Susceptibilidad antimicrobiana del biofilm a través de una lente evolutiva experimental

Oct 13, 2023

npj Biofilms and Microbiomes volumen 8, Número de artículo: 82 (2022) Citar este artículo

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Los experimentos de evolución experimental en los que las poblaciones bacterianas se exponen repetidamente a un tratamiento antimicrobiano y el examen del genotipo y el fenotipo de las bacterias evolucionadas resultantes pueden ayudar a arrojar luz sobre los mecanismos detrás de la susceptibilidad reducida. En esta revisión, presentamos una descripción general de por qué es importante incluir biopelículas en la evolución experimental, qué enfoques están disponibles para estudiar la evolución experimental en biopelículas y qué nos ha enseñado la evolución experimental sobre la tolerancia y la resistencia en biopelículas. Finalmente, presentamos una opinión de consenso emergente sobre la susceptibilidad antimicrobiana del biofilm respaldada por datos obtenidos durante los estudios de evolución experimental.

La evolución experimental (Cuadro 1) es el estudio de los procesos evolutivos que ocurren en las poblaciones en respuesta a las condiciones impuestas y controladas por el experimentador1. Mientras que los primeros estudios de evolución experimental microbiana se remontan a la década de 18802, la evolución experimental fue introducida en la bacteriología en la década de 1950 por Francis J. Ryan3 y se hizo conocida gracias al experimento de evolución a largo plazo (LTEE) iniciado por Richard Lenski. en la década de 1980 y ha estado funcionando durante >75000 generaciones4,5. El LTEE y muchos otros experimentos de evolución experimental se llevan a cabo en ambientes no estructurados, es decir, en cultivo líquido con agitación, con la mayoría de las bacterias en estado planctónico. Sin embargo, ya en experimentos de evolución temprana en ambientes estructurados, se observaron marcadas diferencias en términos de evolución de aptitud (Cuadro 1) y variabilidad dentro de la población en comparación con lo que se observa típicamente en cultivos planctónicos6,7.

Las biopelículas son comunidades microbianas estructuradas que se adhieren a una superficie o se presentan como agregados suspendidos o incrustados8. Varios gradientes (oxígeno, nutrientes, agentes antimicrobianos,...) están presentes en las biopelículas, lo que da como resultado el desarrollo de nichos espacialmente estructurados con distintas condiciones ambientales9 y estos microambientes codeterminan el resultado de las infecciones relacionadas con la biopelícula, ya que impactan directamente en el crecimiento bacteriano. y metabolismo, así como sobre el efecto del tratamiento antimicrobiano10,11,12,13.

Recientemente se revisaron la evolución experimental en general14 y aspectos específicos de la evolución experimental en biopelículas15; remitimos a los lectores a estas revisiones para obtener más detalles. A continuación se presenta un breve resumen de por qué las poblaciones de biopelículas se vuelven más diversas durante la evolución.

Debido a su heterogeneidad, las biopelículas contienen múltiples nichos ecológicos, no todos los cuales son utilizados por los genotipos existentes; estos nichos no utilizados presentan oportunidades para nuevos genotipos16. Además, los genotipos novedosos pueden crear nichos adicionales al alterar el entorno circundante ("construcción de nichos")7,17. Debido a la heterogeneidad espacial, las poblaciones de biopelículas pueden considerarse colecciones de subpoblaciones que evolucionan independientemente y esta fragmentación de la población reduce el tamaño efectivo de la población. Como la contribución relativa de la deriva genética (Cuadro 1) hacia la diversidad es mayor en las subpoblaciones más pequeñas, la heterogeneidad espacial finalmente conduce a una mayor diversidad16,18. La fragmentación de la población también permite la fijación (Cuadro 1) de mutaciones beneficiosas con un efecto relativamente pequeño en subpoblaciones particulares. De hecho, las mutaciones beneficiosas que tienen un gran efecto son menos frecuentes que las mutaciones beneficiosas que tienen un efecto pequeño y es poco probable que las primeras aparezcan en todas las subpoblaciones; como consecuencia, se espera que ocurran y se mantengan diferentes mutaciones beneficiosas con un efecto pequeño en diferentes subpoblaciones separadas espacialmente, lo que conducirá a una mayor diversidad dentro de la población en su conjunto19. El trabajo experimental y el modelado recientes mostraron que en un entorno estructurado espacialmente, la propagación de una mutación beneficiosa se amplifica y es menos probable que se pierdan mutaciones beneficiosas20. La razón de esto es que en ambientes estructurados la selección puede aumentar la frecuencia de una mutación beneficiosa en una cierta subpoblación más rápido que la migración de esta mutación a otras subpoblaciones; como consecuencia, es probable que el mutante que alberga esta mutación beneficiosa pueda migrar repetidamente a nuevas subpoblaciones, lo que en última instancia reduce la probabilidad de pérdida de esta mutación debido a la deriva genética20. La competencia entre mutantes que albergan diferentes mutaciones beneficiosas (interferencia clonal, Recuadro 1) aumenta los tiempos de fijación (es decir, pasará más tiempo antes de que una mutación en particular supere a todas las demás) y la interferencia clonal es más frecuente en ambientes espacialmente estructurados (ya que las mutaciones beneficiosas muestran un cambio lento). , 'en forma de ola' se extendió por toda la población)21. Como consecuencia, múltiples mutaciones beneficiosas pueden coexistir en las biopelículas, nuevamente con una mayor diversidad como resultado22,23. La reciente observación de que la evolución in vitro de Pseudomonas aeruginosa en condiciones que son muy similares a las encontradas en el pulmón de pacientes con fibrosis quística (FQ) (es decir, en un medio de FQ sintético [SCFM]) conduce a un paralelismo más bajo (es decir, más diversidad ) que la evolución en un medio mínimo, confirma la importancia de la presencia de subpoblaciones espacialmente separadas para generar diversidad24,25. A diferencia del medio mínimo, SCFM contiene mucina, lo que permite la creación de subpoblaciones estructuradas espacialmente con tamaños de población efectivos más pequeños, lo que hace que sea menos probable encontrar las mismas mutaciones beneficiosas en poblaciones replicadas25.

Finalmente, en poblaciones homogéneas expuestas a un agente antimicrobiano, todas las mutaciones requeridas para la resistencia completa deben adquirirse al mismo tiempo para evitar la erradicación por las altas concentraciones uniformes del antibiótico. Sin embargo, la penetración de agentes antimicrobianos en la biopelícula puede verse obstaculizada, lo que da lugar a gradientes de concentración9,26,27,28,29 que pueden crear "santuarios", es decir, partes de la biopelícula en las que las concentraciones de agentes antimicrobianos son más bajas y que pueden actuar como 'peldaños' que permiten a las poblaciones adquirir mutaciones una a una30. Otros aspectos importantes a considerar son las mayores tasas de mutación que a menudo se observan en las células del biofilm, así como el aumento en la tasa de transferencia horizontal de genes (HGT) en los biofilms bacterianos (discutido con más detalle en el Cuadro 2). Cabe señalar que, dado que la mayoría de los estudios de evolución experimental se llevan a cabo con una sola especie (ver más abajo), la HGT generalmente no es un factor que impulse los cambios evolutivos en estos estudios.

Biopelícula: comunidades microbianas estructuradas (adheridas a una superficie, agregados suspendidos o agregados incrustados en tejido), que consisten en microorganismos incrustados en una matriz extracelular compuesta por polisacáridos, ADN extracelular y otros componentes8.

Interferencia clonal: la competencia que se produce en una población entre mutantes que albergan diferentes mutaciones beneficiosas15.

Evolución experimental: el estudio de los procesos evolutivos que ocurren en poblaciones establecidas por el experimentador, en respuesta a condiciones o tratamientos impuestos y controlados por el experimentador14,15.

Aptitud: la capacidad de producir más descendencia (y, por lo tanto, aumentar la frecuencia con el tiempo) que los competidores menos aptos, medida idealmente en un ensayo de competencia directa en el que se evalúa la contribución relativa de los competidores hacia la generación futura. La aptitud a menudo se evalúa indirectamente midiendo la tasa de crecimiento o la susceptibilidad14,15.

Fijación: situación en la que una variante particular de un gen (mutación) es la única que queda en la población (es decir, todas las demás son superadas)14,15.

Deriva genética: el cambio en la frecuencia de una variante particular de un gen (mutación) en una población debido al azar14,15.

Duración mínima para matar (MDK): tiempo mínimo requerido para matar a una fracción de la población; por ejemplo, MDK99 y MDK99.99 son los tiempos necesarios para matar el 99% y el 99,99% de las células de una población, respectivamente31,32.

Concentración inhibitoria mínima (MIC): concentración más baja de un antibiótico que previene el crecimiento de células planctónicas31,32.

Ventana de selección de mutantes (MSW): el rango de concentración en el que la aptitud de un mutante resistente es mayor que la del tipo salvaje79,91.

Persistencia: fenómeno en el que al menos dos subpoblaciones están presentes en una población, una compuesta por células que mueren rápidamente por el antibiótico y la otra compuesta por células tolerantes que sobreviven48. No hay diferencia en MIC y MDK99 entre cepas susceptibles y persistentes, pero el MDK99.99 para el último es sustancialmente más alto31,32.

Resistencia: las células resistentes a los antibióticos poseen uno o más mecanismos que les permiten crecer a concentraciones de antibiótico que evitarían el crecimiento de bacterias susceptibles. Los ejemplos incluyen captación reducida y mayor salida de antibióticos, modificación del objetivo e inactivación (enzimática) del antibiótico31,32,125.

Tolerancia: fenómeno a nivel de la población que permite que una población sobreviva a la exposición a un antibiótico (a niveles superiores a la CMI) sin la participación de un mecanismo de resistencia. Las células tolerantes a menudo no crecen o crecen lentamente y pueden volver a crecer después de que se elimina el antibiótico. No hay diferencia en la MIC entre una cepa tolerante y una susceptible, pero el MDK99 es sustancialmente más alto para una cepa tolerante que para una susceptible31,32,125.

La tasa de mutaciones puntuales en bacterias varía entre 10-10-10-9 por pb por replicación93,133, aunque las tasas de mutación pueden ser de 100 a 1000 veces más altas en hipermutadores (cepas con una frecuencia de mutación elevada debido a mutaciones en los genes de reparación de errores de apareamiento del ADN134, 135,136).

Se compararon las tasas de mutación entre cultivos planctónicos y biopelículas para varios organismos (incluidos Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis) y se encontró que eran sustancialmente (4 a >100 veces) más altas en biopelículas104,116,118,137.

Sin embargo, los gradientes químicos en las biopelículas dan lugar a una heterogeneidad fisiológica9, que también se refleja en marcadas diferencias en la expresión génica y las tasas de crecimiento, ya que las biopelículas suelen contener una fracción considerable de células que crecen lentamente y no se dividen138,139. Esto complica la comparación directa de las tasas de mutación (típicamente expresadas por pb por replicación) entre biopelículas heterogéneas y cultivos planctónicos bien mezclados114.

El aumento de las tasas de mutación podría estar relacionado con el estrés oxidativo, ya que en P. aeruginosa PAO1 cultivada en biopelícula, la expresión de genes que codifican enzimas que confieren protección contra el daño oxidativo del ADN se reguló a la baja, por ejemplo, la expresión de katA (que codifica la principal catalasa responsable de convertir peróxido de hidrógeno a oxígeno y agua) se reguló a la baja 7,7 veces137. En línea con esto, en otros estudios se encontró que la producción de peróxido de hidrógeno es importante para aumentar las tasas de mutación en estreptococos y estafilococos116,118.

La relevancia del estrés oxidativo está confirmada por las observaciones que vinculan las roturas de ADN de doble cadena provocadas por el estrés oxidativo endógeno y la subsiguiente reparación de estas roturas por mecanismos que introducen mutaciones, con la adaptación del biofilm117,122.

Las biopelículas también brindan una amplia oportunidad para la HGT, y sus tasas suelen ser más altas en las biopelículas que en los cultivos planctónicos140,141, aunque pueden verse afectadas por la separación espacial del donante y los receptores142, el tipo de plásmido143, la secuencia y la longitud del ADN específico. fragment144, y la arquitectura general del biofilm (incluida la presencia de exopolisacáridos en la matriz)145.

La resistencia a los antimicrobianos se cuantifica mediante la concentración inhibitoria mínima (MIC, Cuadro 1)31. La capacidad de los organismos resistentes para crecer a concentraciones superiores a la CIM de los organismos susceptibles está vinculada a la presencia de uno o más mecanismos de resistencia32 y las trayectorias evolutivas hacia un fenotipo resistente pueden ser complejas33. La evolución experimental en la que los cultivos se pasan en serie (en presencia de una concentración constante o que aumenta gradualmente de un antibiótico), combinada con la secuenciación del genoma completo (WGS) se puede utilizar para identificar la resistencia y las trayectorias hacia la resistencia34. Por ejemplo, los pases en serie de Escherichia coli en presencia de carbapenémicos permitieron la identificación de varios mecanismos de resistencia a carbapenémicos previamente desconocidos, incluidas mutaciones en mrdA (que codifica para PBP2) y ftsI (que codifica para PBP3), ambos objetivos de los carbapenémicos, así como mutaciones en acrB (que codifica la parte asociada a la membrana interna de la bomba de eflujo AcrAB-TolC)35. E. coli en evolución experimental en presencia de mutaciones inducidas por cloranfenicol en la región de unión al ADN de marR, que puede aumentar la regulación de la bomba de salida AcrAB-TolC, así como mutaciones en acrB y acrR (la interrupción de acrR conduce a la regulación positiva de acrAB)36. En Streptococcus pneumoniae, la evolución experimental en presencia de concentraciones crecientes de moxifloxacino y levofloxacino condujo a la identificación de nuevas mutaciones en gyrB, que en combinación con mutaciones en gyrA y parC conducen a un alto nivel de resistencia a las fluoroquinolonas37. En un estudio de evolución experimental con P. aeruginosa, tanto lo esperado (p. ej., mutaciones que conducen a la sobreproducción de AmpC después de la evolución en presencia de ceftazidima, mutaciones en oprD que conducen a la inactivación de la porina después de la evolución en presencia de meropenem) como lo novedoso (p. ej., Se identificaron mutaciones de ganancia de función que conducen a la modificación estructural de AmpC después de la evolución en presencia de ceftazidima, nuevas mutaciones en gyrA después de la evolución en presencia de ciprofloxacina) mecanismos de resistencia38. Cada vez hay más pruebas de que las adaptaciones metabólicas y la susceptibilidad antimicrobiana reducida van de la mano39,40, y varios estudios de evolución experimental con poblaciones planctónicas de E. coli lo han confirmado recientemente. Cuando E. coli se cultiva en un medio mínimo con glucosa (que favorece un crecimiento rápido con la respiración o la fermentación) o acetato (que favorece un crecimiento más lento solo con la respiración), la resistencia se desarrolla mucho más rápido con la glucosa, lo que confirma que las condiciones ambientales limitan la tasa de desarrollo de la resistencia41. La mayoría de los cambios observados involucran procesos metabólicos que no están directamente afectados por el tratamiento antibiótico. Por ejemplo, los cultivos que evolucionaron en presencia de glucosa y cloranfenicol consumen más glucosa, secretan más acetato y muestran una captación de oxígeno reducida en comparación con la E. coli de tipo salvaje y la E. coli adaptada solo en presencia de glucosa, lo que indica un cambio metabólico de la respiración a la fermentación. Este cambio está relacionado con la sobreexpresión de la bomba de salida AcrAB (requerida para la resistencia al cloranfenicol) y la remodelación del proteoma de la membrana, debido a la competencia por el espacio entre la bomba de salida y las proteínas involucradas en la fosforilación oxidativa41. La evidencia adicional del papel de los cambios metabólicos en el desarrollo de la resistencia a los antimicrobianos proviene de la evolución experimental de E. coli planctónica utilizando un protocolo de evolución experimental convencional y un "protocolo de evolución metabólica" diseñado para garantizar una dinámica de selección equivalente para todas las condiciones, mediante la exposición de bacterias a los antibióticos a diferentes temperaturas (es decir, en estados metabólicos cada vez más elevados)42. La evolución en los entornos convencionales conduce a poblaciones de crecimiento más lento con una CIM aumentada; las mutaciones que se encuentran con frecuencia en estas poblaciones se encuentran en genes vinculados a mecanismos de resistencia conocidos. Sin embargo, un subconjunto de clones adquiere mutaciones en otros genes, incluidos genes relacionados con el metabolismo central (ciclo TCA, transporte de electrones). Las poblaciones obtenidas al final del experimento de 'evolución metabólica' exhiben una mayor supervivencia en los ensayos de muerte en comparación con la cepa de tipo salvaje ancestral, sin reducción en la tasa de crecimiento exponencial ni aumento en el tiempo de retraso (descartando la tolerancia [Cuadro 1] debido al crecimiento lento) . La ingeniería de mutantes en seis genes metabólicos confirmó aún más la relevancia de estas mutaciones, ya que en todos los mutantes se incrementó la MIC para al menos un antibiótico. El mecanismo por el cual estas mutaciones proporcionan resistencia varía, pero para al menos uno de ellos (sucA, que codifica la enzima del ciclo TCA 2-oxoglutarato descarboxilasa) la mutación proporciona resistencia al disminuir la respiración basal y, por lo tanto, prevenir la inducción de la actividad del ciclo TCA mediada por antibióticos. un mecanismo previamente observado en diferentes organismos43,44,45. El 39 % de las mutaciones de la secuencia codificante identificadas en estos experimentos de evolución también se pueden encontrar en genomas secuenciados de E. coli; además, varias mutaciones en genes metabólicos están abundantemente presentes en estos genomas y algunas están estadísticamente enriquecidas en aislados clínicos de E. coli, lo que sugiere que son relevantes in vivo42.

La susceptibilidad reducida a los antibióticos no solo se debe a la resistencia, sino que también la tolerancia y la persistencia (Cuadro 1) juegan un papel importante31,32,46,47,48. Las células tolerantes sobreviven a la exposición a los antibióticos sin tener mecanismos de resistencia convencionales y reanudarán su crecimiento después de la eliminación del antibiótico32. Los factores que conducen a la tolerancia pueden ser genéticos (p. ej., mutaciones que provocan un mayor tiempo de retraso49,50) o ambientales (p. ej., producción de una matriz de biopelícula protectora51,52, crecimiento lento debido a condiciones microambientales53,54). Tanto la tolerancia como la persistencia pueden cuantificarse por la duración mínima de la matanza (MDK, Cuadro 1); además, la persistencia se caracteriza típicamente por la presencia de una curva de destrucción bifásica31,32. La exposición cíclica de cultivos de E. coli planctónicos a la ampicilina condujo a un aumento de la MDK y este aumento se debió a un tiempo de retraso prolongado de una sola célula; no se observaron cambios en la CIM, descartándose resistencia49. Cuando las poblaciones planctónicas de varios patógenos ESKAPE se ciclaron entre la exposición a aminoglucósidos y el rebrote, se observó un aumento de 37 a 213 veces en el número de células persistentes tras el tratamiento de clones evolucionados en comparación con el cultivo inicial, nuevamente sin un aumento en MIC55. WGS de clones evolucionados de alta persistencia mostró que este fenotipo podría atribuirse a una sola mutación en oppB, gadC o nuoN, genes que no estaban previamente implicados en la persistencia56.

La evolución experimental ha demostrado que el desarrollo de la tolerancia y la persistencia pueden ser 'peldaños' hacia el desarrollo de la resistencia. Cuando se desarrollaron cultivos de E. coli planctónicos en presencia de ampicilina, las mutaciones en la región promotora de ampC, que codifica una β-lactamasa, aumentaron la MIC después de 7–17 ciclos, mientras que ya se observó un retraso en el crecimiento después de 3–4 ciclos, es decir , el desarrollo de la tolerancia precedió al de la resistencia57. La WGS de los primeros clones resistentes mostró que todos portaban mutaciones adicionales, algunas de las cuales se habían identificado previamente como un aumento de la tolerancia al aumentar el tiempo de retraso49; la secuenciación adicional reveló que las mismas mutaciones de tolerancia habían estado presentes antes de la aparición de las mutaciones de resistencia a ampC. Como las mutaciones en varios genes pueden conducir a la tolerancia, el tamaño del objetivo para las mutaciones que conducen a la tolerancia es mayor que el de la resistencia (siendo ampC el único objetivo); como consecuencia, las mutaciones de tolerancia ocurren con mayor frecuencia y pueden detectarse antes. Comenzar experimentos de evolución a partir de cepas de tipo salvaje y de cepas que ya habían desarrollado tolerancia demostró que las mutaciones de resistencia se establecieron más rápido en clones tolerantes. sólo dan como resultado una resistencia parcial). Como resultado, las mutaciones de tolerancia comienzan a dominar la población después de algunos ciclos y la presencia de estas mutaciones reduce la probabilidad de pérdida de mutaciones de resistencia durante el tratamiento con antibióticos57. Se hicieron observaciones similares para P. aeruginosa: tras la exposición secuencial, P. aeruginosa se adapta rápidamente a altas concentraciones de tobramicina con un aumento gradual en la tasa de supervivencia y después de 7-8 ciclos, todos los linajes evolucionados alcanzaron CIM sustancialmente más altas que la cepa ancestral58. WGS mostró que los alelos ocurrieron y alcanzaron la fijación en un orden específico, con mutaciones en genes involucrados en la respiración y el metabolismo energético (que conducen a la tolerancia) que generalmente preceden a la adquisición de mutaciones de resistencia y exponen periódicamente a P. aeruginosa de tipo salvaje y mutantes con varios niveles. de tolerancia, a la tobramicina confirmó que las tasas de adquisición de resistencia fueron similares en todos los grupos, pero que los linajes tolerantes tenían más probabilidades de sobrevivir a la selección inicial. Esto sugiere que las poblaciones bacterianas con alta tolerancia tienen más posibilidades de desarrollar resistencia que las poblaciones con poca o ninguna tolerancia58. Finalmente, varios estudios han señalado un vínculo entre la persistencia y la probabilidad de desarrollar resistencia, por ejemplo, en Mycobacterium tuberculosis59, Pseudomonas spp.60 y E. coli61.

Para obtener una descripción detallada de los métodos de biopelícula disponibles, nos remitimos a revisiones recientes62,63,64,65. Es importante destacar que, si bien la configuración general en la mayoría de los experimentos de evolución es similar (con ciclos repetitivos de crecimiento, tratamiento y transferencia a un nuevo entorno) (Fig. 1a), el modelo utilizado puede afectar profundamente el resultado del experimento y no todos en El modelo in vitro imitará la evolución in vivo, por ejemplo, muchos modelos utilizan superficies y medios de crecimiento que reflejan poco las condiciones in vivo15.

una descripción esquemática de la configuración general de los experimentos de evolución experimental que involucran el tratamiento antimicrobiano de biopelículas. b P. aeruginosa forma fácilmente agregados en SCFM2, lo que lo convierte en un medio de crecimiento adecuado para estudiar la evolución en un microambiente relevante. c Con base en el análisis de la secuencia del genoma completo (las mutaciones que ocurren en P. aeruginosa PAO1 después de la exposición repetida a furanona C-30 se muestran como ejemplo89), se puede calcular la frecuencia de las mutaciones y el efecto de las mutaciones en la función de la proteína (fusA1 se muestra como ejemplo89) estimado. d La caracterización fenotípica generalmente comienza con la determinación de la susceptibilidad a los antimicrobianos (ilustrada aquí con la difusión en disco) y el número de CFU (el número de CFU en tres poblaciones de B. cenocepacia replicadas después de ciclos repetidos de exposición a tobramicina se muestra como ejemplo70). La evolución experimental en biopelículas conduce con frecuencia a la aparición de variantes de colonias pequeñas (SCV) (P. aeruginosa AA2 se muestra como ejemplo, imagen cortesía del Dr. A. Sass). Finalmente, los cambios en el metabolismo ocurren durante la evolución y pueden medirse usando, por ejemplo, microcalorimetría; la actividad metabólica después del tratamiento de WT P. aeruginosa PAO1 (izquierda) o la misma cepa desarrollada en presencia de tobramicina (derecha) se muestra como ejemplo.

En sistemas estáticos, las biopelículas se cultivarán y tratarán y, posteriormente, se recolectarán células para iniciar un nuevo ciclo. En los sistemas dinámicos, una biopelícula crece y se trata continuamente, sin que se interrumpa.

Las biopelículas formadas en perlas de plástico o vidrio se utilizan con frecuencia para estudiar la evolución17,66,67,68,69,70,71,72. El modelo de cuentas se desarrolló originalmente para la selección para la adherencia diaria y la dispersión de una cuenta por Burkholderia cenocepacia22. En esta configuración, se incuba una perla junto con bacterias que se unirán a la perla para formar una biopelícula. A continuación, la perla que contiene la biopelícula se transfiere a otro tubo receptor que contiene una nueva perla vacía y un medio nuevo, lo que permitirá la colonización de la nueva perla sin perturbar la biopelícula. También se han desarrollado variantes de este modelo más adaptadas al estudio de las respuestas al tratamiento antimicrobiano70,73. A pesar de que solo permite estudiar biopelículas adheridas a la superficie, la facilidad de uso y la compatibilidad con diferentes organismos y medios de crecimiento hacen de este un modelo atractivo.

Se pueden formar biopelículas de colonias en filtros de membrana que se inoculan con el organismo de prueba y luego se colocan en un medio de crecimiento adecuado74,75. Los nutrientes se difundirán a través de la membrana y las bacterias formarán una biopelícula en la membrana del filtro. Durante el experimento, el filtro se puede mover a otra placa de agar y, de esta manera, las biopelículas se pueden exponer fácilmente a los agentes antimicrobianos. Al final de un ciclo, las células bacterianas se separan de la membrana y la suspensión resultante se puede usar para inocular una nueva membrana de filtro.

El dispositivo de biopelícula de Calgary consiste en una placa de 96 pozos y una tapa con clavijas, cada una sumergida en un pozo y apoya la formación de biopelícula; este dispositivo fue desarrollado originalmente para determinar la concentración mínima de erradicación del biofilm76. Durante la evolución experimental, la tapa con clavijas se puede transferir fácilmente a una nueva placa de 96 pocillos y las biopelículas se pueden dispersar de las clavijas mediante sonicación. Las suspensiones de células resultantes se pueden utilizar para iniciar la formación de biopelículas en las clavijas de una tapa nueva77. Recientemente se desarrolló y utilizó un sistema conceptualmente similar (FlexiPeg) para estudiar la competencia y la aptitud en biopelículas78,79.

En los sistemas de modelos dinámicos, las biopelículas se cultivan en una superficie mientras que los nutrientes y los productos de desecho se agregan y eliminan continuamente, respectivamente. Si bien es técnicamente más exigente, una ventaja de estos sistemas es que la biopelícula no tiene que dispersarse entre diferentes ciclos de tratamiento. Los ejemplos incluyen celdas de flujo acrílicas con una superficie de vidrio80, biorreactores Sartorius81,82,83 y varios dispositivos microfluídicos84,85,86.

Si bien muchos estudios utilizan medios de cultivo estándar (p. ej., caldo LB), es posible imitar más de cerca el entorno in vivo mediante el uso de medios similares a in vivo validados. Esto incluye varios medios artificiales de esputo de FQ87 en los que se forman rápidamente agregados de biopelículas bacterianas suspendidas (Fig. 1b) y que se utilizaron para estudiar el desarrollo de resistencia a la ciprofloxacina88 así como la resistencia a la combinación tobramicina/furanona C-3089 en biopelículas de P. aeruginosa.

La elección de la presión selectiva apropiada es una decisión importante en los experimentos de evolución y puede afectar profundamente el resultado del experimento.

Cuando se estudian los mecanismos de adaptación, la concentración de antibiótico debe ser lo suficientemente alta para tener un efecto sobre las bacterias, pero no demasiado alta para permitir la supervivencia de un número suficiente de bacterias para iniciar un siguiente ciclo del experimento. No hay información sobre qué rango de concentración constituye la ventana de selección de mutantes (MSW, cuadro 1) para las biopelículas y es probable que varios aspectos de la biología de las biopelículas afecten esta ventana90,91. Si bien se ha predicho que el crecimiento de biopelículas conduce a cambios y distorsiones del MSW91, un trabajo reciente con E. coli mostró que los valores mínimos de concentración selectiva (para cinco antibióticos diferentes) no diferían entre cultivos planctónicos y biopelículas79. Debido a la incertidumbre con respecto a los RSU del biofilm, las concentraciones de antibióticos a menudo se seleccionan en función de la MIC70 o de la concentración inhibidora mínima del biofilm74. Una estrategia alternativa es usar concentraciones antimicrobianas que se puedan alcanzar in vivo, por ejemplo, en el esputo de pacientes con FQ después de la terapia de inhalación75. La fuerza de selección puede influir profundamente en las trayectorias evolutivas, por ejemplo, las concentraciones subletales de tigeciclina seleccionan mutantes de P. aeruginosa con CIM de tigeciclina más bajas y CIM más altas para otros antibióticos que los mutantes seleccionados en concentraciones letales92. En general, la evolución in vitro en presencia de una presión selectiva leve conduce a una población más diversa, mientras que la exposición a una presión selectiva alta elimina bacterias con susceptibilidad intermedia, y solo resultará en la detección de aquellas mutaciones que tengan el efecto más fuerte93. La concentración de un antibiótico en el sitio de la infección depende del modo de administración, y aunque se pueden lograr altas concentraciones con la terapia de inhalación o la aplicación tópica, la concentración del antibiótico en el sitio de la infección a menudo será sustancialmente menor cuando los antibióticos se administran sistémicamente94,95 . Además, las biopelículas se pueden considerar como microcompartimentos farmacológicos independientes96,97 y las limitaciones de difusión a menudo conducen a la formación de gradientes de concentraciones de antibióticos en una biopelícula26,27,28,29,98.

Las trayectorias evolutivas diferirán entre los antibióticos pertenecientes a diferentes clases, por ejemplo, cuando P. aeruginosa evolucionó en presencia de concentraciones subletales de tobramicina o tigeciclina, los mutantes se seleccionaron solo en concentraciones subletales de tigeciclina92. Si bien estas trayectorias dependerán del modo de acción de los agentes antimicrobianos, las diferentes clases de antibióticos bactericidas también tienen aspectos comunes, entre ellos que en su mayoría inhiben la biosíntesis de macromoléculas (ADN, proteínas, peptidoglicano) e inducen cambios en el metabolismo que promueven la formación de especies reactivas de oxígeno99,100. Además, la actividad de algunos antibióticos depende en gran medida del metabolismo microbiano, mientras que otros antibióticos solo dependen débilmente del metabolismo para su actividad letal101; rápidamente se desarrollará tolerancia hacia el primer grupo de antibióticos, pero no hacia el segundo102.

Finalmente, el régimen de tratamiento puede influir en la trayectoria evolutiva que se sigue. La concentración del agente antimicrobiano se puede mantener constante durante el curso del experimento de evolución70,75 o las bacterias se pueden exponer a concentraciones antimicrobianas que aumentan gradualmente82,85, y la exposición puede ser continua69,74,75,82,85 o intermitente70,77,103,104. El nuevo crecimiento de la biopelícula después de cada ciclo de tratamiento garantiza que las biopelículas con densidades celulares similares se estudien durante todo el experimento, y la fase de nuevo crecimiento puede imitar la disminución de la concentración de antibiótico entre dos tratamientos. Además, la exposición continua puede imponer una selección dependiente del crecimiento que puede evitarse separando los tratamientos por rondas de crecimiento sin antibióticos42.

La evolución experimental de la susceptibilidad a los antimicrobianos aún no se ha estudiado exhaustivamente en entornos más complejos, aunque varios estudios demuestran que los experimentos de evolución con biopelículas polimicrobianas son factibles; los ejemplos incluyen una biopelícula de dos especies (Acinetobacter sp. + Pseudomonas putida) evolucionada en alcohol bencílico105, evolución de P. aeruginosa en presencia de Staphylococcus aureus106 o miembros del microbioma CF107, y una comunidad bacteriana modelo de 34 especies expuesta repetidamente a estreptomicina108. Los ejemplos de estudios in vivo incluyen la propagación en serie de S. pneumoniae mediante la colonización nasal murina repetida109 y la adaptación de Shewanella oneidensis a la vida en los intestinos de las larvas de pez cebra110. Recientemente, se utilizó un modelo de infección por Caenorhabditis elegans para demostrar que la exposición repetida de B. cenocepacia al compuesto antivirulento FR900098, un inhibidor de la vía del no mevalonato, no produjo cambios en la susceptibilidad a este compuesto111.

Al seleccionar aislamientos para estudios de evolución experimental y al analizar los resultados, se debe tener en cuenta la variabilidad entre cepas. Por ejemplo, según la morfología del biofilm in vitro y los perfiles transcripcionales, los aislamientos clínicos de P. aeruginosa se pueden agrupar en diferentes grupos y las cepas en diferentes grupos comparten solo un perfil transcripcional del biofilm central restringido; estas diferencias parecen moldeadas por los antecedentes genéticos de las cepas individuales más que por el estado de maduración de la biopelícula112. Además, la tolerancia está determinada en gran medida por los antecedentes de la cepa individual y esta tolerancia dependiente de la cepa también depende de los antibióticos, observándose tolerancia cruzada de aislados clínicos de P. aeruginosa para ciprofloxacina y tobramicina, pero no para colistina113. Esta variabilidad entre cepas puede tener un profundo impacto en las trayectorias evolutivas durante la evolución experimental y probablemente complicará la aclaración de la contribución de los mecanismos específicos de tolerancia y resistencia a la susceptibilidad reducida. Al mismo tiempo, destaca la versatilidad de los patógenos bacterianos para generar soluciones paralelas.

Los cambios en la susceptibilidad a los antimicrobianos no solo se observan cuando las poblaciones evolucionan en presencia de un agente antimicrobiano, sino que también se han observado en algunos estudios de evolución experimental en los que se desarrollan biopelículas en ausencia de antibióticos (p. ej., en E. coli114 y P. aeruginosa74,115). Es probable que estos cambios sean el resultado de tasas de mutación más altas en las biopelículas (Cuadro 2) y, combinados con una serie de otros mecanismos involucrados en la susceptibilidad reducida12,39, la diversidad resultante ayuda a la supervivencia de la población ("hipótesis del seguro")15,116,117,118. Sin embargo, en la siguiente sección nos centramos en los estudios de evolución experimental que investigan los cambios en la susceptibilidad antimicrobiana del biofilm que se producen durante la exposición a los antibióticos.

En la Tabla 1 se muestra una descripción general no exhaustiva de los genes mutados en las biopelículas de P. aeruginosa durante la evolución experimental en presencia de antibióticos.

En biopelículas de colonias de PAO1 de P. aeruginosa formadas en membranas de policarbonato, la exposición a concentraciones subinhibitorias de ciprofloxacino indujo rápidamente una susceptibilidad reducida a este antibiótico74. Después de 7 pases, el tamaño de las subpoblaciones resistentes fue significativamente mayor en las biopelículas que en las poblaciones planctónicas y la CMI media de ciprofloxacino hacia colonias seleccionadas derivadas de biopelículas evolucionadas por ciprofloxacina aumentó significativamente durante la evolución experimental; esto último no se observó para colonias derivadas de cultivos planctónicos (aunque los clones con los valores más altos de MIC se derivaron de cultivos planctónicos)74. Tanto el número de mutaciones como el espectro mutacional diferían entre las poblaciones evolucionadas: se observó un número significativamente mayor de mutaciones no sinónimas en las poblaciones evolucionadas con ciprofloxacino, las transiciones fueron más frecuentes en las poblaciones planctónicas y la transversión e indels fueron más frecuentes en los biofilms (este último potencialmente relacionado con una mayor actividad de las secuencias de inserción en condiciones de oxígeno limitado119,120). Las mutaciones en mexR (regulador de la bomba de expulsión MexAB-OprM), nfxB (MexCD-OprJ) y mexS (MexEF-OprN) fueron frecuentes en los biofilms desarrollados en presencia de ciprofloxacino, mientras que las mutaciones en nalC y nalD (reguladores de MexAB-OprM) así como en gyrA y gyrB se encontraron frecuentemente en poblaciones planctónicas evolucionadas con ciprofloxacina. Además, se encontraron mutaciones de baja frecuencia en genes relacionados con el metabolismo en varios biofilms desarrollados en presencia de ciprofloxacino; los genes mutados incluyen PA1252 (malato deshidrogenasa), nuoJ y PA1054 (NADH deshidrogenasa)74. Las mutaciones adicionales relacionadas con el metabolismo identificadas en biopelículas expuestas a ciprofloxacina incluyen mutaciones en genes relacionados con el ciclo TCA (p. ej., sdhA) y el metabolismo y transporte de poliamina y arginina (p. ej., argS), así como en genes que codifican varios factores sigma (incluido rpoN y rpoS)121. Las últimas mutaciones podrían ayudar a explicar la fase de retraso prolongada y el aumento de los tiempos de duplicación observados en los clones resistentes a la ciprofloxacina recuperados de biopelículas evolucionadas. En general, estos datos sugieren que las células de P. aeruginosa cultivadas en biopelículas expuestas a concentraciones subinhibitorias de ciprofloxacina portan con mayor frecuencia mutaciones que conducen a una resistencia de bajo nivel, lo que a su vez podría acelerar el desarrollo gradual de resistencia a la ciprofloxacina in vivo74. Curiosamente, en las mismas condiciones experimentales, la falta de la principal catalasa KatA de P. aeruginosa aumentó la fracción de la población resistente a la ciprofloxacina en las biopelículas y se observaron más mutaciones en las biopelículas ΔkatA evolucionadas75, destacando nuevamente el papel que puede desempeñar el estrés oxidativo en la generación de diversidad en biopelículas122. Sin embargo, la observación de que los mutantes resistentes a la ciprofloxacina también aparecen después de la evolución de biopelículas en condiciones anaeróbicas demuestra que el estrés oxidativo no es el único mecanismo75.

Utilizando un modelo basado en perlas, se desarrollaron biopelículas de P. aeruginosa PA14 en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de tobramicina. En el biofilm desarrollado en presencia de tobramicina, los valores de MIC aumentaron 16 veces y al final del experimento todos los biofilms expuestos a tobramicina habían adquirido mutaciones en fusA1 (que codifica el factor de elongación G)73. Si bien las mutaciones de fusA1 también ocurrieron en poblaciones planctónicas expuestas a tobramicina, dominaron en todas las poblaciones finales de biopelículas, mientras que en las poblaciones evolucionadas planctónicamente, sus frecuencias fueron más variables. La investigación de clones mutantes evolucionados reveló que las mutaciones de fusA1 por sí solas conducen a un aumento de 2 a 4 veces de la MIC de tobramicina y al menos a un aumento de 6 veces en la concentración de tobramicina en la que sobreviven las biopelículas. Las poblaciones de biopelículas de P. aeruginosa también adquirieron con frecuencia mutaciones en los genes orfKHLN (que codifican enzimas de biosíntesis del antígeno O) y los mutantes con mutaciones en orfN y fusA1 fueron más resistentes que los mutantes con mutaciones en fusA1 solo.

Por último, recientemente se utilizó la evolución experimental en biopelículas de P. aeruginosa y cultivos planctónicos para identificar el mecanismo de resistencia al péptido antimicrobiano catiónico modificado WLBU2123. WGS reveló que las poblaciones sobrevivientes tenían un mínimo de dos mutaciones entre tres categorías funcionales clave, es decir, modificación de LPS (pmrB), biosíntesis de antígeno O (orfN) y formación de biopelículas (wspF y morA). Aunque se sabe que pmrB y orfN están implicados en la resistencia a los péptidos catiónicos, la aparición de mutaciones en genes de la vía wsp (seleccionados tanto en biopelículas como en cultivos planctónicos) fue más inesperada. Los clones resistentes con mutaciones de wsp mostraron más agregación, lo que sugiere que el aumento de la formación de agregados y/o biopelículas podría contribuir a la resistencia a WLBU2123.

En la Tabla 1 se muestra una descripción general no exhaustiva de los genes mutados en biopelículas de A. baumannii durante la evolución experimental en presencia de antibióticos.

Utilizando un modelo de flujo en el que se forman biopelículas de A. baumannii en tubos de plástico conectados a una bomba peristáltica, se investigó el efecto de la exposición a ciprofloxacina (0,5 x MIC) y tetraciclina (0,25 x MIC)124. Las células dispersadas de biopelículas expuestas a antibióticos tenían una MIC más alta con un 93 % de aislamientos de biopelículas tratadas con ciprofloxacina que mostraron una mayor resistencia a la ciprofloxacina y un 53 % de aislados de biopelículas tratadas con tetraciclina mostraron una mayor resistencia a la tetraciclina; El 80 % de los aislamientos de biopelículas tratadas con ciprofloxacina también mostraron una mayor resistencia a la tetraciclina, pero no se observó resistencia cruzada en los aislamientos de biopelículas tratadas con tetraciclina. Las mutaciones seleccionadas en células de biopelículas tratadas con ciprofloxacina a menudo podrían vincularse directamente con la resistencia, por ejemplo, mutaciones en smpB (cuya eliminación conduce a una mayor resistencia a las fluoroquinolonas, posiblemente debido a un efecto preventivo sobre la fragmentación cromosómica) y en adeS (que conduce a sobreexpresión del sistema de eflujo AdeABC)124. Se encontraron mutaciones en dos genes que pertenecen al locus K (producción de polisacárido capsular) en muestras expuestas a cualquiera de los antibióticos y estas mutaciones a menudo se vincularon con fenotipos de resistencia a los antibióticos. Varios genes mutaron comúnmente en aislamientos de biopelículas tratadas con tetraciclina; estas mutaciones a menudo se correlacionan positivamente con una mayor formación de biopelículas en lugar de una mayor resistencia a la tetraciclina e incluyen una gran deleción de 8706 pb en una región que codifica proteínas involucradas en la regulación de los niveles de c-di-GMP124.

El modelo de perlas mencionado anteriormente también se ha utilizado para estudiar la evolución de biopelículas de A. baumannii en presencia de ciprofloxacina69 o tobramicina73. La comparación de cultivos planctónicos y biopelículas expuestas a concentraciones crecientes de ciprofloxacina mostró que la resistencia de alto nivel se desarrolló rápidamente en cultivos planctónicos (aumento de ~160 veces en MIC) mientras que mutantes con niveles bajos de resistencia (aumento de ~6 veces en MIC) ocurrieron en biopelículas69. Las mutaciones que interrumpen los represores adeL (regulador de la bomba de eflujo AdeFGH) o adeN (regulador de la bomba de eflujo AdeIJK) dominan en biopelículas y clones planctónicos, respectivamente, lo que sugiere la presencia de sistemas de eflujo específicos del estilo de vida, como se identificó previamente en otros organismos125. Curiosamente, las mutaciones en adeS (regulador de la bomba de eflujo AdeABC) aparecieron en biopelículas expuestas, pero posteriormente fueron superadas por mutaciones adeL, algo que no se observó en otro estudio con A. baumannii124. Si bien un par de mutaciones alcanzaron rápidamente la fijación en las poblaciones planctónicas (incluida una sola mutación de alta frecuencia en gyrA en antecedentes genéticos que contenían una mutación adeN), se mantuvo una mayor diversidad en las biopelículas. Las biopelículas de A. baumannii propagadas con selección de tobramicina demostraron un aumento de 8 a 32 veces en la MIC y también en esta especie se produjeron mutaciones en fusA1 en todas las poblaciones replicadas expuestas a tobramicina73. A diferencia de las biopelículas de P. aeruginosa, las biopelículas de A. baumannii tratadas con tobramicina acumularon rápidamente mutaciones en ptsP (que codifica la fosfoenolpiruvato fosfotransferasa), y las mutaciones de fusA1 y ptsP alcanzaron frecuencias similares en las poblaciones planctónicas y de biopelículas tratadas. Los clones mutantes evolucionados con solo una mutación en fusA1 mostraron un aumento de 4 veces en MIC, mientras que los mutantes dobles de fusA1 ptsP mostraron un aumento de 8 veces. A diferencia de fusA1 (que es un gen esencial), las mutaciones de ptsP son probablemente mutaciones de pérdida de función, ya que son indeles que conducen a un cambio de marco. Además, seis mutaciones en cyoAB (que codifican dos subunidades de la ubiquinol oxidasa del citocromo bo3 involucradas en la cadena de transporte de electrones) solo ocurrieron en biopelículas; sin embargo, estas mutaciones fueron superadas por el genotipo fusA1 ptsP a concentraciones más altas de tobramicina73.

Se usaron biopelículas de E. coli cultivadas en celdas de flujo en presencia de rifampicina o kanamicina para abordar la cuestión de cómo el crecimiento en una biopelícula puede proteger a las células resistentes de ser superadas por células no resistentes más aptas en ausencia de antibióticos80. Debido a las limitaciones físicas y la heterogeneidad del biofilm, se puede suponer razonablemente que las células individuales solo tienen que competir con un subconjunto de otras células15, mientras que en las poblaciones planctónicas no estructuradas, las células experimentarían una competencia global en la que tendrían que competir con todas las demás células126. El inóculo ya contenía bajos niveles de mutantes resistentes a la kanamicina y la rifampicina y, durante la formación de biopelículas en ausencia de antibióticos, su número aumentó ~45 veces. El tratamiento con rifampicina condujo a la fijación de la resistencia a la rifampicina (es decir, toda la población se volvió resistente), mientras que el tratamiento con kanamicina resultó en una población con un 52 % de células resistentes. Cuando se detuvo el tratamiento, la fracción de células resistentes no cambió, pero cuando las células del biofilm se transfirieron a cultivos planctónicos, la resistencia a la kanamicina (pero no a la rifampicina) volvió gradualmente a los bajos niveles originales80. Este estudio muestra que la resistencia en las biopelículas puede ser el resultado de mutaciones de novo, pero también puede deberse a la selección de mutantes preexistentes que son menos aptos fuera del entorno de la biopelícula. Las biopelículas de E. coli que se cultivan en discos de silicona y se exponen intermitentemente a concentraciones altas (5 x MIC) y muy altas (80 x MIC) de amikacina experimentan una fuerte caída en el número de células supervivientes después del primer tratamiento, pero el número de supervivientes las células aumentan rápidamente (hasta ~100 % de supervivencia para la exposición a 5 x MIC y ~1 % de supervivencia para la exposición a 80 x MIC)104. En cultivos planctónicos, la disminución después del primer tratamiento es más pronunciada y solo ~0,1 % de las células finalmente sobreviven a la exposición a 5 x MIC (no se observan sobrevivientes después de tres ciclos con exposición a 80 x MIC). Este aumento de la supervivencia en las biopelículas se asocia con un rápido aumento de la CIM en las biopelículas tratadas, mientras que el aumento de la CIM en los cultivos planctónicos es mucho menor. Se encontraron mutaciones en sbmA (que codifica un transportador peptídico de la membrana interna asociado previamente con una mayor resistencia de E. coli a los aminoglucósidos) en todas las poblaciones de biopelículas tratadas y en dos de las tres poblaciones planctónicas tratadas, pero no en los controles no tratados; cinco de las seis poblaciones de biopelículas evolucionadas tenían múltiples mutaciones de sbmA, lo que sugiere una interferencia clonal. Se seleccionaron mutaciones en fusA en varias poblaciones de biopelículas intermedias y al final del experimento en una población de biopelículas; no se seleccionaron mutaciones fusA en cultivos planctónicos. fusA y sbmA pueden coexistir en poblaciones de biopelículas, pero las mutaciones de fusA aparecen antes (o más tarde al mismo tiempo) que las mutaciones de sbmA104. En ausencia de antibióticos, los mutantes fusA tienen una aptitud más baja que los mutantes sbmA, lo que sugiere que los primeros se contraseleccionaron en los períodos entre tratamientos en cultivos planctónicos mientras se mantenían en biopelículas. Las mutaciones de pérdida de función en el gen sbmA conducen a un aumento moderado de la CIM (de 16 a 24 µg/ml), mientras que las mutaciones fusA conducen a valores de CIM de 48 µg/ml. Los valores más altos de MIC (128 µg/ml) se observaron en clones que albergaban una mutación en fusA combinada con una mutación de pérdida de función en sbmA y una mutación en fre (que codifica una NAD(P)H flavina reductasa); o albergaba una mutación en fusA combinada con una mutación en yfgZ (que codifica una proteína involucrada en la reparación durante el estrés oxidativo y la síntesis de grupos de Fe-S). En general, en cultivos planctónicos, se seleccionaron clones que tenían mutaciones en un conjunto diverso de genes y las CIM de estos clones eran típicamente más bajas que las de los clones desarrollados en condiciones de biopelícula104. Curiosamente, los clones recuperados de biopelículas tratadas tenían tasas de supervivencia más altas después del tratamiento cuando se cultivaban en biopelículas en comparación con cuando se cultivaban en cultivos planctónicos, y la mayoría de las poblaciones de biopelículas evolucionadas contenían mutaciones en fimH, que codifican la adhesina de la punta FimH de las fimbrias tipo 1; los mutantes fimH muestran una mayor formación de biopelículas y una susceptibilidad reducida a la amikacina. Juntos, estos datos sugieren que el entorno del biofilm como tal contribuye a una mayor supervivencia tras la exposición a la amikacina, al aumentar la aparición de nuevas mutaciones de resistencia genética, incluso en ausencia de mutaciones que conduzcan a una mayor tolerancia104.

La evolución experimental de biopelículas de Salmonella Typhimurium cultivadas en perlas de vidrio y cultivos planctónicos, en presencia y ausencia de azitromicina, cefotaxima y ciprofloxacina, mostró que las biopelículas y los cultivos planctónicos desarrollan resistencia a estos antibióticos en el mismo período de tiempo72. Sin embargo, el fenotipo de los mutantes evolucionados difiere entre diferentes condiciones; por ejemplo, en contraste con las poblaciones planctónicas expuestas a cefotaxima (que se vuelven principalmente resistentes a cefotaxima), las biopelículas que se desarrollan en presencia de cefotaxima muestran resistencia a una amplia variedad de antibióticos72,127. Los mismos genes a menudo estaban mutados en poblaciones de biopelículas y planctónicas evolucionadas, por ejemplo, mutaciones en acrB y ramR (después de la exposición a azitromicina), envZ (cefotaxima) y gyrA (ciprofloxacina); aunque la mutación exacta a veces difería (p. ej., en ramR: term194Tyr en cultivos planctónicos frente a Thr18Pro en biopelículas; en gyrA: Ser83Tyr en cultivos planctónicos frente a Ser83Phe en biopelículas)72,127. Estas mutaciones sugieren que el flujo de salida (azitromicina), la permeabilidad reducida de la membrana (cefotaxima) y la modificación del objetivo (ciprofloxacino) son los mecanismos más importantes involucrados en la susceptibilidad reducida observada, aunque se identificaron muchas otras mutaciones, y WGS mostró claramente que diferentes mutantes siguieron diferentes caminos de adaptación.

Del LTEE y muchos otros estudios hemos aprendido que, en general, existe un alto grado de paralelismo en la diversificación y que la evolución parece ser reproducible entre linajes replicados y entre diferentes experimentos realizados en diferentes laboratorios, lo que sugiere que los cambios evolutivos observados no son artefactos aleatorios15 . Una prueba adicional de esto proviene de una comparación directa de mutaciones en aislamientos de P. aeruginosa desarrollados experimentalmente y en aislamientos clínicos, incluidos los de infecciones crónicas del tracto respiratorio en la FQ. En general, estas comparaciones confirman que los cambios observados in vitro son relevantes para la evolución de la susceptibilidad in vivo. Por ejemplo, la selección de diferentes mecanismos de resistencia a la ciprofloxacina depende del estilo de vida74, lo que está en línea con la alta prevalencia de mutaciones en los genes diana de la ciprofloxacina en aislamientos de infecciones agudas (p. ej., infecciones del tracto urinario), que son menos comunes en aislamientos recuperados de infecciones crónicas128 . Asimismo, mutaciones en los genes fusA1 y ptsP de P. aeruginosa ocurren con alta frecuencia durante la evolución in vitro y se han observado mutaciones idénticas en aislados clínicos73,89. La adaptación de P. aeruginosa a la infección crónica no solo ocurre en la FQ; por ejemplo, también en aislamientos recuperados de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica se producen mutaciones en genes que se identifican con frecuencia en estudios de evolución experimental (incluidos mexA, mexB, oprM y oprF)129.

La evidencia indirecta proviene de la comparación de fenotipos de aislados evolucionados in vitro con aquellos involucrados durante la infección crónica54. Por ejemplo, los aislamientos de P. aeruginosa recuperados de pacientes más jóvenes con FQ generalmente muestran baja resistencia y baja tolerancia a los antibióticos, y la frecuencia de aislamientos tolerantes a los medicamentos aumentó con el aumento de la edad; el aumento de la frecuencia de aislamientos resistentes solo se observó en pacientes de mayor edad58. En estos pacientes mayores estaban presentes dos subpoblaciones, una que constaba de cepas altamente resistentes y otra que constaba de cepas hipertolerantes que retenían un bajo nivel de resistencia, lo que sugiere que también la tolerancia in vivo puede ser un "trampolín" hacia el desarrollo de resistencia58. Finalmente, el hallazgo reciente de que las biopelículas también están presentes en al menos algunas infecciones agudas del tracto respiratorio y que la principal diferencia entre la infección aguda y la crónica puede no ser la asociación con el estilo de vida planctónico y biopelícula, respectivamente, sino más bien estar relacionada con diferencias en el metabolismo130 está en línea con las observaciones de los estudios de evolución experimental in vitro, ya que las mutaciones en los genes relacionados con el metabolismo se identifican con frecuencia durante la evolución experimental73,74,121.

Si bien estas similitudes entre la evolución in vitro e in vivo sugieren fuertemente que los cambios genéticos identificados in vitro son relevantes para lo que sucede in vivo, la validación experimental del vínculo entre estos cambios genéticos (en genes relacionados con el metabolismo y otros) por un lado, y la susceptibilidad antimicrobiana reducida por el otro, sigue siendo necesaria.

Los cambios en la capacidad de formación de biopelículas durante la evolución experimental también pueden afectar la susceptibilidad de la biopelícula. En presencia de daptomicina, las biopelículas de Enterococcus faecalis cultivadas en un biorreactor desarrollan rápidamente resistencia al antibiótico, pero al mismo tiempo la formación de biopelículas aumentó en las cepas resistentes a la daptomicina81. WGS identificó combinaciones de mutaciones que finalmente conducen a un aumento en la formación de biopelículas y, aunque este aumento en la formación de biopelículas no es un requisito previo para una mayor resistencia, se observó en la mayoría de los linajes resistentes81. También se observaron aumentos en la formación de biopelículas durante la evolución experimental de las biopelículas de A. baumannii (tanto en el modelo de perlas69 como en un sistema de flujo124), con aislamientos de biopelículas no tratadas y tratadas con ciprofloxacina que mostraron una mayor capacidad de formación de biopelículas en comparación con los cultivos iniciales en ambos estudios. Además, en el sistema de flujo, muchos aislados de biopelículas tratadas con tetraciclina mostraron un aumento adicional en la formación de biopelículas124. Mientras que algunas mutaciones relacionadas con una mayor formación de biopelículas ocurrieron en muestras tratadas y no tratadas (p. ej., mutaciones en ABUW_0885 que codifican la proteína Bap asociada a biopelículas), otras (p. ej., mutaciones en ABUW_2055, que codifican una adhesina fimbrial) solo ocurrieron en biopelículas no tratadas124. Como ya se describió anteriormente, se encontraron mutaciones de fimH en la mayoría de las poblaciones de biopelículas de E. coli tratadas con amikacina, así como en los controles no tratados; Los mutantes fimH mostraron una mayor capacidad de formación de biopelículas y una mayor supervivencia tras la exposición a altas concentraciones de amikacina104. En estudios con biopelículas de Salmonella Typhimurium cultivadas en perlas de vidrio, se observó un claro equilibrio entre la resistencia a los antimicrobianos y la formación de biopelículas72,127. En el transcurso del experimento, la capacidad de formación de biopelículas (medida por tinción con cristal violeta) aumentó en las colonias recuperadas de perlas de vidrio no tratadas y esto se asoció con una mutación de sentido erróneo en cytR (que se sabe que aumenta la formación de biopelículas) que ocurrió en múltiples colonias no tratadas. linajes72. Sin embargo, las colonias recuperadas de biopelículas evolucionadas en presencia de antibióticos (especialmente azitromicina y cefotaxima) mostraron una formación de biopelículas reducida en comparación con las biopelículas no expuestas y ninguna de ellas contenía mutaciones en cytR72. La exposición a concentraciones subinhibitorias de cefotaxima selecciona mutaciones en el dominio de unión a ATP/catalítico C-terminal de EnvZ que dan como resultado niveles más bajos de la porina OmpF y una permeabilidad reducida. Sin embargo, EnvZ también regula la producción de curli y se observó una producción reducida de curli y formación de biopelículas en mutantes envZ, lo que sugiere una compensación entre la susceptibilidad de biopelículas y la formación de biopelículas. En general, estos datos sugieren que la asociación entre los cambios en la formación de biopelículas y la susceptibilidad antimicrobiana durante la evolución experimental es compleja y probablemente depende de la especie, el modelo y el antibiótico.

Aunque los estudios discutidos anteriormente utilizaron diferentes sistemas modelo, antibióticos, especies y cepas, surgen algunos patrones comunes.

Si bien la disminución de la susceptibilidad durante la evolución experimental se desarrolla tanto en poblaciones planctónicas como de biopelículas, los mecanismos involucrados y las trayectorias hacia esta susceptibilidad reducida no son idénticos. Las mutaciones en los genes que codifican para los objetivos de los antibióticos se encuentran con frecuencia en poblaciones planctónicas evolucionadas en presencia de antibióticos (p. ej., mutaciones en gyrA después de la evolución en presencia de ciprofloxacina), mientras que las poblaciones de biopelículas evolucionadas también contienen una amplia gama de mutaciones en los genes implicados. en la salida y el metabolismo69,74,121. Cuando se utilizan concentraciones subinhibitorias de antibióticos, el crecimiento en cultivos planctónicos bien mezclados se selecciona por su alto nivel de resistencia, mientras que el crecimiento en biopelículas espacialmente estructuradas favorece a los mutantes con niveles más bajos de resistencia69,74,121. Sin embargo, este no es siempre el caso cuando se utilizan concentraciones letales o crecientes de antibiótico durante la evolución69,73,88,104. Si bien aún no se pueden descartar los efectos dependientes de especies y/o antibióticos, esto sugiere que el régimen de tratamiento en sí mismo juega un papel importante en la determinación de los niveles finales de MIC en las poblaciones planctónicas y de biopelículas.

Las poblaciones de biopelículas evolucionadas mantienen una mayor diversidad que las poblaciones planctónicas correspondientes, en las que las mutaciones exitosas alcanzan la fijación rápidamente, y el entorno de la biopelícula puede proteger contra la selección negativa de mutantes resistentes menos aptos que serían superados rápidamente en cultivos planctónicos121. Sin embargo, un estudio reciente indicó que los costos de aptitud para la resistencia en biopelículas de E. coli asociadas a la superficie no diferían de los de cultivos planctónicos79. Además, otro estudio reciente ha demostrado que el entorno específico codetermina los niveles de aptitud y resistencia asociados con mutaciones específicas131. Claramente, se necesita más trabajo para obtener una visión más profunda de los parámetros que afectan la aptitud en diferentes entornos (estructurados). Además, las mutaciones que conducen a una mayor formación de biopelículas pueden aumentar el tamaño de la población tolerante que sobrevive a la exposición a los antimicrobianos, en la que posteriormente se puede desarrollar resistencia104.

Si bien se encuentran mutaciones en algunos genes en todos los organismos (p. ej., se han observado mutaciones en fusA en P. aeruginosa, A. baumannii y E. coli), diferentes organismos también acumularán mutaciones en diferentes genes, aunque el fenotipo resultante podría ser similar (Tabla 1). Un ejemplo de una estrategia paralela de este tipo son las mutaciones en P. aeruginosa orfKHLN y A. baumannii cyoAB: mientras que estos genes están involucrados en procesos celulares muy diferentes (biosíntesis del antígeno O y transporte de electrones, respectivamente), las mutaciones en cualquiera de los dos dan como resultado una permeabilidad reducida para los aminoglucósidos y puede conducir a una susceptibilidad reducida a los aminoglucósidos73. Del mismo modo, las mutaciones en muchos genes metabólicos o factores sigma diferentes podrían conducir a un crecimiento reducido y a una "tolerancia por retraso". Esto sugiere que los mecanismos fundamentales detrás de la susceptibilidad reducida del biofilm podrían ser similares para diferentes clases de antibióticos y en diferentes organismos, incluso cuando no es posible identificar mutaciones, genes mutados o diferencias en el metabolismo o la expresión génica compartida entre diferentes organismos. Como tal, los datos de la evolución experimental están en línea con la conclusión de un estudio reciente que no pudo encontrar evidencia de una base genética o bioquímica común para la tolerancia a los antimicrobianos en las biopelículas, pero concluyó que muchos genes, proteínas y rutas metabólicas determinan colectivamente el estado fisiológico. y susceptibilidad de las células bacterianas en un biofilm132.

Creemos que la evolución experimental ha ayudado y seguirá ayudando a dilucidar la interacción de la resistencia, la tolerancia y la persistencia que está detrás de la susceptibilidad antimicrobiana reducida de las biopelículas y determina el resultado del tratamiento antimicrobiano. Sin embargo, identificar los patrones complejos de mutaciones, cambios en la expresión génica y el metabolismo en diferentes organismos, así como comunidades polimicrobianas, requerirá un enfoque interdisciplinario y holístico y se beneficiará enormemente del uso de sistemas modelo relevantes.

El intercambio de datos no se aplica a este artículo ya que no se generaron ni analizaron conjuntos de datos durante el estudio actual.

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TC y TB agradecen el apoyo de la Fundación Lundbeck. TC reconoce el apoyo de FWO-Vlaanderen. MB fue apoyado por el Fondo Especial de Investigación de la Universidad de Gante.

Laboratorio de Microbiología Farmacéutica, Universidad de Gante, Gante, Bélgica

Tom Coenye & Mona Bové

Costerton Biofilm Centre, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Tom Coenye y Thomas Bjarnsholt

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TC concibió la revisión. Todos los autores contribuyeron a la redacción y edición.

Correspondencia a Tom Coenye.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Coenye, T., Bové, M. & Bjarnsholt, T. Biofilm susceptibilidad antimicrobiana a través de una lente evolutiva experimental. npj Biofilms Microbiomas 8, 82 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00346-4

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Recibido: 07 junio 2022

Aceptado: 04 de octubre de 2022

Publicado: 18 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00346-4

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