolípidos conjugados con fluoróforo. Para explorar más a fondo la capacidad de las formas L para absorber partículas externas grandes, las células se incubaron con LNP marcados con rodamina (LNP-LR, que contiene Liss Rhod PE 18: 1) con un tamaño promedio de 150 nm, para permitir su detección. dentro de formas en L. Después de la adición de LNP-LR a formas L de 7 días, se pudo detectar una señal fluorescente clara, probablemente generada por múltiples partículas de LNP, dentro de las células después de la incubación durante la noche, así como la localización de LNP en la membrana celular (Fig. 3a y la figura complementaria 4a, b). Cuando se usaron formas L que producían eGFP en el citoplasma, las vesículas solo contenían LNP y no eGFP, lo que sugiere fuertemente que las LNP se habían internalizado en vesículas desprovistas de citoplasma (Fig. 3b, c y control de imágenes, Fig. 4c complementaria). Es importante destacar que la adición del inhibidor metabólico azida de sodio (1, 2,5 o 10 mM), que se dirige a la cadena respiratoria32, o la incubación de células a 4 °C afectó la localización de LNP-LR (Fig. 3d, e y Fig. complementaria 4d–i). Estas condiciones se usan comúnmente para inhibir la endocitosis al reprimir la producción de energía33,34. Bajo tales condiciones, los LNP parecían localizarse en la membrana celular en lugar de dentro de la célula. El efecto inhibidor de la azida de sodio y la incubación a 4 °C sobre la captación de material extracelular por las formas L se cuantificó mediante D-TR, ya que la captura de la captación de LNP-LR era demasiado infrecuente para cuantificarla con precisión. Sorprendentemente, se observó una reducción significativa de la captación de D-TR por las formas L en presencia de azida sódica 2,5 mM (5,9 % frente al 1,9 % de las células que mostraban captación de D-TR para el control y azida sódica, respectivamente (dos proporciones z- prueba, z = 3.111, P unilateral < 0.001), y la incubación de formas L a 4 °C inhibió completamente la absorción de D-TR (Fig. 3f). Estos resultados son consistentes con un proceso de absorción en formas L que es dependiente de la energía, por lo que el material externo se internaliza mediante un proceso de invaginación de la membrana.

a, b Micrografías representativas de la localización de LNP-LR (nanopartículas lipídicas que contienen 18:1 Liss Rhod PE; magenta) en vesículas internas de alfa (a; n = 5 observaciones) y alfa pIJ82-GFP (b; n = 2 observaciones) después de un experimento de incubación de una noche y de 3 días a 30 °C, respectivamente. c Gráfica de perfil de densidad de valores grises (intensidad de píxeles) de la selección de línea correspondiente de alfa pIJ82-GFP (b) incubada con LNP-LR que muestra que una disminución en la emisión citoplasmática de eGFP se correlaciona con un aumento en la emisión de LNP-LR. d, e Localización de LNP-LR durante la incubación con alfa a 4 °C (d) o en presencia de azida de sodio 2,5 mM (NaN3) a 30 °C (e) después de 0, 24 y 48 h de incubación . Se obtuvieron resultados similares con azida de sodio 1 y 10 mM (consulte la Fig. 4 complementaria). Las imágenes se obtuvieron de un experimento. f Porcentaje de células alfa pIJ82-GFP que muestran captación de dextrano-Texas Red (D-TR) después de 3 días de incubación a 30 °C (control), en presencia de azida sódica 2,5 mM (NaN3) o incubadas a 4 °C. Se observó una reducción significativa en la captación de D-TR para la azida sódica (prueba z de dos proporciones, z = 3,111, unilateral, P = 0,00093) y después de la incubación a 4 °C no se detectó captación (ND). Los asteriscos (***) indican P ≤ 0,001. El porcentaje de células con captación de D-TR y el número total de células analizadas se proporciona para cada condición y se basa en recuentos celulares combinados de dos incubaciones repetidas. Tenga en cuenta que la incubación de formas L con nanopartículas de lípidos (tamaño promedio de 150 nm) da como resultado su localización dentro de vesículas internas y que la absorción de partículas externas se inhibe mediante la incubación a 4 °C o con azida de sodio. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para comprender mejor la ultraestructura y la composición de las vesículas intracelulares, se tomaron imágenes de las formas L utilizando microscopía de luz y electrónica crio-correlativa 3D (cryo-CLEM) (Fig. 4a). Cryo-FIB-SEM (microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocado) permite obtener imágenes 3D de alta resolución de formas L y vesículas internas. La preparación de muestras criogénicas y la obtención de imágenes garantizan que las formas L se visualicen en un estado casi nativo a través de la congelación rápida en condiciones de alta presión que permiten la transformación de líquido en hielo amorfo35,36,37.

a Ejemplo de micrografías electrónicas y de fluorescencia correlacionadas de alfa pIJ82-GFP (imagen de Zen Connect) tal como se realizó con todas las células de las que se tomaron imágenes. Un ráster finderTOP visible tanto en microscopía de fluorescencia como electrónica facilita la alineación entre los dos módulos de imagen. Los cuadrados indican diferentes regiones de interés, con imágenes de mayor resolución. Haz de iones enfocado FIB-SEM: microscopía electrónica de barrido, luz de fluorescencia FL. b Ejemplo de una imagen de mayor resolución de una región de interés (ROI) seleccionada, que muestra muchas células fluorescentes. c Micrografía de fluorescencia de la forma de L representada por el recuadro blanco en (b), que muestra una esfera oscura intracelular (~1 μm, flecha blanca), como se realizó para seleccionar todas las células de interés. Las flechas X, Y y Z en (b–d) indican la orientación 3D de la celda de la imagen como se observa en 3D FIB-SEM. d Imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) (SE, Inlens) de la celda en (c) (tamaño ~ 6 μm) con una flecha que indica la vesícula interna (n = 1 celda). e Superposición de cinco cortes consecutivos (imágenes retrodispersadas) de celda en (d). Recuadro: Gráfica de perfil de densidad (blanco) de los valores grises promedio (intensidad de píxeles) para la región en el cuadro blanco (n = 1 celda). Rebanadas f-i FIB-SEM que muestran diferentes tipos de vesículas internas de tres células con imágenes. Vesículas que recubren la membrana celular de células de alrededor de 3,5 μm de tamaño (f, g). Los asteriscos indican vesículas en (f, g). Complejo de vesículas (h) con diferentes espesores de membrana de vesículas indicados con flechas blancas. Consulte también la figura complementaria 7a y la película complementaria 3. (i) Protuberancias de la membrana como se indica con una flecha blanca. j–q Análisis de las vesículas interconectadas de la célula en (i) (n = 1). j–l Tres cortes consecutivos que muestran la interacción de diferentes vesículas. n-p muestra una mayor ampliación de las regiones en los recuadros blancos en j-l, respectivamente. m, q Segmentación 3D de n–p. Mientras que algunas de las vesículas son intracelulares, otras sobresalen de la célula. Una estructura de vesícula conectada completa se muestra en verde (m, q) y se indica mediante flechas blancas (i, j, l, m). Consulte la figura complementaria 7b-d y la película complementaria 4. La celda en los paneles h-q tiene un tamaño de alrededor de 4 μm. r–u Las regiones con diferente contraste (indicadas por regiones coloreadas) están revestidas con partículas negras que representan supuestos cuerpos lipídicos como se muestra para una celda (regiones similares observadas en tres celdas). Esta celda tiene un tamaño de ~3,6 μm y se relaciona con el panel (g). La distribución de tamaño de las partículas negras es de 25 a 60 nm. Las barras de escala representan 500 nm a menos que se especifique lo contrario. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Después de la congelación a alta presión, se detectaron células con supuestas vesículas intracelulares en función de las regiones internas más oscuras que carecen de eGFP citoplásmica utilizando alfa pIJ82-GFP (Fig. 5 complementaria). Se tomaron imágenes de formas L específicas (ejemplo de selección en la Fig. 4b, c) en detalle usando cryo-FIB-SEM. De hecho, la reducción en eGFP citoplasmática coincidió con la presencia de vesículas internas detectadas por FIB-SEM (Fig. 4c, d, flecha blanca), en línea con los resultados anteriores (Fig. 2b). Además, la composición del citoplasma y el contenido de vesículas internas fue diferente, según lo medido con el detector de retrodispersión selectiva de energía (EsB) InLens, que proporciona un contraste basado en la distribución de elementos más pesados ​​(Fig. 4e). El análisis de la intensidad de los píxeles indicó que el nivel de contraste dentro de la vesícula interna era similar al del entorno extracelular, mientras que el citoplasma tenía un contraste mayor. Además, un experimento de sobreexposición mostró que la vesícula tiene la misma capacidad para absorber la dosis de electrones que el medio exterior, diferente del resto de la celda (Figuras complementarias 6a, b). Estos resultados respaldan el hallazgo de que las vesículas internas contienen medio extracelular y se forman a través de la invaginación de la membrana (Fig. 2).

Más imágenes de alta resolución indicaron la presencia de múltiples vesículas internas dentro de las células individuales (Fig. 4f-i, Fig. 6c-e complementaria). La mayoría de las vesículas detectadas recubrían la membrana celular (Fig. 4g y Fig. 6c-e complementaria), variaban en tamaño y grosor de la membrana (Fig. 4h) e incluso podrían estar presentes dentro de vesículas más grandes (Fig. 4h y Fig. 7a complementaria) . También se ha observado la presencia de vesículas dentro de otras vesículas mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 3c complementaria, flecha blanca), que muestra una vesícula no fluorescente dentro de una vesícula más grande que encapsula D-TR. Además, se pudieron observar vesículas brotando de la membrana celular (Fig. 4i). La reconstrucción en 3D de las vesículas en ciernes basada en el trazado del contorno reveló que estas eran una extensión de una vesícula interna o permanecían conectadas a las vesículas internas, formando un complejo (Fig. 4j-q, Fig. 7a-d complementaria y Películas complementarias 3 , 4).

En algunos casos, las células contenían regiones intracelulares con diferentes valores de gris del resto de la célula (Fig. 4r-u). Estas regiones tenían una distribución de tamaño de 300 a 800 nm, no recubrían la membrana celular y estaban rodeadas de partículas oscuras de alrededor de 25 a 60 nm de diámetro. Podría ser posible que estas partículas oscuras sean cuerpos lipídicos, en comparación con observaciones previas de cryo-FIB-SEM38,39. Una posible interpretación es que las regiones internas son vesículas cuya membrana lipídica envolvente se ha degradado parcialmente. Los lípidos y los productos de degradación de lípidos pueden haberse acumulado en gotitas de lípidos que dan como resultado las partículas negras observadas. Para capturar la degradación de vesículas internas, se realizaron imágenes de lapso de tiempo durante la noche en formas L que expresan mCherry citoplasmático (alfa pRed *). Las vesículas se identificaron por la falta de mCherry citoplasmático, y se tomaron imágenes de las células a diferentes alturas Z para confirmar que la vesícula no se había movido simplemente de ubicación. Se observó la interrupción de la vesícula utilizando formas L de 2 días de edad resuspendidas en medio LPB fresco (Película complementaria 5). Se capturaron dos eventos más de ruptura de vesículas después de realizar un lapso de tiempo sucesivo en la misma muestra, pero con diferentes células (Películas complementarias 6, 7). Todas las vesículas fotografiadas ya estaban presentes en las células al comienzo del lapso de tiempo. Mientras que el tiempo transcurrido hasta la ruptura de la vesícula varió mucho (después de 1 hora o después de 13 y 17 horas para el segundo experimento), el proceso de ruptura en sí ocurrió dentro de los 15 minutos, que fue el intervalo de tiempo entre imágenes consecutivas. Estos hallazgos fortalecen el modelo de que las vesículas internas de formas L pueden romperse y, de esta manera, liberar su contenido en el citoplasma.

Estos resultados confirman además que las vesículas internas observadas en las formas L de K. viridifaciens contienen un medio externo y pueden formarse mediante la invaginación de la membrana celular. Las formas L pueden contener múltiples vesículas de diferentes tamaños, en algunos casos formando grupos o complejos de vesículas que pueden sobresalir de la membrana celular. Las vesículas internas pueden liberar su contenido en la célula después de la degradación de las vesículas. Estos hallazgos respaldan un modelo para la absorción de macromoléculas como el ADN por inmersión, seguido de la liberación de la carga después de la ruptura de la vesícula (Fig. 5).

La invaginación de la membrana celular conduce a la formación de vesículas internas en forma de L. A medida que la membrana celular sobresale hacia adentro, se engulle el líquido extracelular que contiene ADN u otras macromoléculas. El mecanismo que subyace al proceso de invaginación depende de la energía y podría basarse en una mayor síntesis de membrana y una alta fluidez de membrana o estar mediado por proteínas similares a las involucradas en la endocitosis eucariota, como las proteínas del citoesqueleto. El ADN se libera de las vesículas internas mediante un proceso desconocido (indicado por una flecha discontinua), que puede implicar la ruptura de las vesículas. Imagen creada con BioRender.com.

La pared celular bacteriana es una importante barrera protectora para el medio ambiente, proporcionando resistencia al estrés y permitiendo el paso selectivo de moléculas. Sin embargo, en los últimos años ha quedado claro que, en algunas condiciones, las bacterias también pueden prosperar sin esta capa. La exposición prolongada al estrés ambiental, como los agentes que atacan la pared celular o una presión osmótica alta, puede inducir la formación de formas L que proliferan eficientemente sin su pared celular7. Se desconocen en gran medida las consecuencias de un estilo de vida bacteriano tan deficiente en la pared sobre su capacidad para absorber el ADN. Aquí proporcionamos evidencia de que las formas L pueden absorber ADN y otras macromoléculas a través de la inmersión y la posterior formación de vesículas internas (Fig. 5).

Los mecanismos bien conocidos de la HGT son la transformación natural, la transducción y la conjugación40. Estos mecanismos requieren maquinaria sofisticada para permitir el transporte de ADN a través de la envoltura celular. Aquí mostramos que las células deficientes en la pared, como los protoplastos, las células S y las formas L de K. viridifaciens, toman el ADN usando PEG. Es importante destacar que las formas L son las únicas células deficientes en la pared que logran una transformación espontánea consistente utilizando ADN plasmídico sin PEG. No se observó transformación cuando se utilizó ADN genómico sin utilizar PEG. Es probable que esto se deba a la cantidad de moléculas de gDNA ~200 veces menor que se usa en comparación con el ADN plasmídico, así como al requisito de doble recombinación del ADN genómico con el cromosoma para la integración estable del casete de resistencia a los antibióticos, lo que probablemente conduce a una menor eficiencia de transformación.

Las bacterias naturalmente transformables utilizan un sistema canónico y complejo para la captación de ADN a través de la pared celular y la membrana celular. El último paso requiere la proteína de unión al ADN ComEA y la proteína del canal formador de poros ComEC, con homólogos que se encuentran en especies grampositivas y gramnegativas transformables naturalmente (p. ej., ComE y ComA en N. gonorrhoeae). La interrupción de cualquiera de estas proteínas normalmente da como resultado una reducción drástica o incluso la ausencia de transformación15,16,41,42. Sin embargo, la disrupción de genes con homología con comEA y comEC en formas L de K. viridifaciens no tuvo efecto sobre su capacidad para captar ADN, lo que sugiere un mecanismo independiente de la maquinaria de transformación genética natural canónica.

La endocitosis es un proceso fundamental y altamente regulado en eucariotas que está involucrado en la absorción de nutrientes, la regulación de la composición de la membrana plasmática, la detección del entorno extracelular y la señalización43. La invaginación de la membrana y la subsiguiente escisión de la membrana y la formación de vesículas permite que las células internalicen una amplia gama de carga, como fluidos, ligandos, proteínas de la membrana plasmática y, a veces, incluso bacterias enteras. A la invaginación a menudo le sigue el paso de la carga a través de la vía endosomal y la degradación lisosomal26. Células específicas de mamíferos pueden captar ADN, seguido de expresión génica activa44, lo que potencialmente ocurre a través de endocitosis, aunque el mecanismo exacto no está claro45. Este trabajo muestra que las formas L utilizan un mecanismo similar a la endocitosis para la captación de ADN, mediante el cual la invaginación de la membrana conduce a la formación de vesículas intracelulares que, durante su formación, encapsulan material extracelular (Fig. 5). A través de este proceso, se encapsularon no solo el ADN sino también otras macromoléculas como el dextrano de 3 kDa e incluso nanopartículas de lípidos de 150 nm, lo que sugiere fuertemente que el proceso de captación no es específico. El proceso de absorción es inhibido por condiciones que reducen la actividad metabólica y la producción de energía. Curiosamente, un estudio anterior también informa la absorción de dextranos fluorescentes en vesículas internas de formas L de Bacillus subtilis, que se propuso que ocurriera a través de la endocitosis en fase fluida46.

Se desconoce el mecanismo exacto que subyace a la formación de vesículas intracelulares en formas L, pero puede depender de una mayor dinámica de membrana debido a un exceso de síntesis de membrana6,47. Un desequilibrio en la proporción entre la superficie celular y el volumen debido a un exceso de síntesis de membrana puede conducir a la formación de vesículas internas en mutantes de forma esférica de E. coli y B. subtilis6,48. También se pueden formar vesículas internas o vacuolas en protoplastos y esferoplastos agrandados (este último con una membrana externa) que se mantienen en condiciones que permiten la expansión de la membrana celular49,50. De hecho, la falta de exceso de producción de membrana también puede explicar por qué no observamos una captación constante de ADN en los protoplastos y las células S, los cuales no pueden proliferar sin su pared. Sin embargo, no podemos excluir si proteínas similares a las implicadas en la endocitosis eucariota, como las proteínas de la cubierta, la maquinaria de escisión o las proteínas del citoesqueleto43, están implicadas en la formación de vesículas internas en formas L. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las formas L de B. subtilis no se basan en proteínas citoesqueléticas conocidas para la deformación y proliferación de la membrana51.

Las imágenes de microscopía electrónica de alta resolución revelaron múltiples vesículas internas dentro de las células en forma de L. Curiosamente, las formas L también contenían regiones que no estaban rodeadas por una membrana pero que estaban revestidas con puntos más oscuros. Estas manchas oscuras, que se generan por la carga local de los electrones con el material, se describieron previamente como cuerpos proteicos o lipídicos38,39, y posiblemente se originen a partir de los productos de degradación de la membrana de las vesículas internas. La probable desintegración de las vesículas internas también se capturó mediante imágenes de lapso de tiempo. Esta desintegración conduciría a la liberación de la carga de vesículas en el citoplasma. En eucariotas, el escape de la terapéutica de las vesículas endosómicas puede estar mediado por agentes bacterianos, virales y químicos o por nanopartículas52,53. Los mecanismos de escape incluyen la formación de poros, la desestabilización de la membrana, el hinchamiento de nanopartículas o la ruptura osmótica. Los altos niveles de sacarosa o el efecto de esponja de protones facilitan la entrada de protones seguida de la acumulación de iones de cloruro y la entrada de agua, lo que lleva a la ruptura de la vesícula54,55. La acidificación de los endosomas se produce a través de ATPasas vacuolares (V-ATPasas) localizadas en la membrana que bombean protones a las vesículas56. Las bacterias tienen bombas de protones similares llamadas F-ATPasas en su membrana plasmática y se han encontrado en la membrana de vesículas intracelulares de protoplastos agrandados57. Teniendo en cuenta la complejidad de los mecanismos de escape conocidos, se requiere más investigación para comprender cómo las vesículas internas en forma de L pueden desintegrarse para liberar su contenido en el citoplasma.

Las formas de vida modernas son sistemas biológicos complejos, que probablemente evolucionaron a partir de células mucho más simples. Dos sistemas modelo para estudiar las supuestas formas de vida temprana son las vesículas lipídicas gigantes y las formas L debido a su falta de pared celular y forma biofísica de proliferación8,9. Se cree que la transferencia horizontal de genes desempeñó un papel fundamental en la evolución de los primeros años de vida58. Esto puede haber ocurrido en células que aún no desarrollaron una pared celular, lo que permitió la recombinación genética después de la fusión celular o la electroporación provocada por un rayo59,60, aunque se desconocían otros mecanismos de la HGT. Se han observado vesículas internas en formas L de otras especies bacterianas, y se han descrito diversas funciones y mecanismos de formación de vesículas61,62. Las formas L de Listeria monocytogenes son capaces de formar vesículas internas que contienen ADN a lo largo del interior de la membrana celular, que al liberarse se vuelven metabólicamente activas63,64, así como también forman vesículas internas a través de la invaginación de la membrana, que probablemente contienen medio extracelular47. Además, la invaginación secundaria de la propia membrana de la vesícula puede dar como resultado vesículas que contienen citoplasma y representar una descendencia viable.

Curiosamente, el trabajo preliminar muestra que las formas L de L. monocytogenes también tienen la capacidad de absorber ADN plasmídico extracelular y transformarse sin el uso de PEG65. No se sabe que esta especie bacteriana sea naturalmente transformable y no contiene un sistema de competencia funcional. Esto sugiere que un mecanismo similar a la endocitosis similar al observado en las formas L de K. viridifaciens podría ser responsable de la captación de ADN. Estos ejemplos proporcionan apoyo adicional para la existencia de endocitosis bacteriana.

Un estudio reciente informa similitudes entre microfósiles esféricos y protoplastos sin pared66. Cuando los protoplastos crecieron en condiciones que imitaban las supuestas condiciones del Eón Arcaico, el período en que se formó la vida en la Tierra, se formaron vesículas intracelulares. Estas vesículas también se observaron en microfósiles de 3.500 a 2.400 millones de años, lo que sugiere que las células sin pared pueden haber estado presentes en la antigüedad. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las células sin pared también se pueden formar a partir de bacterias con pared. Por ejemplo, se ha demostrado que Mycoplasma sin paredes se deriva de bacterias con paredes a través de una evolución degenerativa67, y las formas L generadas en el laboratorio también se originan a partir de células con paredes. Es posible que las formas L no hayan sido las células primordiales en sí mismas, sino que funcionan como un modelo para estudiar formas de vida tempranas putativas. Por lo tanto, proponemos que el proceso similar a la endocitosis observado en las formas L refleja un mecanismo antiguo de cómo las células primordiales pueden haber adquirido nuevo material genético y nutrientes a través de la absorción antes de la invención de la pared celular.

En conclusión, nuestro trabajo muestra que la pérdida permanente de la pared celular bacteriana permite la absorción de ADN, dextrano y nanopartículas lipídicas de 150 nm de tamaño a través de la formación de vesículas internas. La invaginación de la membrana celular conduce al engullimiento de fluidos externos y la subsiguiente formación de vesículas. Eventualmente, la vesícula puede romperse, lo que resulta en la liberación de la carga en el citoplasma. Este es un proceso dependiente de la energía que tiene similitudes con una forma simple de endocitosis como se ve en los eucariotas. Se requieren estudios futuros para comprender mejor los mecanismos moleculares detrás de este proceso.

Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas complementarias 4 y 5, respectivamente. Las líneas de células bacterianas están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Kitasatospora viridifaciens DSM4023968 se cultivó de manera confluente en medio de extracto de levadura y maltosa (MYM) para obtener esporas, que se recolectaron después de 3 a 4 días de crecimiento69. En resumen, las esporas se resuspendieron en MilliQ con un hisopo de algodón y se filtraron con una jeringa llena de algodón. Las esporas se resuspendieron en glicerol al 20 % (v/v) (G1345, Duchefa Biochemie) y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para el crecimiento micelial en líquido, K. viridifaciens se cultivó durante la noche a una densidad de 1 × 106 esporas ml−1 en caldo de fase L (LPB) sin sacarosa a 200 rpm. Las cepas se cultivaron durante 2 días en LPB con sacarosa (S0809, Duchefa Biochemie) a 100 rpm para inducir la formación de células S7. Las formas L se cultivaron en agar medio de fase L sólido (LPMA) o LPB7 líquido. Los cultivos líquidos se inocularon con esporas para las cepas de K. viridifaciens o con una alícuota congelada de un cultivo en forma de L de 1 a 2 días de edad en el caso de las cepas en forma de L. Las formas L se cultivaron en cultivo líquido durante 3 a 4 días para la transformación química y 7 días para todos los demás experimentos, a menos que se indique específicamente. Las formas L se ajustaron a 5–7,5 × 107 CFU ml−1 para ensayos de transformación (basado en OD600 de 3 para células de 3 y 7 días y 0,2 para células de 1 día), y 2,5–5 × 107 CFU ml−1 (OD600 de 2) para todos los demás experimentos con células de 7 días. Todos los cultivos de Kitasatospora se cultivaron a 30 °C.

Cuando sea necesario, antibióticos (100 µg ml−1 ampicilina, K029, Roth; 25 µg ml−1 cloranfenicol, C0113; Duchefa Biochemie; 5 µg ml−1 tiostrepton, 598226, Calbiochem; 50 µg ml−1 apramicina, A0164, Duchefa Biochemie ; 100 µg ml−1 de higromicina B, K547, Amresco, a excepción de 200 µg ml−1 de higromicina B para el medio LB) se añadieron al medio de cultivo. Se cultivaron cepas de Escherichia coli en medio LB sólido o líquido (mientras se agitaba a 250 rpm) a 37 °CE. Se utilizó coli JM10970 con fines de clonación y para obtener ADN plasmídico metilado, mientras que se utilizó E. coli ET12567/pUZ800271 para obtener metilación deficiente. ADN.

Todas las PCR se realizaron utilizando PFU o ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® (NEB). Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 6. Se utilizó GeneRuler DNA Ladder Mix (SM0334, Thermo Scientific) para confirmar el tamaño de las moléculas de ADN mediante electroforesis en gel. Para crear pFL-ssgB (Tabla complementaria 5), ​​se amplificó un casete de resistencia a la higromicina utilizando el par de cebadores Hyg_F-231_EEV y Hyg_R + 1237_HEV con pMS8272 como plantilla. Los productos de PCR se digirieron con EcoRV y se clonaron en pWHM3-oriT73 para generar pWHM3-oriT-hyg (Tabla complementaria 5). El flanco 3' de ssgB se digirió de pKR17 y se clonó en pWHM3-oriT-hyg usando XbaI y HindIII para generar el plásmido final. Todas las enzimas de restricción se solicitaron a New England Biolabs.

pRK1 (Tabla complementaria 5) se creó amplificando la región flanqueante aguas arriba de comEA mediante PCR con los cebadores FL1-comEA/comEC-FW y FL1-comEA/comEC-REV, introduciendo así sitios de restricción EcoRI y XbaI únicos, mientras que la región flanqueante aguas abajo de comEC, elaborado mediante síntesis de genes (Baseclear, Leiden, Países Bajos) estaba flanqueado por sitios XbaI y HindIII. Las regiones flanqueantes y el casete de apramicina se clonaron en pWHM3-oriT usando los sitios de restricción EcoRI, HindIII intercalados con un casete de resistencia a la apramicina que contenía sitios XbaI flanqueantes, creando así el plásmido final. El mutante por deleción comEA/comEC se creó en la cepa alfa7 en forma de L usando pRK1, que reemplazó los nucleótidos +58 en relación con el codón de inicio de comEA (BOQ63_029625) hasta + 2489 en relación con el codón de inicio de comEC (BOQ63_029630) con una resistencia a la apramicina. casete. Tenga en cuenta que la anotación del gen de Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (acceso CP023698) se usó para determinar los codones de inicio y finalización correctos putativos para comEC, lo que resultó en la ubicación del genoma 5.041.836 a 5.044.433 en CP090841.

Para crear pIJ82-GFP, la región que contiene el gen eGFP con un promotor gap1 se amplificó a partir de pGreen74 usando el par de cebadores gap1_FW_BglII y egfp_RV_EcoRI. El producto de PCR resultante se clonó en pIJ82 usando BglII y EcoRI para generar el plásmido final.

Para crear nuevas cepas en forma de L, se logró la transformación de alfa con ADN plasmídico mediante transformación química basada en polietilenglicol (PEG)10 como se describe a continuación. El ADN del plásmido se aisló de Escherichia coli ET12567/pUZ8002 para obtener ADN deficiente en metilación. Las cepas en forma de L alfa pIJ82-GFP y alfaΔdivIVA pIJ82-GFP se crearon mediante la transformación química de alfa y alfaΔdivIVA con pIJ82-GFP, respectivamente, seguido de selección con higromicina B (Tabla complementaria 4). Las cepas se verificaron mediante la detección de la producción de eGFP fluorescente mediante microscopía de fluorescencia. La cepa alfaΔcomEA/EC se obtuvo mediante transformación química de alfa con pRK1 seguida de selección para apramicina (Tabla complementaria 4). El crecimiento posterior en un medio no selectivo permitió la recombinación homóloga doble que condujo al reemplazo de la región comEA/EC por un casete de resistencia a la apramicina, lo que condujo a células resistentes a la apramicina sensibles a la tiostreptona. La cepa se verificó mediante PCR usando el par de cebadores ComEA_Apra_check_FW y ComEC_Apra_check_RV para confirmar el reemplazo de la región por el casete de apramicina. Para confirmar aún más la eliminación de esta región, se realizó una PCR utilizando pares de cebadores ComEC_Presence_Check_1_FW/RV y ComEC_Presence_Check_2_FW/RV, que amplifican partes de comEC solo si esta región genómica todavía está presente.

El ADN genómico se aisló de un cultivo de alfaΔssgB7 de 5 días de edad mediante extracción con fenol:cloroformo10. Brevemente, el sedimento celular se resuspendió en sacarosa al 10,3 % (p/v) que contenía ácido etilendiaminotetraacético 0,01 M (EDTA, 20296.291, VWR Chemicals BDH) pH = 8, luego de la lisis con dodecilsulfato de sodio al 10 % (p/v) (SDS , 20765.02, Servi). Se realizó la extracción con fenol:cloroformo (mezcla 1:1 de fenol, 10001173, Fisher BioReagentstm y cloroformo, 32211, Honeywell) y los ácidos nucleicos se precipitaron usando isopropanol (33539, Honeywell). El sedimento se disolvió en tampón Tris-EDTA (base Trizma®, RDD008, Sigma-Aldrich), seguido de tratamiento con RNasa A (EN0531, Thermo Fisher) y proteinasa K (19131, Qiagen). El ADNg se aisló mediante extracción con fenol:cloroformo y se precipitó con etanol absoluto (5250501, Biosolve) antes de volver a suspenderlo en agua libre de nucleasas. El gDNA fragmentado se obtuvo batiendo el gDNA intacto durante 12 min utilizando perlas de vidrio de 2 mm de diámetro en un Mikro-Dismembrator U (Sartorius) a 2000 rpm. Las concentraciones de ADN cromosómico se verificaron utilizando el kit de ensayo de ADNds de amplio rango Quant-IT™ (Q33130, Invitrogen).

La cepa DSM40239 de K. viridifaciens se inoculó a una densidad de 5 × 106 esporas ml-1 en medio líquido TSBS:YEME (1:1) con glicina al 0,5 % (p/v) (G0709, Duchefa Biochemie) y MgCl2 5 mM (M0533). , Duchefa Biochemie). El cultivo se hizo crecer durante 48 h mientras se agitaba a 200 rpm, después de lo cual se prepararon los protoplastos10. Se utilizaron cultivos de 72 h para K. viridifaciens pIJ82-GFP y K. viridifaciens pRed*. Las células se lavaron con sacarosa al 10,3 % (p/v) antes de realizar el tratamiento con lisozima mediante la adición de 10 mg ml-1 de lisozima de clara de huevo de gallina (~ 70 000 U mg-1, 62971, Sigma-Aldrich). Las células se incubaron durante 2-3 h a 100 rpm y 30 °C, después de lo cual los fragmentos de micelio se separaron de los protoplastos mediante filtración a través de un filtro de algodón. Las células se concentraron por centrifugación a 1000 xg si era necesario.

Las células S se aislaron de cultivos LPB por filtración7. En resumen, el cultivo se filtró a través de un filtro EcoCloth™ estéril (AMEC0003, Contec) y posteriormente se pasó a través de un filtro de membrana Isopore™ de 5 µm (TMTP01300, Merck). Las células se concentraron mediante centrifugación suave a 1000 xg durante 20 min, después de lo cual se eliminó el 90 % del sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió cuidadosamente en el líquido restante. Para probar una alta concentración de células S para la captación espontánea de ADN, se inoculó K. viridifaciens a 1 × 107 esporas ml−1 y la filtración solo se realizó a través del filtro EcoCloth™.

Los protoplastos, las células S, las formas L o las células miceliares recién preparadas se mantuvieron en hielo antes de la transformación. Para la transformación química, se mezclaron 50 µl de células con 1 µg de pRed*75, 150 ng de ADNg de la cepa alfaΔssgB, células lisadas con sal esterilizadas por filtración (35 ng de ADN de alfaΔssgB) o MilliQ. A continuación, se añadieron a las células 200 µl de PEG 1000 al 25 % (p/v) (14805-B, NBS Biologicals) en tampón P10, seguido de una mezcla suave y dilución de la suspensión en tampón P. Se sembraron diluciones seriadas en medio LPMA y después de 16 a 18 h de incubación, se realizó una superposición con 1 ml de tampón P que contenía antibióticos. Las unidades formadoras de colonias (UFC) se contaron después de 7 días para formas L y micelio o después de 14 días para células S y protoplastos. Los transformantes se verificaron por rayado en un medio selectivo y microscopía.

Las células recién preparadas se incubaron con 30 ng µl−1 de ADN no metilado (pRed* o pFL-ssgB como se indica) o MilliQ durante 18–24 h a 100 rpm, a menos que se indique lo contrario. Se usó una concentración final de 100 o 10 ng µl−1 de gDNA intacto y 10 ng ul−1 para gDNA aislado de alfaΔssgB en combinación con alfa de 1 y 7 días. Las diluciones se colocaron en placas en LPMA selectivo y no selectivo después de una cuidadosa resuspensión. Las células del micelio se diluyeron de manera similar en medio MYM. Las unidades formadoras de colonias se determinaron después de 7 días de incubación a 30 °C para formas L y micelio y hasta 14 días para protoplastos y células S. Los transformantes se verificaron por crecimiento en un medio selectivo y por PCR (usando los cebadores Tsr_Hyg_FW1 y Tsr_Hyg_RV1) o microscopía. Se prepararon células a partir de al menos cinco cultivos réplica para comparar las eficiencias de transformación entre cepas. La captación de ADN de las células S se analizó utilizando el filtrado obtenido a través del procedimiento estándar, así como un filtrado más concentrado que se obtuvo mediante la inoculación de 1 × 107 esporas ml−1 y la filtración del cultivo bacteriano a través del filtro EcoCloth™ únicamente. Se tomaron imágenes de las placas de colonia utilizando el escáner Epson Perfection V600 Photo con el software Epson Scan Utility v3.9.2.0.

Tres cultivos repetidos de formas L de 1, 3 y 7 días de edad o protoplastos recién preparados se sometieron a un ensayo de colorante de Laurdan como medida de la fluidez de la membrana23. Primero se centrifugó aproximadamente 1 ml de cada cultivo a 1000 xg durante 10 min para eliminar cualquier rastro del medio de cultivo. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón P y se ajustaron a una DO600 de 0,6. Se preparó una solución madre de Laurdan (6-dodecanoil-2-dimetilaminonaftaleno, D250, Invitrogen) 10 mM en dimetilformamida al 100 % (DMF, D4551, Sigma-Aldrich) y se almacenó a -20 °C en un tubo ámbar. A cada 1 ml de cultivo con DO ajustada, se añadió 1 µl de colorante Laurdan hasta una concentración final de 10 µM. Luego, los cultivos se incubaron en la oscuridad a 30 °C durante 10 min, mientras se agitaban a 100 rpm. Las células se lavaron tres veces con tampón P que contenía sulfóxido de dimetilo al 1% (DMSO, 41639, Sigma-Aldrich) para eliminar las moléculas de colorante no unidas antes de que las células se resuspendieran en tampón P. Aproximadamente 200 µl de este cultivo resuspendido se dividieron en alícuotas en una SensoPlate™ negra/con fondo de vidrio de 96 pocillos (655892, Greiner Bio-One). Se midieron tres réplicas técnicas por cultivo, así como una réplica por condición de cultivo sin colorante para medir la fluorescencia de fondo.

La excitación de la muestra se realizó a 350 nm seguida de la captura de la emisión de fluorescencia a 435 y 490 nm, determinada mediante un lector de microplacas multimodo Spark® (Tecan) con software Sparkcontrol V3.1. Después de restar la fluorescencia de fondo, se calculó el valor de polarización generalizada (GP) utilizando la ecuación. (1):

Los valores obtenidos después del cálculo se encuentran en el rango de −1 a +1, y los más cercanos a −1 indican una mayor fluidez.

La preparación de células para la cuantificación de la fluidez de la membrana por microscopía se realizó como sigue. Las células se lavaron y se ajustó la DO como se mencionó anteriormente. Se añadió colorante Laurdan (concentración madre 10 mM) a 100 µl de cultivo para obtener una concentración final de 100 µM. El cultivo se colocó a 30 °C durante 5 min, mientras se agitaba a 100 rpm en la oscuridad. Se añadieron aproximadamente 900 µl de tampón P precalentado que contenía DMSO al 1 % y se centrifugó el cultivo (1000 xg, 10 min) para eliminar cualquier molécula de colorante no unida. Finalmente, las células se resuspendieron en 100 µl de tampón P para análisis microscópico. Las células tratadas de manera similar pero sin colorante Laurdan se usaron como control para las mediciones microscópicas.

El ADN del plásmido marcado con fluorescencia se preparó utilizando el kit de etiquetado Mirus Label IT® Cy™5 (MIR 2725) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se almacenaron alícuotas de ADN marcado (100 ng µl−1) a −20 °C hasta su uso posterior.

Todos los lípidos (DLin-MC3-DMA76; Cholesterol, C8667, Sigma-Aldrich; Avanti Polar Lipids: DSPC, 850365, DMG-PEG2000, 880151, 18:1 Liss Rhod PE, 810150) se combinaron en una proporción molar de 50/38.3 /10/1.5/0.2 utilizando soluciones madre (100 µM–10 mM) en cloroformo:metanol (mezcla 1:1 de cloroformo, 22706, VWR Chemicals y metanol, 83638, VWR Chemicals). Los solventes orgánicos se evaporaron bajo una corriente de nitrógeno y el solvente restante se eliminó al vacío durante al menos 1 h. Posteriormente, la película lipídica se disolvió en EtOHabs (20821, VWR Chemicals) y se preparó un tampón de citrato 50 mM (pH = 4, MilliQ; usando ácido cítrico, C0759 y citrato de sodio tribásico deshidratado, C7254; Sigma-Aldrich). Cada solución se cargó en jeringas separadas y se conectó a un mezclador microfluídico de unión en T. Las soluciones se mezclaron en una relación de flujo de 3:1 de tampón de citrato contra lípidos (1,5 ml min-1 para tampón de citrato, 0,5 ml min-1 para soluciones de lípidos), dando una concentración total de lípidos de 1 mM. Después de mezclar, la solución se cargó directamente en un casete de diálisis MWCO 10k (Slide-A-Lyzer™, Thermo Scientific) y se dializó durante la noche frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x, que contenía NaCl 137 mM (NAC02, Formedium), 2,7 mM KCl (1.04936, VWR Chemicals), Na2HPO4 8 mM (1.06586, VWR Chemicals) y KH2PO4 2 mM (60229, Sigma-Aldrich), durante la noche. Las nanopartículas de lípidos (LNP-LR) están disponibles de los autores correspondientes a pedido razonable. Todas las incubaciones con LNP se realizaron con células resuspendidas en medio LPB, del cual el volumen final de solución de LNP fue del 25 %.

Las preparaciones de nanopartículas de lípidos se caracterizaron de la siguiente manera (Tabla complementaria 8). Las mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS) se realizaron en un Zetasizer Nano Series S (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). El láser HeNe incorporado funciona a una longitud de onda de 633 nm y utiliza un detector en un ángulo de 173° (tecnología de retrodispersión no invasiva). Las mediciones se registraron con un tiempo de equilibrio de 1 min en cubetas UV a 25 °C. Para la estimación del diámetro medio z (diámetro medio ponderado de la intensidad) y el índice de polidispersidad (PDI) (anchura relativa de la distribución del tamaño de las partículas), las muestras se prepararon diluyéndolas diez veces con PBS 1x. Para la estimación del potencial zeta, la muestra se diluyó con PBS 0,1x y se midió en un Zetasizer Nano Series SZ (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Todos los datos fueron por triplicado para obtener el valor medio.

La detección de la emisión de fluorescencia de los transformantes se realizó utilizando un Zeiss Axioscope A.1 equipado con una cámara digital a color Zeiss Axiocam 305, utilizando un juego de filtros 63 HE (Carl Zeiss, que consta de un filtro de excitación de paso de banda de 572/25 nm, un divisor de haz de 590 nm y un filtro de 629 nm). /filtro de emisión de paso de banda de 62 nm) para capturar la fluorescencia de mCherry. Se tomaron imágenes de colonias individuales utilizando un Zeiss SteREO Discovery v. 8 equipado con Schott VisiLED Ring Light S80-55 y Bresser MikroCam SP5.0. Se utilizó el software Bresser MikroCamLabII para capturar imágenes. Todas las demás microscopías se realizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM 900 con módulo Airyscan 2, cámara de control de temperatura y software Zeiss Zen 3.1 (edición azul, Carl Zeiss Microscopy GmbH) a menos que se especifique lo contrario. Todas las configuraciones de excitación y emisión para este microscopio se enumeran en la Tabla complementaria 7. Se obtuvieron imágenes multicanal (DIC y fluorescencia) y multipila a menos que se especifique lo contrario. Se tomaron imágenes de 10 μl de células en un portaobjetos de 8 cámaras (ibidi®) recubierto con poli-L-lisina al 0,1 % (p/v) (P8920, Sigma-Aldrich; se eliminó el exceso de poli-l-lisina y se dejó que el portaobjetos seque antes de aplicar la muestra). Para la obtención de imágenes de lapso de tiempo o la incubación durante la noche en la cámara de control de temperatura, se agregaron 400 μl de cultivo celular a un plato μ de imágenes de 35 mm (ibidi®) y se dejó reposar a 30 °C durante una hora antes de la obtención de imágenes durante la noche. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software Fiji (ImageJ)77.

El ADN cromosómico se visualizó después de una incubación de 30 min con SYTO 9 (S34854, Invitrogen) a una concentración final de 2 μM. Las membranas celulares se visualizaron mediante incubación con SynapseRed C2M (SynapseRed, PK-CA707-70028, PromoKine, PromoCell GmbH) a una concentración final de 40 μg ml−1. Después de la incubación durante la noche en un μ-Dish (ibidi®) usando la cámara de control de temperatura confocal Zeiss LSM 900, se tomaron imágenes de las células usando el modo Airyscan con procesamiento posterior a la imagen de súper resolución a través del software Zen. Los protoplastos y las células S se incubaron con SynapseRed hasta 72 h antes de obtener imágenes en un portaobjetos de vidrio. La cuantificación de las vesículas internas putativas se realizó después de incubar formas L de 7 días (alfa pRed*) o células S y protoplastos recién cosechados (K. viridifaciens pRed*) que producen mCherry citoplasmático con SynapseRed durante 0 o 72 h. SYTO 9 se añadió directamente antes de la obtención de imágenes para identificar el ADN. Las células se colocaron en un portaobjetos de ocho cámaras (ibidi®) recubierto con poli-l-lisina al 0,1 %. Se tomaron imágenes de formas L y células S de arriba a abajo con un tamaño de paso de 0,5 μm y protoplastos con un tamaño de paso de 0,28 μm para tener en cuenta su tamaño de celda más pequeño. Las células que tenían una o más regiones que carecían de tinción con mCherry, SYTO 9 o SynapseRed se contaron como una célula con una supuesta vesícula interna usando el complemento Cell Counter en Fiji (ImageJ).

La captación de ADN marcado con fluorescencia se evaluó incubando células con ADN plasmídico marcado con Cy5 (pFL-ssgB) a una concentración final de 1,25 μg ml−1 y se tomaron imágenes en un plato μ (ibidi®) después de 72 h.

Para capturar la formación de vesículas internas y la captación de Dextran-Texas Red (D-TR, D-3329, 3000 MW, neutral, Molecular Probes), se incubaron células de alfa pKR2 con una concentración final de 1 mg ml−1 D-TR en PBS y se tomaron imágenes durante la noche. Se realizaron imágenes de varias pilas en una distancia total de 6 μm con pasos de 1,5 μm con una imagen capturada cada 10 minutos. Se realizaron imágenes de la captación de D-TR en formas L, protoplastos o células S después de la incubación hasta 72 h. La cuantificación del porcentaje de células que habían captado D-TR se realizó como sigue. Las células que producen eGFP citoplasmática se incubaron con PBS o 1 mg ml-1 de D-TR por duplicado durante 72 h (alfa pIJ82-GFP de 7 días de edad o células S o protoplastos recién recolectados de K. viridifaciens pIJ82-GFP). Las células se diluyeron diez veces en medio LPB y se centrifugaron suavemente durante 10 min a 1000 xg, después de lo cual se reemplazó el sobrenadante por medio LPB. Las células se colocaron en un portaobjetos de ocho cámaras (ibidi®) recubierto con poli-l-lisina al 0,1 %. Las imágenes de la pila Z se adquirieron de arriba a abajo de las celdas con pasos de 0, 28 μm. Las células con captación putativa de D-TR se identificaron como aquellas que carecían de una región de eGFP citoplásmica (vesícula interna putativa), mientras que revelaban una mayor emisión de D-TR en esta región medida con la herramienta Plot Profile en Fiji (ImageJ). Las células con y sin captación se contaron utilizando el complemento Cell Counter en Fiji (ImageJ).

La absorción de LNP fluorescentes rojos (LNP-LR) por alfa se visualizó mediante imágenes después de la incubación durante la noche en un μ-Dish (ibidi®) o después de la incubación durante hasta 3 días antes de la imagen, como se indica. La inhibición de la captación de LNP se realizó mediante incubación en presencia de azida de sodio 1, 2,5 o 10 mM (S-8032, Sigma-Aldrich) o incubación a 4 °C, y las imágenes se obtuvieron a través del software Zen después de 0, 24, y 48 h. Para determinar la localización subcelular de LNP-LR en alfa pIJ82-GFP, se realizaron imágenes utilizando el modo Airyscan con procesamiento posterior a la imagen de superresolución y se analizaron utilizando la intensidad de píxel de los canales rojo (LNP-LR) y verde (eGFP). usando la herramienta Plot Profile en Fiji (ImageJ).

Para medir la fluidez de la membrana, las muestras se excitaron con un láser de 405 nm y se capturaron imágenes con emisiones de 430 y 500 nm. El valor de GP se calculó utilizando el complemento Calculate GP en Fiji78 para obtener un histograma de recuentos de píxeles en el rango de −1 a +1. Brevemente, la imagen se divide en canales individuales, seguido de la sustracción del fondo y la puesta a cero de los píxeles no significativos. Luego, a las imágenes se les asignan las letras A y B para calcular A − B y A + B usando la calculadora de imágenes. Finalmente, se muestra una relación de (A − B)/(A + B) como una imagen en la que los valores mínimos de píxeles se establecen en −1 (rojo) y los valores máximos de píxeles se establecen en +1 (azul). Usando la función de análisis de histograma, se obtiene una lista de valores y se usa para trazar las distribuciones de diferentes muestras.

Para capturar la rotura de vesículas, las formas L se resuspendieron en LPB fresco hasta una DO600 de 0,04. Las diluciones se colocaron en una SensoPlate negra/con fondo de vidrio de 96 pocillos y se centrifugaron suavemente durante 5 min a 1000 xg para asentar las células en el fondo de los pocillos. Se tomaron imágenes de las células usando un microscopio automatizado Lionheart FX (BioTek) con el software Gen 5 v.3.10 con un aumento de aire de 60x (campo claro y mCherry usando el cubo de filtro Texas Red 586/647). Las imágenes de la pila Z se capturaron cada 15 minutos con un tamaño de paso de 1 µm que cubre un total de 12 µm durante 20 h (Película complementaria 5) o un tamaño de paso de 0,5 µm que cubre un total de 5 µm durante 17,5 h (Películas complementarias 6, 7).

La cepa alfa pIJ82-GFP en forma de L de siete días de edad que expresaba eGFP citoplasmática se ajustó a una DO600 de 2 en medio fresco que contenía PBS al 25 % (v/v) y una concentración final de sacarosa al 17 % (p/v). Las células se incubaron durante 4 días, durante los cuales las células se asentaron en el fondo. Unos pocos microlitros del gránulo en forma de L resuspendido se intercalaron entre portadores HPF (congelación a alta presión) con un diámetro interno de 2 mm (cavidad de 0,1 mm o 0,05 mm, Art. 241 y Art. 390 respectivamente, Wohlwend) y hizo una cuadrícula etiquetada, buscador de lados planos TOP (Alu-platelet etiquetado, 0.3 mm, Art.1644 Wohlwend) para permitir una impresión de una matriz de buscador en el hielo amorfo79. El finderTOP se trató con l-α-fosfatidilcolina al 1 % (61755, Sigma-Aldrich) en etanol (1.00983.1000, Supelco) antes de la congelación. A continuación, las muestras se congelaron a alta presión (Live µ, CryoCapCell) y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta la obtención de imágenes.

Para mejorar la correlación entre la criomicroscopía lumínica y la crioelectrónica, las muestras congeladas se cargaron en un soporte criogénico universal (Art. 349559-8100-020, kit de accesorios criogénicos de Zeiss) utilizando la solución ZEISS Correlative Cryo Workflow, que encaja en el PrepDek® (PP3010Z, Quorum technologies, Laughton, Reino Unido). Aquí, los soportes HPF encajan en un soporte criogénico universal, que posteriormente se puede colocar en un adaptador específico para criomicroscopía de luz o crioelectrónica.

Se tomaron imágenes de las muestras congeladas con un adaptador de platina criogénica (CMS-196, Linkam Scientific Inc.) aplicado a un microscopio confocal vertical (LSM 900, Zeiss microscopy GmbH) equipado con un detector Airyscan 2. Se realizaron imágenes generales (Zeiss C Epiplan-Apochromat 5×/0.2 DIC) con microscopía de reflexión para visualizar el patrón cuadriculado en la superficie del hielo. A continuación, se tomaron imágenes Z-stack de resolución media (Zeiss C Epiplan-Apochromat 10×/0,4 DIC) con un láser de 488 nm (0,4 %) con un tamaño de vóxel de 0,15 µm × 0,15 µm × 1,18 µm. Usando esta resolución, se pudieron seleccionar las celdas de interés y se crearon imágenes Z-stack (Zeiss C Epiplan-Neofluar 100x/0.75 DIC) usando un láser de 488 nm (4%), con un tamaño de vóxel de 0.08 µm × 0.08 µm × 0.44 µm. Además, se tomaron imágenes de la superficie del hielo en todos los ROI con microscopía de reflexión con fines de correlación en el FIB-SEM.

Antes de las imágenes con crio-luz, se creó un proyecto Zeiss ZEN Connect (software Zeiss para microscopía correlativa, versión 3.1) para hacer una hoja de trabajo (lienzo) para alinear y superponer todas las imágenes y facilitar una mayor correlación con crio-FIB-SEM .

La muestra se recubrió con platino, corriente de 5 mA durante 30 s, usando el recubridor de etapa de preparación (PP3010, Quorum technologies, Laughton, Inglaterra) y se transfirió al Zeiss Crossbeam 550 FIB-SEM (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Oberkochen , Alemania) utilizando la cámara de preparación PP3010T (Quorum, Laughton, Inglaterra). A lo largo de la toma de imágenes, las muestras se mantuvieron a -140 °C y la presión de vacío del sistema fue de 1 × 10-6 mbar.

Después de insertar la muestra en la cámara FIB-SEM, se tomaron imágenes generales usando el SEM para alinear los datos con la imagen de reflexión LSM de la superficie del mismo proyecto ZEN Connect. Esta alineación permite el registro de etapas, lo que permite usar la señal de fluorescencia para navegar a diferentes regiones de interés. Después de la alineación inicial usando el SEM, se recopiló una imagen FIB de la superficie con la sonda de 30 kV a 10 pA con una inclinación de 54°.

Se talló una zanja gruesa para la observación SEM utilizando la sonda FIB de 30 kV a 30 nA. La deposición en frío se realizó con platino durante 30 s. La molienda fina de FIB en la sección transversal se realizó utilizando la sonda de 30 kV a 700 pA. Para el fresado de FIB en serie y las imágenes SEM, el ancho del corte (zanja) fue de 40 μm y para el fresado de FIB se utilizó la sonda de 30 kV a 300 pA, con un grosor de corte de 20 nm. Cuando se expuso una nueva superficie de corte mediante fresado FIB, se recopilaron simultáneamente imágenes secundarias InLens y EsB a un potencial de aceleración de 2,33 kV con una corriente de sonda de 250 pA. La cuadrícula de EsB se configuró en −928 V. El tamaño de la imagen se configuró en 2048 × 1536 píxeles. Para la reducción de ruido se usó el promedio de línea con un recuento de promedio de línea N = 46 a la velocidad de exploración 1. El tamaño de vóxel de todas las pilas fue de 5 nm3 × 5 nm3 × 20 nm3.

Las imágenes crio-FIB-SEM se procesaron con MATLAB (R2018b, Natick, Massachusetts: The MathWorks Inc.) para corregir defectos como cortinas, desalineación y carga local. Se utilizó el mismo software para la reducción de ruido y la mejora del contraste posteriores. Un resumen de cada paso de procesamiento es el siguiente:

La eliminación de las franjas verticales en las pilas se realizó siguiendo un enfoque de filtrado wavelet-FFT80. En resumen, la información de alta frecuencia correspondiente a las franjas verticales se condensó sucesivamente en un solo mapa de coeficientes utilizando la descomposición por la familia de coif wavelet. Posteriormente, se realizó una transformada de Fourier 2D para ajustar aún más la información de la franja en bandas estrechas. Finalmente, la información del estípite condensada se eliminó mediante la multiplicación con una función de amortiguamiento gaussiana y la imagen destripada se reconstruyó mediante la transformada wavelet inversa.

Los cortes consecutivos se alinearon usando correlación cruzada normalizada. Brevemente, la primera imagen de la pila se eligió como referencia y la segunda imagen se tradujo píxel por píxel a través de la referencia y se obtuvo una matriz de correlación cruzada normalizada utilizando la función normxcorr2. Luego se usó la ubicación del pico más alto en la matriz de correlación cruzada (que representa la mejor correlación) para calcular la traducción requerida para alinear las dos imágenes. Una vez que la imagen en movimiento se alineó con la imagen de referencia, sirvió como referencia para la alineación del corte posterior.

La eliminación del desequilibrio de carga local se logró mediante la sustracción de fondo gaussiana anisotrópica. Brevemente, la función imgaussfilt se usó para realizar un suavizado gaussiano 2D con un vector de desviación estándar de dos elementos. Los elementos del vector se eligieron de manera que aplicaran una gaussiana amplia y nítida en las direcciones horizontal y vertical, respectivamente. Posteriormente, la imagen corregida se obtuvo restando la imagen filtrada a la imagen original.

Para mejorar la relación señal-ruido, la reducción de ruido se realizó mediante filtrado de difusión anisotrópica81. Brevemente, utilizando la función imdiffuseest, se estimó el umbral de gradiente óptimo y el número de iteraciones necesarias para filtrar cada imagen. Posteriormente, se aplicó la función imdiffusefilt con los valores de parámetros óptimos estimados para eliminar el ruido de cada imagen.

Como paso final de procesamiento, se mejoró el contraste utilizando la ecualización de histograma adaptable limitada por el contraste82. Usando la función adapthisteq, el contraste se mejoró en dos pasos, usando una distribución uniforme y un límite de recorte bajo para evitar la amplificación excesiva de regiones homogéneas.

Se utilizó el software de análisis de imágenes y aprendizaje profundo DragonflyTM (versión 2021.1, Objects Research Systems, Montreal, QC, Canadá) para segmentar todos los datos de imágenes.

Secuencias de proteínas de Bacillus subtilis str. 168, Neisseria gonorrhoeae y la cepa P12 de Helicobacter pylori se obtuvieron de la base de datos o la literatura de UniProt y se proporcionan en Datos complementarios 1. Se ejecutó Protein BLAST para estas secuencias contra la base de datos de secuencias de codificación traducidas de la cepa DSM40239 de Streptomyces viridifaciens (también conocida como K. viridifaciens cepa DSM40239), con números de acceso de secuencia CP090840, CP090841 y CP090842, utilizando el software BLAST fuera de línea (v. 2.12.0). Se recolectaron aciertos con un valor E de 1 × 10−6 o inferior (Tabla complementaria 1).

Todas las estadísticas se indican y se realizaron con el software estadístico SPSS (IBM, versión 27.0), excepto la prueba z de dos proporciones, que se calculó manualmente. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Las suposiciones de prueba se determinaron usando los siguientes métodos. La homogeneidad de las varianzas se probó mediante la prueba de Levene. La normalidad se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov, la prueba de Shapiro-Wilk y las gráficas QQ cuando correspondía. Los gráficos se generaron con Graphpad Prism v. 9.0.0 o R versión 3.6.1, y otras imágenes gráficas se generaron con Adobe Illustrator v. 26.3.1 o a través de Biorender.com (consultado en agosto de 2022). Las desviaciones estándar se calcularon y trazaron a través de Graphpad Prism.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las secuencias de proteínas obtenidas de la base de datos UniProt o la literatura para realizar la búsqueda NCBI BLAST se proporcionan con números de acceso en Datos complementarios 1. Todas las micrografías de fluorescencia y FIB-SEM en este documento, incluidos los datos FIB-SEM sin procesar que subyacen a la representación del volumen de segmentación 3D ( Películas complementarias 3, 4), así como las micrografías utilizadas para la cuantificación de la captación de vesículas y D-TR en la Fig. 3f y las Tablas complementarias 2 y 3, se han depositado en la base de datos Open Science Framework (OSF) disponible en https:// doi.org/10.17605/OSF.IO/5WKGJ. Para la búsqueda de BlastP, se recopilaron resultados de la cepa DSM40239 de Streptomyces viridifaciens con los números de acceso CP090840, CP090841 y CP090842. Se usó Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (acceso CP023698 para deducir el supuesto codón de inicio y parada comEC de K. viridifaciens para la construcción de desactivación del gen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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RK y LZ cuentan con el apoyo del programa TARGETBIO de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), subvención nr. 15812. SS cuenta con el apoyo de la subvención Vici a DC de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), subvención nr. VI.C.192.002. Como parte del proyecto oLife de COFUND, DA reconoce la financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de subvención 847675. MdB, RR, DD y AA cuentan con el apoyo de una subvención de investigador avanzado del ERC (H2020-ERC-2017-ADV -788982-COLMIN). AA también cuenta con el apoyo del NWO (VI.Veni.192.094). Agradecemos a Nico Sommerdijk (Radboudumc, Centro de Microscopía Electrónica) por su contribución a la congelación a alta presión de las muestras. Agradecemos a Gerda Lamers y Joost Willemse por su amable donación de Dextrano-Texas Red.

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RK y SS llevaron a cabo los experimentos. LZ, SS y RK crearon los plásmidos y DA proporcionó las nanopartículas lipídicas. AA, MdB, RR y DD realizaron las imágenes y el análisis FIB-SEM. Todos los autores contribuyeron al diseño de los experimentos y la discusión de los resultados. RK, DC y AA escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Gilles P. van Wezel o Dennis Claessen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Ángel Manteca, Katarzyna Mickiewicz y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Recibido: 16 febrero 2022

Aceptado: 31 de agosto de 2022

Publicado: 22 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

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