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May 10, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3213 (2023) Citar este artículo

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Las células tumorales circulantes (CTC) son células cancerosas escasas que rara vez se propagan desde tumores primarios o metastásicos dentro del torrente sanguíneo del paciente. Determinar las características genéticas de estas células paranormales proporciona datos significativos para guiar la estadificación y el tratamiento del cáncer. El enfoque celular mediante chips de microfluidos se ha implementado como un método eficaz para enriquecer las CTC. Las distintas posiciones de equilibrio de partículas con diferentes diámetros a lo largo del ancho del microcanal en la simulación mostraron que era posible aislar y concentrar células de cáncer de mama (BCC) a partir de WBC con un número de Reynolds moderado. Por lo tanto, demostramos el aislamiento de alto rendimiento de BCC utilizando un método de microfluidos pasivo, basado en el tamaño y sin etiquetas basado en fuerzas hidrodinámicas mediante un dispositivo microfluídico en espiral no convencional (combinación de bucles largos y giro en U) para aislar tanto CTC como WBC con alta eficiencia. y pureza (más del 90 %) a un caudal de alrededor de 1,7 ml/min, que tiene un alto rendimiento en comparación con otros similares. Con este flujo dorado, hasta el 92 % de las CTC se separaron de la suspensión celular. Su tiempo de procesamiento rápido, simplicidad y capacidad potencial para recolectar CTC de grandes volúmenes de sangre del paciente permiten el uso práctico de este método en muchas aplicaciones.

El cáncer es reconocido como la segunda causa de muerte en el mundo. Se estima que la cantidad de muertes relacionadas con el cáncer alcanzará los 13 millones para 2030. La Organización Mundial de la Salud (OMS) cree que al menos el 30 por ciento de estas muertes se pueden prevenir si los pacientes son diagnosticados y tratados antes de que ocurra la metástasis del cáncer. Las metástasis del cáncer se producen después de que las células tumorales circulantes (CTC) se hayan propagado al torrente sanguíneo periférico desde sitios tumorales primarios o secundarios1. Es poco probable que los tumores primarios causen muertes, pero las células metastásicas finalmente representan el 90 por ciento de todas las muertes, mientras que el 0,01 por ciento conducen a la metástasis y la mayoría de las CTC mueren en el torrente sanguíneo2. Debido a una mutación, los tumores primarios pueden tener información genómica diferente en comparación con las CTC metastásicas. Los oncólogos compararon las CTC y los tumores primarios y encontraron que las CTC eran más informativas que los tumores primarios. Las CTC se descubrieron hace aproximadamente medio siglo, pero su importancia en la biología del cáncer se ha hecho evidente recientemente. Este retraso se atribuye principalmente a la dificultad para aislar las CTC (que ocurren a una tasa de ~ 1 a 100 en ~ 1000 a 5000 leucocitos en la sangre de los pacientes)3,4,5.

Existe una gran motivación para una técnica de aislamiento que permita una separación rápida y eficiente de los CTC6. Las estrategias diagnósticas comunes para los tumores primarios dependen del análisis de los síntomas clínicos y las técnicas de imagen. Estos métodos pueden usarse cuando el tumor ha alcanzado un tamaño definido, y no pueden usarse para detectar la existencia del tumor en sus etapas tempranas7,8. Debido a que las células cancerosas derivadas de tumores sólidos primarios son más grandes que las células sanguíneas, los investigadores han cambiado sus enfoques de tecnologías basadas en la afinidad a la separación basada en el tamaño. Debido a este cambio, pueden identificar más fácilmente a los pacientes con cáncer en las primeras etapas9. Los métodos de microfluidos se han destacado como herramientas eficientes y poderosas para el enfoque de células de alto rendimiento por tamaño10,11. Las separaciones microfluídicas se clasifican en dos categorías según el consumo de energía. Los métodos pasivos utilizan principalmente fuerzas hidrodinámicas, mientras que los métodos activos requieren fuerzas externas o un controlador para separar las células12. Los métodos activos brindan una separación más precisa pero tienen componentes costosos y complejos y menor rendimiento; se necesita más tiempo para que las fuerzas externas actúen sobre las partículas y superen las fuerzas hidrodinámicas13,14.

A diferencia de los métodos de microfluidos convencionales, donde la inercia es insignificante debido a un número de Reynolds muy bajo (Re ≪ 1), los microfluidos de inercia están en el rango de números de Reynolds moderados (1 < Re < 100). En este rango, la inercia y la viscosidad del fluido son finitas y producen efectos interesantes, que incluyen (i) migración inercial y (ii) flujo secundario15,16. La microfluídica inercial en patrones rectos, serpenteantes y especialmente en espiral es uno de los métodos más atractivos de separación basada en el tamaño. Debido a su alto rendimiento, simplicidad y menor costo, la microfluídica inercial es un candidato prometedor en una amplia gama de aplicaciones biomédicas17,18. Seo et al. realizó por primera vez la separación de partículas utilizando un microcanal en espiral en 2006. Luego, en 2008, Papautsky et al. utilizó este método para separar partículas de 1,9 um de partículas de 7,32 um19. En 2009, Dicarlo et al. demostraron que esta separación se debe al equilibrio entre las fuerzas de sustentación y arrastre en un microcanal espiral curvilíneo20. Desde 2010, se han realizado muchos esfuerzos para aumentar la eficiencia y el rendimiento de estos métodos utilizando plataformas simples y de bajo costo21,22.

En 2012, Sun et al. diseñó un microcanal en espiral con giro en S, al final de la primera fase. Si bien el microcanal tenía una alta eficiencia y pureza, tenía algunas desventajas, el problema más crítico era una tasa de separación baja, que era de aproximadamente 0,5 ml/min23. La tasa de separación para este tipo de microcanal en espiral se duplicó en los años siguientes. En 2017, Rossum et al. células aisladas con una eficacia del 88% y una pureza del 91% a un caudal superior a 1 ml/min24. En 2014, Karabacak et al. usó un microcanal de matriz serpentina para linealizar y separar los componentes sanguíneos25. En 2015, Sprenger et al. realizó un microcanal en espiral especial y separó células entre 2 y 18 µm, toda la gama de células sanguíneas, con un alto caudal y precisión26. En 2017, Sonmez et al. patrones serpenteantes y espirales creativamente integrados, y celdas separadas con alto rendimiento y eficiencia27. En 2018, Ding et al. diseñó un dispositivo que incluye dos canales en espiral y un canal serpenteante para aislar las células cancerosas circulantes28.

En 2017, Lin et al. diseñó un microchip en espiral con bucles largos, ángulos agudos y un patrón geométrico particular y logró separar todos los componentes de la sangre con una pureza y eficiencia superiores al 90%29. En 2019, Kosar et al. y zhang et al. creó chips de microfluidos que podían separar las células cancerosas con precisión al realizar cambios en las dimensiones, el radio de curvatura y el patrón de matriz serpentina. El valor del trabajo de estos grupos es la simplicidad y el bajo costo de sus chips, que son dos de los criterios importantes en la fabricación de chips microfluídicos2,30. En 2017, Kim et al. usó un canal recto con una sección transversal única para aislar las células31. En 2021, Warkiani et al. utilizó secciones transversales trapezoidales con varios patrones geométricos para la separación de celdas e introdujo una nueva sección transversal. En 2020, Bridle et al. investigó en detalle la deformación de las células en el microcanal espiral con la ayuda de métodos experimentales. En general, se han realizado muchos esfuerzos para aumentar la eficiencia y la velocidad de los experimentos32,33,34.

Este estudio tiene como objetivo indicar el rendimiento de un microcanal en espiral no convencional para la separación de células cancerosas con alta eficiencia y rendimiento. Para ello, se simularon e investigaron varios patrones; finalmente, mediante la combinación de los patrones de matriz en espiral y serpentina y el uso simultáneo de sus ventajas, se diseñó un patrón novedoso con un giro en U para aprovechar simultáneamente los beneficios de las fuerzas de inercia y los flujos secundarios para lograr una separación de celdas eficiente con un alto rendimiento. La relación de aspecto grande hace que la velocidad máxima se mueva más fácilmente, y tener una relación de curvatura alta facilita la manipulación del flujo secundario.

El microcanal se ha diseñado teniendo en cuenta todos los criterios, como la prevención de obstrucciones, la simplicidad de fabricación y prueba del chip, alta eficiencia y purificación, y alto rendimiento. En la siguiente etapa, se investigó el comportamiento de migración de partículas estándar y se demostró la capacidad de un chip diseñado para separar CTC en función de su tamaño y forma. Finalmente, se usaron cultivos mixtos de BCC y WBC como sistema modelo, y estas células se aislaron con éxito con una eficiencia de más del 92 % a una velocidad de flujo de oro de 1,7 ml/min, lo que está muy de acuerdo con la simulación y el experimento. resultados. Los resultados de las células cancerosas reales muestran una caída de alrededor del 2% al 3% en la eficiencia de separación en comparación con las partículas estándar rígidas, lo que está relacionado con el efecto de la fuerza elasto-inercial.

En un microcanal recto, las partículas experimentan tensiones de cizallamiento que generan fuerzas de arrastre y tensiones normales, creando fuerzas de elevación perpendiculares a la dirección del flujo35. En la microfluídica inercial, la separación de partículas depende del equilibrio entre las fuerzas de sustentación inercial y las fuerzas de arrastre36,37. En los fluidos newtonianos, cuando las partículas se liberan al azar en el microcanal con una sección transversal rectangular, las partículas siguen la simetría del sistema y se enfocan en dos posiciones de equilibrio en el medio de las paredes interna y externa38,39. Sin embargo, en aplicaciones comunes de microfluídica, en un fluido no newtoniano con un comportamiento viscoso y elástico, las partículas se deforman y migran hacia la línea central de los canales. Como se muestra en la Fig. 1, las partículas se enfocan en posiciones laterales específicas bajo la influencia de seis fuerzas principales en el flujo de Poiseuille40.

Fuerzas dominantes aplicadas a partículas dentro del microcanal en diferentes posiciones transversales y longitudinales. (A) Longitud del microcanal: las flechas verdes indican la fuerza de arrastre del fluido (Ff), que mueve las partículas a lo largo del microcanal. Las flechas azules indican la fuerza de elevación inducida por la pared (Fw), que empuja las partículas hacia el centro del microcanal. Las flechas marrones indican la fuerza de elevación del gradiente de corte (Fs) que empuja las partículas hacia la pared del microcanal. (B) Sección transversal del microcanal: las flechas naranjas indican la fuerza de elevación giratoria (Fr), que recoge partículas en el medio de las paredes del canal. Las flechas moradas indican la fuerza de arrastre de Dean (FD) que empuja las partículas desde la pared interna hacia la pared externa. Finalmente, las flechas rojas indican la fuerza de sustentación elasto-inercial (Fe) que empuja las partículas hacia la línea central del canal.

El primer componente, llamado fuerza de elevación del gradiente de corte (FS), se debe a la diferencia en la magnitud de la velocidad entre los elementos del fluido y crea la tasa de corte en cada región. Este gradiente de cizallamiento conduce las partículas a regiones con velocidades de cizallamiento más altas. Por lo tanto, las partículas cercanas a la mitad del microcanal son impulsadas hacia las paredes del canal41. Sin embargo, si las partículas se cierran cerca de la pared, interrumpen las líneas de corriente. Como resultado, la presión entre las partículas y las paredes de los microcanales aumenta42. El segundo componente, llamado fuerza de elevación inducida por la pared (FW), se debe a un gradiente de presión cerca de la pared del microcanal que se opone a la fuerza de elevación del gradiente de corte y empuja las partículas hacia el centro del canal. Las celdas flotantes migran a posiciones donde estas fuerzas de elevación de inercia están en equilibrio, donde el número de posiciones de equilibrio está relacionado con la sección transversal del canal42.

El tercer componente es una fuerza más pequeña llamada fuerza de sustentación rotacional (Fr). Esta fuerza se debe a la rotación de las partículas. Tan pronto como se identifican las ubicaciones de equilibrio de las partículas en un microcanal, la fuerza de sustentación rotacional domina y atrae gradualmente a las partículas hacia el punto central de las cuatro paredes del canal43,44. Cuando el diámetro de las partículas es pequeño en comparación con el diámetro hidráulico del microcanal (relación de confinamiento de partículas (λ = a/Dh, λ > 0,07)), Asmolov45 informa sobre la magnitud de la fuerza de elevación inercial neta (FL):

donde Rec y Rep (Rep = Rec λ2 > 1) son el número de Reynolds del microcanal y la partícula, respectivamente (se acepta que el enfoque inercial depende de parámetros adimensionales como λ, Rec y Rep). ρ es la densidad del fluido, μ es la viscosidad del fluido y CL (Rec, xc) es el coeficiente de sustentación de la fuerza de sustentación inercial neta que es una función indefinida de la posición normalizada de las partículas en la sección transversal del microcanal, y el número de Reynolds del canal. Este coeficiente se puede obtener a partir de simulación numérica o mediciones experimentales, pero en aplicaciones microfluídicas típicas, se puede suponer que su valor es 0,5. La fuerza de sustentación del gradiente de corte domina en las partículas cerca de la línea central del canal, mientras que más allá de ~ 2.0 DH desde el centro del microcanal, el signo del coeficiente de sustentación cambia, lo que indica la superioridad de la fuerza de sustentación inducida por la pared sobre el gradiente de corte fuerza de elevación20,36,43,46.

La introducción de curvatura en un microcanal recto crea un flujo secundario que empuja las partículas desde la pared interior hacia la pared exterior del microcanal debido a los efectos centrífugos. Este flujo secundario se invierte a través de áreas cercanas a las paredes superior e inferior del microcanal. Por lo tanto, se crean dos vórtices alternativos en un microcanal curvilíneo llamado vórtices de Dean. El flujo de Dean agrega una nueva fuerza sobre las partículas llamada fuerza de arrastre de Dean (FD) que puede ser útil para manipular las posiciones de enfoque de las partículas en el microcanal. El equilibrio entre FD y FL da como resultado un mecanismo de clasificación de partículas basado en el tamaño a través del microcanal. La velocidad de este flujo secundario se puede estimar de la siguiente manera, donde Um = 3/2 Uavg es la velocidad máxima del microcanal, a es el diámetro de la partícula, Dh es el diámetro hidráulico y r es la curvatura del canal47,48, 49,50,51.

Las fuerzas de sustentación fijan las partículas en posiciones de equilibrio, mientras que la fuerza de arrastre de Dean hace que las partículas migren alrededor de la sección transversal. Se puede estimar una nueva posición de equilibrio a partir de la relación entre FL y FD, donde δ es la relación de curvatura29. FD puede ser igual, mayor o menor que FL en función de varios parámetros, como el campo de velocidad y el patrón de microcanales. A caudales muy bajos, FD y FL son demasiado pequeños para el enfoque de partículas y las partículas permanecen dispersas en el canal. A tasas de flujo muy altas, FD domina, obligando a las partículas a seguir el flujo secundario Dean, que mezcla las partículas en lugar de enfocarlas. Por lo tanto, un rango dorado de caudal FL/FD = 1 forma solo una posición de equilibrio agudo36,42.

Para partículas más grandes cerca de las paredes superior e inferior del canal, la FD inversa está asociada con el gradiente de corte horizontal para empujar las partículas hacia la pared interna. Suponga que las partículas más grandes alcanzan el área cerca de la pared interior. En ese caso, ya no siguen los vórtices de Dean porque las partículas más grandes experimentan más FL, lo que las obliga a seguir una línea de corriente más cerca de la pared interna que las partículas más pequeñas. El FL los confronta y crea un equilibrio de fuerzas donde las partículas más grandes pueden enfocarse de manera efectiva. Sin embargo, como se muestra en la Fig. 2, FL es más débil para partículas más pequeñas y no puede competir con FD. Así, las partículas más pequeñas siguen el flujo secundario de Dean hasta llegar a la pared exterior. En esta región, debido a la posición de la partícula, las fuerzas son débiles y no pueden hacer circular partículas más pequeñas, creando una posición de enfoque para partículas más pequeñas. Esta diferencia en el comportamiento de enfoque de partículas grandes y pequeñas, que depende principalmente del campo de velocidad y la relación de curvatura, brinda la oportunidad de separar partículas. Por lo tanto, el flujo limpio ayuda a enfocar las partículas en solo una de las posiciones de equilibrio potencial en el intermedio FL/FD 2,19,36,42,52,53.

El efecto del flujo secundario en el aislamiento de celdas en un canal curvo, donde las partículas más grandes se acumulan cerca de la pared interna y las partículas más pequeñas cerca de la pared externa. En primer lugar, las fuerzas de sustentación actúan sobre las partículas y las partículas se acumulan en una posición de equilibrio en el centro de las paredes. Finalmente, las partículas más pequeñas migran hacia la pared exterior debido a la presencia de flujos secundarios transversales. Las flechas rojas indican la fuerza de sustentación y las flechas azules indican la fuerza de arrastre. La curvatura del canal hace que la velocidad máxima se transfiera a la mitad exterior del canal. Las partículas más grandes están sujetas a una fuerza de sustentación mayor, por lo que no pueden pasar a través de la mitad exterior, y las partículas grandes inicialmente en la mitad exterior son impulsadas hacia la pared interna tanto por fuerzas de sustentación como de arrastre. Por otro lado, la fuerza de sustentación vertical sobre las partículas pequeñas no es suficiente para enviar las partículas arriba y abajo del canal para seguir el flujo, permaneciendo así en la pared exterior.

Teniendo en cuenta la fuerza de arrastre del flujo (Ff) y la fuerza elasto-inercial (Fe), se deben considerar seis fuerzas para encontrar la posición final de las partículas en el microcanal curvilíneo. La fuerza elasto-inercial depende principalmente de los números de Reynolds (Re) y Weissenberg (Wi). La relación entre estos dos números adimensionales corresponde al número de elasticidad (El), que depende únicamente de las dimensiones del canal y de las propiedades del fluido40,54,55. Varios componentes de las células sanguíneas son deformables y se pueden aislar en microcanales curvilíneos en función de sus tamaños. Dado que FL es proporcional a la cuarta potencia del diámetro de la partícula, es más difícil que las células sanguíneas se concentren en los canales de microfluidos debido a su tamaño más pequeño en comparación con las CTC. Para mover las partículas más pequeñas a la posición de equilibrio, se necesitan fuerzas de mezcla más vitales para lograr un mejor enfoque de estas partículas2,56,57.

En este estudio, se han desarrollado una serie de estudios integrales utilizando λ, Re y De. Los resultados mostraron que a medida que el perfil de velocidad se vuelve más suave para los canales más anchos, la tasa de gradiente de corte disminuye en esta dirección y el arrastre de Dean domina las partículas en los canales más anchos. La adición de curvatura al microcanal cambia la dirección y la magnitud de las fuerzas de elevación del gradiente de cizalla simultáneamente a través de la redistribución del perfil de velocidad. Por lo tanto, una simple relación de fuerzas es insuficiente para diseñar el enfoque inercial y se requiere un diseño preciso de la curvatura46,58. La principal diferencia entre este diseño y los microcanales en espiral anteriores es el giro en U ubicado en la ruta del flujo16. Este giro tiene una curvatura más pronunciada que la curvatura más suave de los "bucles" en los canales en espiral convencionales; la combinación de bucles largos y giros bruscos aumenta el enfoque tanto de las células grandes (CTC) como de las células pequeñas (WBC), mientras que los microcanales en espiral convencionales tienen menos éxito en el enfoque de las células más pequeñas. Estas características, junto con un alto caudal y un diseño preciso de las curvas de los microcanales, aumentan el enfoque, lo que es claramente visible en los resultados de la simulación2,29,59.

En este estudio, se utilizó COMSOL Multiphysics 6.0 para analizar el campo de flujo en el microcanal y obtener perfiles de velocidad de sección transversal. El flujo se consideró monofásico e incompresible, y las ecuaciones de Navier-Stokes se resolvieron utilizando un módulo de flujo laminar. Para las condiciones de contorno, se supuso un caudal constante en la entrada del microcanal y se fijó una presión cero en la salida del microcanal. Además, se aplicaron condiciones antideslizantes y de rebote a las paredes. Se utilizó una malla extremadamente fina controlada por la física para construir el modelo 3D. La malla completa consta de unos 500 000 elementos de dominio con una calidad de malla aproximada de 0,9, y se seleccionó el solvente GMRES entre otros solucionadores predeterminados. Las fuerzas de sustentación y arrastre que actúan sobre las partículas se aplicaron mediante la codificación y el módulo de rastreo de partículas. Finalmente, se rastrearon las partículas hasta la salida en una coordenada curvilínea y se observó que los resultados simulados coincidían con la teoría y explicaban las tendencias.

La longitud total del microcanal es de 187 mm; esta longitud puede proporcionar el camino necesario para que las partículas pequeñas y grandes alcancen la distancia máxima entre sí en un estado de equilibrio. Un mayor alargamiento de la ruta puede aumentar la posibilidad de que se obstruyan los canales y se depositen partículas60. Su ancho es de 500 µm y su altura es de 180 µm, la relación de aspecto grande puede facilitar el cambio de la velocidad máxima en la sección transversal del microcanal y mejorar la capacidad de manipular las partículas61. El ancho del microcanal aumenta de 500 a 900 µm antes de que el flujo se desvíe a las salidas, y esta extensión facilita el diseño de las salidas y su visualización62. La curvatura afecta significativamente al enfoque, por lo que el patrón de microcanales se basa principalmente en esta función. El microcanal consta de 4 bucles y un giro en U para tener una curvatura adecuada para separar los BCC de los WBC y mejora el enfoque de las células más pequeñas29. Este chip microfluídico se fabrica mediante un método de litografía blanda con PDMS y un sustrato de vidrio63. El esquema del microcanal diseñado se muestra en la Fig. 3.

Patrón geométrico de microcanal con detalles completos y esquema de la configuración diseñada para experimentos experimentales.

El sistema linfático es una extensa red vascular que puede considerarse la forma principal de propagar las células de cáncer de mama metastásico (BCC). La dinámica por la cual los BCC viajan a sitios distantes en los ganglios linfáticos acaba de entenderse bien. Se utilizaron técnicas de seguimiento de partículas para analizar el comportamiento de BCC y partículas sólidas estándar de diferentes diámetros que se utilizaron para simular el flujo celular en la linfa. Las claras diferencias entre BCC y el comportamiento de las partículas indican que la morfología y el tamaño afectan su respuesta a las condiciones del flujo linfático64.

Los BCC se adhirieron entre sí y formaron partículas agregadas cuyo comportamiento fue irregular. A la velocidad del flujo linfático, las MCF-7 se distribuyeron uniformemente a lo largo del canal en comparación con las células MDA-MB-231 que se movieron en la región central, lo que indica que las células MDA-MB-231 metastásicas están sujetas a un rango más bajo de tensiones de cizallamiento en Vivo. Esto sugiere que se debe considerar el tamaño y la deformabilidad al modelar el comportamiento de BCC en los linfáticos. En este estudio se utilizaron las líneas celulares de mama humana MDA-MB-231 (11–22 μm), MCF-7 (11–19 μm) y leucocitos (6–16 μm)64,65. Dado que aproximadamente dos tercios de los glóbulos blancos se encuentran en el rango de 12 a 14 μm y aproximadamente un tercio de los glóbulos blancos se encuentran en el rango de 6 a 9 μm, se supone que el diámetro promedio es de aproximadamente 12 μm. En la tabla 1 se muestran las características de las células utilizadas en esta investigación; estas células se obtuvieron del Centro de Biotecnología de la Universidad Tarbiat Modares.

Para evaluar el rendimiento del sistema experimental, se seleccionaron para la prueba micropartículas polidispersas de 2–20 μm (con un diámetro promedio de 10 μm hechas de vidrio hueco). Estos tamaños de partículas se seleccionaron para que coincidieran con el tamaño celular observado en el sistema linfático in vivo. Por lo tanto, se utilizan partículas monodispersas (con diámetros de 5, 15,6 μm) para imitar el comportamiento de los BCC. Las partículas se mezclaron a una fracción de 0,08% en agua destilada, con 1 vol. % de tensioactivo Tween-20 (Sigma-Aldrich, Dublín, Irlanda) añadido a la solución para evitar la agregación de partículas. La viscosidad dinámica del agua destilada y la linfa es de 1 mPa·s y en el rango de 0,9–1,5 mPa·s, respectivamente, y las densidades del agua destilada y las partículas son de 1000 kg/m3 y en el rango de 1050–1090 kg/m3, respectivamente. Debido a la ligera diferencia entre ellos y el agua destilada, se agregó un porcentaje de glicerol a las soluciones de partículas66.

Para evitar el efecto de las partículas sobre el fluido u otras partículas (acoplamiento unidireccional), la interacción de las partículas en la suspensión preparada debe minimizarse para proporcionar una suspensión homogénea con la concentración adecuada, asumiendo que el tamaño y la distancia de las partículas son del mismo modo, la ubicación geométrica de las partículas en el fluido es en prismas triangulares cuyos lados son iguales a L. La concentración de partículas se consideró L/D = 15 para evitar interacciones partícula-partícula, donde D es el diámetro de la partícula y L es el camino libre medio molecular67.

Los BCC se suspendieron en PBS que contenía FBS al 3 % a una concentración de 1 000 000 de células por mililitro, y las líneas celulares se incubaron durante 20 min; el número final de células se ajustó a 150.000 células por ml resuspendiéndolas en PBS que contenía FBS al 3 % usando tripsina al 0,05 % y EDTA 1 mM. Las concentraciones de BCC se eligieron con fines de visualización y análisis de datos, principalmente más altas que los números reales informados en la literatura, que están en una escala de 1 a 100 CTC por mililitro de sangre42,60,64.

Las suspensiones de muestra se inyectaron en el microcanal utilizando una jeringa de plástico de 10 ml mediante una bomba de jeringa. Los experimentos se iniciaron con un caudal mínimo de 500 μL/min y continuaron hasta el último caudal de 2500 μL/min. Cada experimento se repitió tres veces para comprobar la reproducibilidad de las pruebas. Se utilizaron tubos TYGON (diámetro interior: 250 μm, longitud: 15 cm) y accesorios para conectar la punta de la jeringa al chip. Antes de inyectar las muestras, el microcanal se lavó con etanol al 70% y agua destilada para su aireación y esterilización. Después de eso, se bombeó PBS al microcanal para evitar la adhesión celular a las superficies del canal60,68.

Los experimentos se realizaron primero con partículas estándar y la optimización del caudal se realizó con varios caudales. El rendimiento de este chip de microfluidos para el enfoque celular puede expresarse contando células/partículas en cada experimento. En las muestras de células, la eficiencia de la separación de CTC es la relación entre la cantidad de CTC que salieron de la salida deseada y la cantidad total de células cancerosas que salieron de ambas salidas, este porcentaje es igual a la eficiencia general de la microfluídica. dispositivo. De manera similar, la purificación muestra qué porcentaje de todas las células que han salido de la salida deseada para las células cancerosas son células diana.

Las imágenes se realizaron tanto en línea como fuera de línea, se usaron imágenes en línea para rastrear las partículas y se usaron imágenes fuera de línea para contar partículas. Se realizó la toma de imágenes fuera de línea en la salida, de tal manera que las partículas que salían de cada salida se recogían en un recipiente aparte y luego se homogenizaba la suspensión y se tomaba como muestra un mililitro de ella. Usando un portaobjetos, se tomaron al azar cinco imágenes de la muestra y se contó el número de partículas usando el software ImageJ y también se calculó su diámetro promedio. Para una mejor interpretación de los datos, se eligió un umbral adecuado para cada imagen para que los desechos no afecten los resultados y no perdamos ninguna celda objetivo. La figura 3 muestra el esquema del montaje del experimento42,60.

Según los resultados de la simulación, la tasa de flujo del búfer es igual a 1150 μL/min y la tasa de flujo de la muestra es igual a 550 μL/min, lo cual es significativo en comparación con otros similares. Las pruebas que utilizan partículas estándar polidispersas (2–20 μm) y monodispersas (5, 15,6 μm) están muy de acuerdo con los resultados de la simulación; finalmente, el aislamiento de células reales (BCC y WBC) fue una confirmación del excelente rendimiento del chip y su pleno cumplimiento de la teoría, la simulación y las pruebas de partículas estándar.

Para simular lo más cerca posible de la práctica, se usaron partículas de 12 y 18 μm para imitar el comportamiento de WBC y BCC. Primero, se simuló la separación de las partículas en un microcanal recto. Luego se agregó Curvature gradualmente al canal y se observó que primero las partículas se movían hacia la pared interna. Luego, debido a la fuerza de arrastre decano, las partículas más pequeñas migran a la pared exterior. Finalmente, se formó una matriz de estas piezas curvas y se siguió el rastro de las partículas desde la entrada hasta la salida. Los resultados muestran que estos microcanales tienen baja eficiencia, purificación y tasas de flujo. Los resultados de la simulación se muestran en la Tabla 2 y la Fig. 4; cada uno se interpreta y analiza por separado.

Los resultados simulados en el software COMSOL; Al principio, las partículas se rastrearon en un microcanal recto, luego se agregó curvatura gradualmente al microcanal y se mostró que, debido al flujo depurador secundario, las partículas más pequeñas comenzaron a migrar hacia la pared exterior. Finalmente, se formó una matriz de estas piezas curvas. Las partículas rojas tienen 18 µm y las partículas azules tienen 12 µm de diámetro. Estas partículas imitan el comportamiento de WBC y CTC, respectivamente (COMSOL Multiphysics® versión 6.0 está disponible: https://www.comsol.com/release/6.0).

Posteriormente, la trayectoria de las partículas tuvo que aumentarse para completar la separación. Para este propósito, el canal continúa en forma de espiral y el radio de curvatura no cambia significativamente. Una curvatura aproximadamente constante puede ser tanto una ventaja como una desventaja. Como se mencionó anteriormente, si esta fuerza de arrastre supera un límite específico, hará que las partículas se mezclen, por otro lado, en espirales convencionales, la eficiencia no es muy alta. En microcanales serpenteantes, este problema se resuelve mediante curvaturas repentinas y arbitrarias. Las características de estos dos microcanales se pueden usar simultáneamente, y se puede diseñar un microcanal en espiral no convencional con una trayectoria de curvatura larga y casi constante con las curvaturas deseadas. Por lo tanto, los giros en forma de U, en forma de L y en forma de S se pueden incrustar en la trayectoria del movimiento de las partículas.

Para comprender mejor el comportamiento de las células en un microcanal en espiral, se simuló el enfoque de partículas en varios microcanales en espiral convencionales y no convencionales a diferentes velocidades de flujo (500–2500 μL/min). Se investigó el movimiento de partículas con tamaños de 20 μm, 18 μm, 15 μm, 12 y 5 μm, y se examinó el potencial de separación en estos microcanales. A través de estas simulaciones, se investigó el comportamiento de separación de MCF-7 (11–18 μm), MDA-MB-231 (11–22 μm) y WBC (6–16 μm).

Hay otros factores esenciales a considerar, por ejemplo, el tiempo requerido para realizar la prueba, la simplicidad de realizar y repetir la prueba y la posibilidad de hacer el chip con herramientas estándar. Por otro lado, cuando el camino es demasiado largo y el número de vueltas es más que unas pocas, aumenta la posibilidad de obstrucción del canal, deposición de partículas y formación de burbujas. En este diseño, el chip incluía una eficiencia significativa, una tasa de flujo impresionante, fácil fabricación y simplicidad de prueba al mismo tiempo. La Tabla 3 y la Fig. 5 resumen los resultados de la simulación. La posición de equilibrio de las celdas, que existen en dos piezas separadas en la salida, indica la presencia de dos vértices transversales, lo que confirma la teoría.

Los resultados de la simulación del software COMSOL, al principio, las partículas se rastrearon en un microcanal convencional a 0,9 ml/min, luego se agregó un giro en U a la forma de las partículas y mostró que, debido a la relación de curvatura más alta, las partículas más pequeñas migran completamente hacia el exterior. pared a 1,7 ml/min. La posición de equilibrio de las celdas, que existen en dos piezas separadas en la salida, indica la presencia de dos vértices transversales. Las partículas rojas tienen 18 µm y las partículas azules tienen 12 µm de diámetro. Estas partículas imitan el comportamiento de WBC y CTC respectivamente (COMSOL Multiphysics® versión 6.0 está disponible: https://www.comsol.com/release/6.0).

En microcanales curvilíneos con giros, los cambios repentinos en la relación de curvatura pueden cambiar la dirección y magnitud del flujo de Dean en lugar de ser constante. Antes de interpretar los resultados, es útil mencionar que se deben considerar tres factores esenciales para analizar mejor las fuerzas que actúan sobre las celdas: La dirección y magnitud de la fuerza de arrastre de Dean, que depende de la posición vertical de las celdas en el microcanal, y la cambio máximo de velocidad de flujo, que afecta la magnitud de la fuerza de elevación del gradiente de corte. Debido a que el perfil de velocidad en los microcanales rectos es parabólico, la velocidad máxima se ubica en el medio del microcanal. Agregar curvatura al patrón de microcanal provoca no solo la creación del FD, sino que también cambia la ubicación de la velocidad máxima, que depende de Re, la relación de curvatura y la sección transversal. La dirección y presencia de las fuerzas que actúan sobre las células dependen de la posición de la célula en el microcanal.

En la Fig. 6 se muestra una imagen de la viruta realizada por el método de litografía blanda y se simula el desplazamiento de velocidad máxima debido al giro en forma de U. Cuando las celdas más pequeñas están en la región 1, donde la velocidad máxima está en la mitad exterior del microcanal, estas celdas son empujadas hacia la pared exterior por la influencia de FD. El equilibrio de FL y FD da como resultado la formación de una línea celular concentrada cerca de la línea central del microcanal e inclinada hacia la pared exterior. Sin embargo, esta fuerza no puede empujar partículas más grandes porque la fuerza de sustentación domina en las partículas más grandes. Cuando las células llegan a la región 2, dado que la velocidad máxima está cerca de la línea central de la sección transversal, las partículas más pequeñas que estaban cerca de la pared exterior en la posición anterior comienzan a moverse hacia la pared interior tanto por FL como por FD. Cuando las células alcanzan la región 3, la velocidad máxima está en la línea central como un microcanal recto, y FD y FL mejorados empujan las partículas más pequeñas hacia la pared exterior (la pared interior se convierte en la pared exterior y viceversa).

desplazamiento de velocidad máxima debido a la alta relación de giro. (A) mostró el giro del microcanal que se realiza mediante litografía suave bajo el microscopio. (B) ilustra el campo de velocidad, así como el desplazamiento de velocidad máxima a lo largo del microcanal. (C) Esta gráfica muestra las líneas de corriente del campo de flujo dentro del microcanal, está claro que la compresión de estas líneas de corriente aumenta después del giro en U, y (D( indica que la velocidad máxima se ha desplazado de la pared exterior a la pared interior.

Cuando las partículas llegan a la región 4, las partículas pequeñas pueden moverse cerca de la pared exterior debido a la mejora de FD y FL. En esta región, la magnitud vertical y horizontal de FS aumentó de modo que las partículas más grandes que ya están en la pared exterior desde la posición anterior migran hacia la parte superior e inferior del canal. Debido a que la fuerza de sustentación está directamente relacionada con la cuarta potencia del diámetro. , Como se muestra en la Fig. 2, las partículas más grandes se acercan a la parte superior e inferior del microcanal y, después de eso, las partículas más grandes comienzan a migrar a la pared interna debido a la mejora de FD y FL. Cuando las células llegan a la región 5, las partículas más grandes aún migran hacia la pared interna y forman una línea de equilibrio cerca de la pared interna. Por otro lado, las partículas más pequeñas están en la línea de equilibrio cerca de la otra pared, por lo que la distancia entre las partículas más pequeñas y las más grandes aumenta significativamente.

A Re baja, las células más pequeñas primero se enfocan en una banda ancha cerca de la línea central debido a las fuerzas de arrastre de Dean y sustentación inercial relativamente pequeñas combinadas con la baja velocidad del flujo. El enfoque mejora ligeramente con un aumento en el Re o curvatura. A primera vista, este comportamiento de las celdas es inesperado sin una evaluación completa porque el FS y FD cambian con ap3 y ap, respectivamente. Un aumento en el caudal da como resultado un aumento tanto en FS como en FD. Sin embargo, FS aumenta más que FD en partículas más grandes que conducen a la migración. Este comportamiento de migración no se ve claramente en partículas más pequeñas, debido a su tamaño. Los componentes horizontal y vertical del FS que actúan sobre las partículas más pequeñas son más pequeñas que las partículas más grandes a la misma velocidad de flujo. La figura 6 muestra el desplazamiento de la velocidad máxima en cada una de las cinco regiones mencionadas.

En la simulación, según la teoría, se utilizaron 1000 glóbulos blancos y 10 células cancerosas para simular el proceso de aislamiento y la viabilidad de separar estas células lo más cerca posible de la realidad. En el experimento, para validar esta simulación, en primer lugar, se utilizaron partículas estándar con diámetros de 2 a 20 µm. Aunque la separación de este rango de las células no es el objetivo principal, y en esta investigación los glóbulos blancos y las células cancerosas se separan entre sí, este rango de diámetro de partículas incluye todas las células de la sangre. La separación de este rango también se investigó en la simulación, y cabe señalar que si el diámetro de las partículas es más cercano entre sí, será más difícil separarlas, por lo que separar partículas de 12 y 18 μm puede ser una buena opción. elección, considerando el diámetro promedio de los diferentes componentes de la sangre. Finalmente, se aislaron muestras de células reales y, a una velocidad de flujo de 1,7 ml/min, las células se aislaron con una eficiencia y pureza superiores al 90 %, lo que está muy de acuerdo con los resultados de la simulación.

Se probó una mezcla de micropartículas monodispersas (5 y 15,6 μm) y polidispersas (2–20 μm) para la validación y viabilidad de la separación. Las partículas permanecen dispersas en el microcanal hasta Q = 1 mL/min. A Q = 1,25 ml/min, las partículas comienzan a enfocarse aproximadamente en el microcanal. La línea de enfoque se vuelve más estrecha a 1,5 ml/min, de modo que casi todas las partículas se dirigen a la salida deseada. Luego, al aumentar la velocidad de flujo a Q = 1,7 ml/min, las partículas se enfocan con nitidez y casi todas salen por la salida deseada con una eficiencia de enfoque de aproximadamente el 94 %. A velocidades de flujo más altas, las partículas comienzan a mezclarse nuevamente, lo que provoca una disminución significativa en la eficiencia. La Tabla 4 muestra los detalles de las pruebas experimentales con partículas estándar.

Para velocidades de flujo entre Q = 1,4–1,7 ml/min, la eficiencia de separación fue superior al 80 %. Cuando el caudal aumentó de Q = 1,4 ml/min a 1,7 ml/min, la eficiencia de separación aumentó del 81 al 94 %. Un aumento excesivo en la tasa de flujo provocó una disminución significativa en la eficiencia, de modo que solo se observaron el 65 % de las partículas objetivo en la salida deseada a Q = 2 ml/min. La figura 7 muestra los resultados de las pruebas experimentales a caudales de 1,4, 1,55 y 1,7 ml/min. El comportamiento de las partículas varió sustancialmente con el caudal, como se muestra en la Fig. 8, para optimizar la separación, se usaron partículas de 12 y 18 μm para la simulación y partículas polidispersas para las pruebas experimentales.

El gráfico de barras para la separación de partículas da como resultado varios caudales.

Simulación y resultados experimentales para la separación de partículas a diferentes velocidades de flujo. Para encontrar la velocidad de flujo óptima, se aumenta la velocidad de flujo de 1 ml/min a 2 ml/min, se toman imágenes de las salidas y se analizan en cada etapa. (A) Los resultados experimentales para la separación de partículas, (A) y (B) ilustraron las salidas deseadas para partículas más pequeñas y más grandes, respectivamente, a 1,4 ml/min. (C–F) Mostró el mismo resultado a 1,55 ml/min y 1,7 respectivamente. El resultado de 1,7 ml/min fue mejor que otros caudales. (B) Indique las distribuciones de tamaño de las partículas estándar. (C) El flujo óptimo obtenido por simulación y métodos experimentales fue de aproximadamente 1,7 ml/min. A este caudal, más del 90 % de las partículas más pequeñas y más grandes se separan.

Para tener una mejor Comprensión, dado que el comportamiento de las partículas depende significativamente del tamaño, nuestra prioridad en el análisis de los resultados se basa en la proximidad del tamaño entre las células y las partículas. El tamaño de los glóbulos blancos está entre 6 y 16 μm, y su diámetro promedio es de 12 μm. La tendencia de enfoque de los glóbulos blancos es más similar a las partículas de 10 μm. Además, la distribución de tamaño de MCF-7 está entre 11 y 21 μm, y el diámetro promedio de las células MCF-7 es de 15 μm, que está más cerca de 15,6 μm en comparación con 20 μm, y el comportamiento de enfoque de MCF- 7 células es similar a las partículas de 15,6 μm. El diámetro medio de las células MDA-MB-231 es de 18 μm entre 15 y 20 μm; la tendencia de separación de esta celda es una combinación de las tendencias de las partículas de 15,6 y 20 μm.

La mayor eficiencia se produce en Q = 1,7 ml/min, lo que demuestra que las partículas estándar pueden imitar el comportamiento de las células. Se realizaron pruebas similares con células reales (mezcla de WBC y BCC) en función de la tasa de flujo de oro obtenida por el experimento y la simulación, y el rendimiento de la separación se cuantificó en función de los recuentos de células. Las muestras de sangre se procesaron con preprocesamiento y se lisaron antes de la inyección en el microchip para evitar la interferencia de RBC. La enumeración de BCC en estas muestras se consideró mucho más alta que las 2 células similares a CTC/mL que se encontraron en el torrente sanguíneo sano. Este experimento demostró que el chip diseñado es útil para aislar células cancerosas y que más del 90 por ciento de las células cancerosas se pueden aislar de las muestras de sangre de los pacientes con un alto rendimiento. Las Figuras 9, 10 y la Tabla 5 indican los resultados del rendimiento de separación de BCC y WBC. Cada experimento se repitió tres veces con una desviación estándar de 0,2, lo que indica que los experimentos tienen una buena reproducibilidad.

Resultados del experimento para la separación de células a un caudal dorado. (A) y (B) ilustran las muestras de fila de glóbulos blancos y cancerosos sin ningún procesamiento previo, respectivamente (C) ilustra la salida deseada para los glóbulos blancos (células más pequeñas) y (D) ilustra la salida deseada para las células cancerosas ( células más grandes) a 1,7 ml/min. En este caudal, más del 90 % de los CTC y WBC se separan y purifican.

La comparación entre células reales y partículas rígidas a varios caudales.

A diferencia de una partícula rígida, debido a la deformabilidad de las células, la fuerza de sustentación elasto-inercial actúa sobre las células, lo que puede provocar la migración lateral de las partículas. Así, la fuerza combinada sobre la celda es mayor que la que actúa sobre una esfera rígida del mismo volumen en el flujo de Poiseuille. Vale la pena señalar que el poder de enfoque también se incrementó significativamente sin ninguna pérdida considerable de viabilidad de CTC. La Figura 10 compara los resultados para partículas sólidas y celdas deformables, lo que muestra una ligera caída de alrededor del 2-3% en los resultados para celdas reales, la razón de esta reducción en la eficiencia está relacionada con las fuerzas de sustentación elasto-inerciales y la deformación de las celdas. celdas, lo que indica que la deformación de las celdas también debe ser considerada en la simulación.

Las trayectorias de partículas obtenidas de los videos procesados ​​de suspensión de alta concentración de partículas rígidas concordaban bien con los resultados de la simulación, como se muestra en la Fig. 11. Mientras que en la simulación, las bandas de enfoque eran más estrechas que el resultado experimental. El hecho de que las partículas sólidas no sean del todo esféricas es la razón de esta ligera diferencia en los resultados. Sin embargo, estos resultados también muestran que Q = 1,7 ml/min es el índice de flujo dorado para maximizar la eficiencia de separación, lo que concuerda bastante con los resultados de la simulación.

(A) y (B) muestran las salidas asociadas con partículas más grandes y más pequeñas, respectivamente. (C) Trayectoria en línea de muestras de células de alta concentración a un caudal dorado.

Debido a los avances recientes en la física de los microflujos, el movimiento de las micropartículas y las herramientas de caracterización genómica, el estudio de la heterogeneidad tumoral para comprender mejor la progresión tumoral y los tratamientos es más accesible que nunca mediante el uso del método NGS. Los expertos creen que estudiar la genética de las CTC aisladas de la sangre puede ser muy importante para diagnosticar y tratar la enfermedad. Este método se puede utilizar en futuros estudios clínicos utilizando la información genómica de las CTC aisladas mediante chips de microfluidos como biomarcadores para controlar el tratamiento de células cancerosas sólidas.

Para separar los componentes sanguíneos entre sí en un método verdaderamente libre de etiquetas, desarrollamos una estrategia que utiliza microfluidos inerciales que no solo utiliza el delicado equilibrio de las fuerzas de inercia y la fuerza de arrastre de Dean, sino que también combina un giro de alta curvatura para cambiar la dirección del fluido. líneas aerodinámicas El comportamiento de glóbulos blancos con un diámetro medio de 12, MDA-MB-231 y MCF-7 con un diámetro medio de 18 y 15, respectivamente, se observó en un microcanal en espiral con un giro en U en el camino de la partícula. movimiento en esta investigación.

Los resultados de la simulación demostraron que el enfoque de WBC y CTC puede ser posible a Q = 1,7 ml/min debido a las distancias máximas entre WBC y CTC. A esta velocidad de flujo dorado, se aislaron de la mezcla alrededor del 93 % y el 92 % de los CTC y los WBC, respectivamente. El desempeño del chip examinado indicó un acuerdo perfecto con los resultados de la simulación y los principios teóricos.

A diferencia de otros métodos de enfoque inercial, atravesar bucles internos a bucles externos mediante el empleo de un giro de alta relación de curvatura (giro en U) en un patrón en espiral mejora el comportamiento de enfoque tanto de los CTC como de los WBC, lo que da como resultado una alta pureza con un rendimiento significativamente alto.

En esta prueba, se realizó y mejoró una separación de partículas basada en el tamaño con un alto rendimiento de aproximadamente 1,7 ml/min, lo que proporciona una velocidad de flujo de aproximadamente el doble en comparación con otros microchips similares.

La comparación entre la posición de equilibrio de las células y las partículas estándar ilustró que el efecto de rigidez y elasticidad debe considerarse en futuras simulaciones.

Los avances recientes en microfluidos inerciales proporcionan una amplia gama de aplicaciones. Según los resultados de esta investigación, es posible separar las CTC del torrente sanguíneo del paciente utilizando un microcanal en espiral no convencional con un alto rendimiento. Sin embargo, se deben realizar más estudios para llevar este chip a las circunstancias clínicas.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo, otros conjuntos de datos adicionales utilizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad Tarbiat Modares, Teherán, Irán

Vahid Omrani y Mohammad Zabetian Targhi

Departamento de Ciencias Médicas, Universidad Tarbiat Modares, Teherán, Irán

Fatemeh Rahbarizadeh

Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial, Universidad de Monash, Melbourne, VIC, 3006, Australia

Reza Nosrati

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V. Omrani: Supervisión, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Curación de datos, Análisis formal, Redacción - borrador original. M. Zabetian: Recursos, Conceptualización, Obtención de fondos, Validación, Manuscrito de edición. F. Rahbarizadeh: administración del proyecto, edición del manuscrito. R. Nosrati: Conceptualización, Validación, Visualización, Edición del manuscrito.

Correspondencia a Mohammad Zabetian Targhi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Omrani, V., Targhi, MZ, Rahbarizadeh, F. et al. Aislamiento de alto rendimiento de células cancerosas en microcanales en espiral cambiando la dirección, la magnitud y la ubicación de la velocidad máxima. Informe científico 13, 3213 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30275-x

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Recibido: 10 Septiembre 2022

Aceptado: 20 febrero 2023

Publicado: 24 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30275-x

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