hidrogel

May 01, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 17781 (2022) Citar este artículo

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Los dispositivos de microfluidos que combinan un entorno de matriz extracelular, células y perfusión fisiológicamente relevante son ventajosos como plataformas de cultivo celular. Desarrollamos una plataforma de cultivo celular de microfluidos basada en hidrogel mediante la carga de células de glioblastoma U87 encapsuladas en hidrogel de polietilenglicol (PEG) en pocillos con tapa de membrana en polidimetil siloxano (PDMS). El sistema de cultivo celular de microfluidos multicapa combina características de diseño previamente reportadas en una configuración que carga y perfunde biomiméticamente una matriz 2D de cámaras de cultivo celular. Una dimensión de la matriz es alimentada por un generador de gradiente de concentración de microfluidos (MCGG), mientras que la dimensión ortogonal proporciona canales de carga que llenan filas de cámaras de cultivo celular en una capa separada. A diferencia de los mezcladores MCGG típicos en forma de árbol, se logra una dilución en serie fraccionaria de 1, ½, ¼ y 0 de la concentración inicial de soluto adaptando los anchos de los microcanales de entrada. Los hidrogeles se cargan de forma eficiente y reproducible en todos los pocillos y las células se distribuyen uniformemente por todo el hidrogel, manteniendo una viabilidad superior al 90 % durante un máximo de 4 días. En un ensayo de detección de fármacos, se mide la difusión de temozolomida y carmustina a las células U87 encapsuladas en hidrogel desde la solución de perfusión y se generan curvas de dosis-respuesta, lo que demuestra su utilidad como imitador in vitro del microambiente del glioblastoma.

Casi el 97 % de los medicamentos desarrollados para intervenciones oncológicas fallan durante los ensayos clínicos debido a la dependencia de modelos de medicamentos inadecuados, específicamente modelos de cultivo celular bidimensionales (2D) in vitro1. Aunque los modelos de cultivo celular 2D in vitro son cómodos de usar, no representan adecuadamente el microentorno tumoral complejo, ya que el comportamiento celular se ve afectado por la morfología plana del plástico plano rígido que se usa típicamente2,3. Para abordar las preocupaciones con los modelos de cultivo de células 2D, ha habido un cambio hacia modelos de cultivo de células cancerosas tridimensionales (3D) como imitaciones fisiológicamente más relevantes del microambiente tumoral4. En general, los modelos de tumores en 3D pueden adoptar muchas formas, como esferoides, organoides o cultivos basados ​​en matriz y cocultivos, por nombrar algunos5,6. Para agregar complejidad y mejorar la relevancia fisiológica, los modelos de tumores en 3D se pueden combinar con dispositivos de microfluidos para permitir la perfusión o imitar la vascularización7. Los sistemas de microfluidos que combinan células, una matriz extracelular y perfusión son buenos imitadores del microambiente tumoral in vivo y son de bajo costo y reproducibles, permiten el uso de pequeños volúmenes de cultivo y tienen un diseño controlable que puede optimizarse para una aplicación deseada8, 9. Los sistemas de cultivo celular basados ​​en perfusión proporcionan nutrientes a las células y eliminan los desechos metabólicos de una manera que pretende imitar el transporte de masa in vivo y mantener los factores solubles cerca de las concentraciones biológicas10. Además, se pueden generar gradientes temporales y espaciales dentro de los sistemas de microfluidos, ampliando aún más su valor como plataformas de detección de fármacos8. Sin embargo, diseñar y operar un sistema de perfusión de microfluidos robusto para el cultivo 3D de células de mamíferos adherentes es un desafío3. Los desafíos podrían estar relacionados con el diseño del dispositivo, como elegir la configuración de cultivo adecuada, los materiales o la fabricación de la red de microfluidos, o puramente técnicos, como la esterilización, la siembra de células en el dispositivo, la optimización del transporte de masa y las tensiones de corte del flujo para maximizar la viabilidad celular. y evitando burbujas de aire en los canales de perfusión.

Se han desarrollado mezcladores de gradiente para sistemas de microfluidos que se pueden usar para proporcionar una mezcla en el chip para suministrar concentraciones discretas de factores solubles a los sistemas de cultivo celular que se pueden usar para mantener células, diferenciar células madre o responder varias preguntas biológicas11. Muchos de estos mezcladores de microfluidos utilizan estructuras en forma de árbol con múltiples etapas que requieren una mezcla completa antes del final de cada etapa8,12,13, similar al diseño que se usa aquí. La formación de gradientes en el chip elimina la posibilidad de errores de pipeteo, reduce las posibilidades de contaminación y permite menos entradas de microfluidos que simplifican la configuración en comparación con los dispositivos de microfluidos con gradientes generados externamente14,15.

Reconociendo la relevancia fisiológica mejorada de los sistemas de cultivo celular 3D de perfusión, un creciente cuerpo de investigación se ha centrado en dispositivos de cultivo celular microfluídicos para aplicaciones de detección de fármacos con énfasis en modelos de tejido hepático y canceroso16,17. Por ejemplo, se cultivaron modelos de esferoides tumorales en micropocillos de cultivo celular conectados con un generador de gradiente de concentración en chips de microfluidos y se utilizaron en aplicaciones de detección de fármacos18,19. Estos sistemas 3D no incorporaron un imitador de matriz extracelular y se basaron en la captura de células para llenar las cámaras de cultivo celular. Utilizando un diseño inteligente, una matriz de células microfluídicas en 3D incorporó tanto células cancerosas como células endoteliales para emular el entorno del tumor7. La capa inferior tenía microcámaras con células cancerosas incrustadas en hidrogel, separadas de una capa superior de microcanales de células endoteliales a través de una membrana permeable con poros agrupados, y el dispositivo no incluía un generador de gradiente de concentración. Luego, los autores compararon las respuestas a los medicamentos en su sistema con las respuestas a los medicamentos en un cultivo 3D estático y notaron una respuesta retrasada posiblemente debido al endotelio formado en los microcanales superiores, que actúa como una barrera para la penetración de los medicamentos. Se desarrolló otro dispositivo de microfluidos basado en la fuerza capilar para el cultivo de células 2D y 3D que incorpora capas de células endoteliales y cancerosas para aplicaciones de detección de fármacos, en las que se podía generar un gradiente sin necesidad de equipo especializado20. Toh et al. desarrolló un chip de matriz de células de microfluidos 3D para probar la hepatotoxicidad de los fármacos, donde los hepatocitos se cultivaron y se expusieron a dosis de fármacos en gradiente21. El microentorno 3D se generó a través de la coacervación de colágeno y terpolímero y se mantuvo con una matriz de micropilares. En general, los dispositivos de cultivo celular microfluídicos pueden combinar múltiples características útiles, como un mimético de matriz extracelular, células y cocultivos celulares, perfusión fisiológicamente relevante, cámaras de cultivo celular multiplexadas y gradientes de concentración o generadores de dilución, que los hacen atractivos para aplicaciones tales como fármacos. tamizaje22.

Aquí, describimos un dispositivo de microfluidos diseñado para cultivos celulares 3D basados ​​en hidrogel y mostramos su utilidad con dos matrices de hidrogel diferentes y la construcción de curvas de dosis-respuesta con dos quimioterapéuticos. La matriz 2D de cámaras de cultivo celular está perfundida por un MCGG en forma de árbol que crea una dilución fraccionada en serie que proporciona proporciones de dilución de 1, ½, ¼ y 0. Las células y la solución precursora del gel se cargan fácilmente en el dispositivo y los hidrogeles. forma después de la fotoiniciación o la adición de tipo Michael sin oclusión de los canales de perfusión o acumulación de presión que podría afectar la viabilidad celular. Usando este sistema de microfluidos, cultivamos células de glioblastoma en hidrogeles basados ​​en polietilenglicol (PEG) 3D y medimos la administración de fármacos a través de la perfusión y la viabilidad celular después del tratamiento con temozolomida (TMZ) y carmustina (BCNU).

El kit de elastómero de silicona Sylgard™ 184 (denominado polidimetil siloxano o PDMS) se obtuvo de Dow Silicones Corporation (Midland, MI). Los filtros de membrana de poliéster (PETE) (transparentes, tamaño de poro de 0,2 µm, espesor de 12 µm, 2e6 poros/cm2) eran de Sterlitech Corporation (Kent, WA). Los portaobjetos de vidrio simple prelimpiados de 75 mm × 50 mm × 1 mm eran de Corning Incorporated (Corning, NY). Los tubos de polietileno (PE) INTRAMEDIC (ID 1,40 mm, OD 1,90 mm; y ID 1,14 mm, OD 1,57 mm) eran de Clay Adams. Las obleas de silicio (SI) eran de University Wafer Inc (Boston, MA). El fotorresistente SU-8 2025 y el revelador SU-8 (98–100 % de acetato de 1-metoxi-2-propilo) eran de Kayaku Advanced Materials Inc (Westborough, MA). La lámina MIL PRF 131k Clase 1, de 150 µm de espesor (MarvelSeal® 470) era de Berry Global (Evansville, IN). El marco A1, una película delgada de polímero (película resistente al agua para inyección de tinta A4) era de CisInks (South El Monte, CA). El diacrilato de polietilenglicol (PEGDA; 5 kDA), el poli(etilenglicol)-acrilato de 4 brazos (PEG-Ac de 4 brazos; 10 kDa) y el poli(etilenglicol)-ditiol (PEG-diSH; 3,4 kDa) procedían de Laysan Bio Inc. (Árabe, AL). La solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 X, pH 7,4), azul tripán (0,4 %), perlas de poliestireno fluorescente (Fluoro-Max™ Fluorescent Red, 542/612 nm, d = 2 µm) y temozolomida (TMZ) eran de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Irgacure 2959 era de la corporación BASF (Florham Park, NJ). El suero bovino fetal (FBS) y la penicilina/estreptomicina (P/S) procedían de Hyclone (Logan, UT). El medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) - 1640 y el 0,05 % de tripsina/0,02 % de ácido etilendinitrilotetraacético (EDTA) eran de Coring (Coring, NY). Naranja de acridina (AO) y carmustina (BCNU) eran de Millipore Sigma (St Louis, MO). El yoduro de propidio (PI) era de MP Biomedical LLC (Solon, OH). La tinción celular con perclorato de 3,3'-dioctafeciloxacarbocianina (DiOC) fue de Life Technologies (Carlsbad, CA). Brilliant Blue FCF (Número CAS: 3844-45-9) se compró como colorante azul para alimentos en una tienda de comestibles local. Las células U87 de glioblastoma cerebral de Homo sapiens procedían de ATCC (Manassas, VA). Glicina–Arginina–Cisteína–Ácido aspártico–Arginina–Glicina–Ácido aspártico–Serina (GRCD-RGDS), Glicina–Arginina–Cisteína–Ácido aspártico–Arginina–Glicina–Ácido aspártico–Serina–FITC (GRCD-RGDS-FITC), y ácido aspártico-arginina-cisteína-glicina-valina-prolina-metionina-serina-metionina-arginina-glicina-cisteína-arginina-ácido aspártico (DRCG-VPMSMR-GCRD) eran de Genic Bio (Shanghai, China).

El dispositivo de microfluidos se fabricó ensamblando un portaobjetos de microscopio de vidrio de soporte (75 mm × 50 mm × 1 mm), dos capas de PDMS estampado (capa superior de perfusión y una capa inferior de cámaras de cultivo celular con canales de carga celular), dieciséis membranas PETE (recubrimiento los dieciséis micropocillos de cultivo celular) y tres tubos: dos tubos de entrada (tubo de PE; DI 1,14 mm, DE 1,57 mm) y un tubo de salida (tubo de PE; DI 1,40 mm, DE 1,90 mm) (Fig. 1, Fig. S1). La capa de perfusión superior tenía un grosor de 3 mm y la capa de micropocillos de cultivo celular inferior tenía un grosor de 250 µm. La altura de los canales de carga de células y perfusión fue de 50 µm. Se eligió una profundidad de pozo de 250 µm para que fuera más grande que una celda individual y, al mismo tiempo, permitiera obtener imágenes de toda la muestra. La mayoría de los canales de perfusión tenían 150 µm de ancho con las excepciones clave de 50 µm y 75 µm, que se incorporaron al diseño para lograr series de dilución fraccionada. Estos canales de dilución fraccionada se utilizaron para producir un gradiente de concentración del 100 %, 50 %, 25 % y 0 % de la concentración inicial de soluto. Los canales de carga de células en la capa inferior también tenían 150 µm de ancho.

Diseño de dispositivos microfluídicos. (A) Foto del dispositivo de microfluidos con el tubo de entrada (lado izquierdo de la imagen) y salida (lado derecho de la imagen). La barra de escala negra representa 1 cm. (B) Anchos de canal de los microcanales y las diluciones de concentración generadas con estos anchos de canal. (C) Vista lateral de los dispositivos de microfluidos fabricados que muestran los tubos de entrada (izquierda), las cámaras de mezcla (roja), las cámaras de cultivo celular (verde) y el tubo de salida (derecha).

Tanto la capa superior como la inferior de PDMS se fabricaron mediante el curado del precursor de PDMS en patrones de Si patrón (fabricados mediante el procedimiento estándar de fotolitografía SU-8 2025: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4-3 .pdf) a 75 °C durante la noche. Brevemente, un fotorresistente SU-8 2025 de 50 µm de espesor se revistió por rotación en una oblea de Si a 1700 rpm (SP-100 spinner, BidTec) y se horneó suavemente en una placa caliente a 65 °C durante 3 min y luego a 95 °C durante 9 minutos Los patrones de las máscaras preimpresas se transfirieron a la capa fotorresistente mediante radiación UV (160 mJ/cm2 con Flood Exposure Model 60, ABM-USA, Inc., San Josa, California, EE. UU.), horneado posterior a la exposición (en una placa calefactora a 65 °C durante 6 min y luego a 95 °C durante 7 min) y desarrollada mediante un proceso estándar que se muestra en la figura complementaria S2. La radiación UV reticuló el SU-8 expuesto, y el revelador de SU-8 disolvió el SU-8 no reticulado, dejando solo los patrones de SU-8 reticulados.

La capa de PDMS de cultivo celular inferior se preparó de manera similar con una modificación para controlar el grosor (Fig. S3 complementaria). Para lograr un espesor de 250 μm para la capa inferior de PDMS, se usó un espaciador de marco de lámina de aluminio de 150 μm. Después de verter el precursor de PDMS en el maestro de Si y el marco de Al, se colocó encima una película delgada de polímero y un portaobjetos de vidrio rígido. La película de polímero flexible se agregó para evitar el contacto del precursor de PDMS y el portaobjetos de vidrio; de lo contrario, el portaobjetos de vidrio rígido no podría retirarse después de curar el PDMS. Se agregó un peso de 5 libras en la parte superior para asegurar un espesor uniforme de la capa de PDMS y el PDMS se curó a 80 °C durante la noche. El espesor se midió con un perfilómetro Alpha-Step IQ (KLA-TENCOR Alpha D500, KLA Corp., Milpitas, California, EE. UU.). Tenga en cuenta que la capa de PDMS era más gruesa que el espaciador, ya que no todo el exceso de PDMS se extruyó a través de los bordes antes de la polimerización debido a la alta viscosidad del precursor de PDMS.

Después de curar las capas de PDMS, se cortaron 16 cámaras de células (2 mm de DI), 2 entradas (1,5 mm de DI) y 1 salida (2 mm de DI) con punzones de biopsia. Dieciséis membranas circulares de PETE (tamaño de poro de 0,2 µm), cortadas con punzón de biopsia de 3 mm de diámetro, se colocaron individualmente sobre cada uno de los micropocillos de cultivo celular de 2 mm de DI para separar las dos capas de PDMS y evitar que las células y el material de las cámaras de cultivo se escapen al interior. los canales de perfusión. Se eligieron piezas de membrana individuales en lugar de una sola pieza para permitir una mejor adhesión entre las dos capas de PDMS (capas superior e inferior del dispositivo), para evitar fugas y asegurar la estabilidad a lo largo del tiempo. Las piezas individuales también evitan la diafonía entre pocillos, lo que podría ocurrir con una capa de membrana de una sola pieza. Las membranas de 3 mm de diámetro son ligeramente más grandes que los pocillos de 2 mm de DI, por lo que los bordes de las membranas entran en contacto con las superficies lisas del PDMS, se adhieren espontáneamente y se mantienen firmes durante el siguiente plasma de oxígeno y la alineación. Luego se usó un dispositivo de tratamiento de corona de laboratorio (modelo BD-20AC, Electro-Technic Products, Chicago, IL, EE. UU.) para tratar las dos superficies de PDMS con plasma durante 1 minuto para oxidarlas. Las dos capas de PDMS se alinearon con cuatro marcas de registro en las esquinas a simple vista. Después de que las dos capas de PDMS se presionaran juntas con membranas de PETE en el medio, las superficies del portaobjetos de vidrio y el ensamblaje de PDMS se oxidaron más con plasma durante 1 minuto para mejorar la unión. Los tubos de entrada y salida se insertaron en las ubicaciones de entrada y salida y se sellaron con PDMS sin curar. Los dispositivos se calentaron a 75 °C durante al menos 2 h para mejorar el sellado y curar el PDMS. En la figura complementaria S4 se muestra un esquema detallado del ensamblaje del dispositivo.

Para la perfusión, los fluidos de perfusión se colocaron en jeringas de 3 ml en una bomba de jeringa dual (New Era Pump Systems Inc, Farmingdale, NY) para que las entradas a ambos lados de los mezcladores tuvieran el mismo caudal. Las jeringas se conectaron a los puertos de entrada del dispositivo con agujas (21 G) y tubos (tubo de PE DI 1,14 mm, DE 1,57 mm). Los caudales volumétricos probados fueron 1, 1,5, 2, 5 y 10 µL/min. Para estudiar la eficiencia de la mezcla, se disolvió una solución de azul brillante FCF (para ayudar en la visualización) en PBS hasta una concentración final de 25 μM (medida mediante la ley de Beer-Lambert)23 y se usó en combinación con PBS simple para determinar el rendimiento de la mezcla. micromezcladores. Usando un microscopio invertido (Zeiss, Axiovert 200 M, Oberkochen Alemania) con un aumento de 5X, se capturaron imágenes en tres regiones (entrada, medio y salida) de los micromezcladores durante la perfusión (Fig. 2B). Luego se usó el software ImageJ24 para dividir los canales RGB y medir la intensidad del canal RGB azul dentro de los micromezcladores (en función del ancho del micromezclador) usando la función 'Plot Profile'. Los valores se normalizaron de 0 a 1 para cada conjunto de imágenes, con un valor gris de 1 asignado al color azul y un valor gris de 0 asignado al color de fondo del chip de microfluidos. El índice de mezcla absoluto (AMI) se calculó como:

donde Ii es la intensidad de píxel local, < I > es la intensidad de píxel media en la sección transversal y NI el número total de píxeles25.

Configuración de carga y perfusión. (A) Esquema de la carga de la solución precursora de hidrogel en los micropocillos con tapa de membrana de la capa de carga inferior del dispositivo a través de los puertos de carga con una aguja de insulina. (B) Esquema de configuración de perfusión en el que los tubos conectan las jeringas de 3 ml que contienen los fluidos de perfusión a los puertos de entrada del dispositivo de microfluidos. Los círculos rojos indican dónde se tomaron las imágenes dentro del micromezclador para el análisis de mezcla (entrada, centro y salida). Los círculos azules indican dónde se tomaron las imágenes al final del micromezclador para el análisis del gradiente de concentración.

Además, para determinar el gradiente de concentración generado por el dispositivo de microfluidos a las tasas de flujo volumétrico establecidas, también se capturaron imágenes al final de cada micromezclador y luego se usó el software ImageJ para comparar la intensidad promedio del tinte producido por los micromezcladores.

Modelando moléculas como esferas duras, usamos la ecuación de Stokes-Einstein para calcular el coeficiente de difusión de las moléculas:

donde D es el coeficiente de difusión, \(k\) es la constante de Boltzmann, \(\mu\) es la viscosidad dinámica del agua a 37 °C y \(r\) es el radio hidrodinámico de la partícula. Suponiendo que el volumen molecular de la partícula corresponde a una forma esférica, el radio hidrodinámico de cada molécula se calculó como:

donde MW es el peso molecular de la partícula (proporcionado por la Royal Society of Chemistry), NA es el número de Avogadro y \(\rho\) es la densidad de la partícula (proporcionada por la Royal Society of Chemistry). El tiempo requerido para que una molécula se difunda a través del ancho del canal se calculó como:

donde \(t\) es el tiempo requerido para que se produzca la difusión y \(x\) es la distancia de difusión.

Se cultivaron células U87 de glioblastoma humano en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % y P/S al 1 % y se incubaron en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se sometieron a pases mediante una exposición de 5 min a tripsina/EDTA una vez que se alcanzó una confluencia de ~80 %, y los medios se cambiaron cada 2 días. Los pasajes celulares 10–20 se usaron para experimentos. Las células se cultivaron con DiOC (20 μM) durante 24 h para teñir todas las células antes de continuar con la experimentación.

Se prepararon hidrogeles de PEGDA no degradables y no adhesivos mediante fotopolimerización UV. Brevemente, para preparar una solución madre del fotoiniciador, se disolvió Irgacure 2959 al 1 % p/v en agua desionizada (agua desionizada), se sonicó (Branson, modelo n.° 2800, 40 kHz) durante 90 min y se almacenó a temperatura ambiente. protegido de la luz hasta por 2 semanas. Se preparó una solución precursora de hidrogel de PEGDA (250 µl) al 20 % p/v y al 0,1 % p/v en Irgacure en PBS y se agitó durante 30 s para asegurar una mezcla completa. La solución de precursor de hidrogel se cargó en los micropocillos de cultivo celular del dispositivo de microfluidos a través de los puertos de carga utilizando una aguja de insulina (Fig. 2A). Cada micropocillo contenía aproximadamente 0,2 µL de la solución precursora de hidrogel; por lo tanto, se necesitaron 3,14 µl de solución para llenar los 16 micropocillos. La cantidad en exceso de solución precursora fue necesaria para garantizar que la solución llegara a los micropocillos en lugar de permanecer dentro de los canales de carga. Se incorporaron canales de alivio en el diseño de la capa de carga del dispositivo para permitir que el exceso de solución precursora salga del dispositivo en lugar de empujar contra la membrana que tapa los micropocillos. Luego, los hidrogeles se polimerizaron bajo una lámpara UV (4,81 mW cm2, 1 W, 365 nm; lámpara de banco UV Blak-Ray® XX-15L, UVP, Upland, CA) durante 10 min26. Estos geles se denominan PEGDA en todo momento.

Se prepararon hidrogeles de PEG-Ac de 4 brazos adhesivos degradables mediante adición de tipo Michael. En primer lugar, se preparó PEG-RGDS de 4 brazos siguiendo un protocolo previamente desarrollado27. Modificamos en promedio uno de los grupos acrilato de cada PEG-Ac de 4 brazos con RGDS (80 % de eficiencia de modificación) y almacenamos el producto liofilizado bajo argón en un recipiente desecado a -20 °C hasta por 6 meses. A continuación, se formaron hidrogeles utilizando una mezcla de PEG-Ac de 4 brazos y PEG-RGDS de 4 brazos (0,8 mM en RGDS) y una mezcla de reticulante 50:50 de PEG-diSH y un reticulante peptídico degradable enzimáticamente DRCG-VPMS↑MR- GCRD. Para todos los geles, se prepararon soluciones madre al 20 % p/v de PEG-Ac de 4 brazos, PEG-diSH y PEG-RGDS de 4 brazos en tampón TEA pH 8 inmediatamente antes de su uso. Las soluciones madre se mezclaron y el reticulante peptídico se añadió en forma de polvo para dar una solución precursora de hidrogel con una proporción molar de acrilato a tiol de 1:1 y una concentración de polímero final del 10 % p/vy una concentración reticulante peptídica final de 7,8 mM. La solución de precursor de hidrogel se mezcló mediante pipeteo durante 30 s, se inyectó en el dispositivo de microfluidos como se describe anteriormente y se dejó gelificar durante 20 min en una incubadora humidificada a 37 °C y 5 % de CO2. Estos geles se denominan PEG-Ac de 4 brazos en todo momento.

Para evaluar la reproducibilidad del hidrogel y la carga celular en los micropocillos de cultivo celular del dispositivo de microfluidos, se agregaron células U87 teñidas con DiOC a la solución precursora de hidrogel PEGDA a 106 células/mL. Luego, la solución precursora se cargó en los micropocillos usando una aguja de insulina y se gelificó bajo UV como se describió anteriormente. Se tomaron imágenes de cada pozo usando un microscopio de fluorescencia invertido y se usó ImageJ para contar el número de ells dentro de cada pozo. Se tomaron imágenes de la distribución de las células marcadas con fluorescencia dentro del hidrogel usando un microscopio confocal (Leica Confocal SP8, Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove, IL) con un aumento de × 10 y se procesaron usando el software Fiji (descarga gratuita http://fiji.sc) . Para la obtención de imágenes confocales, el hidrogel también se volvió fluorescente mediante la incorporación covalente de un péptido fluorescente GRCD-RGDS-FITC como lo describimos anteriormente27.

Se inyectó una solución de precursor de hidrogel que contenía PEGDA al 20 % p/v, Irgacure al 0,1 % v/v y 106 células/mL (células U87 teñidas con DiOC) y se polimerizó en los micropocillos de cultivo celular del dispositivo de microfluidos como se describió anteriormente para preparar los no hidrogeles PEGDA degradables y no adhesivos. Inmediatamente después de la gelificación, se perfundió medio RPMI suplementado con FBS al 10 % y P/S al 1 % a través del dispositivo durante 48 h. A las 48 h, el medio de perfusión se reemplazó con medio suplementado que contenía 0,2 μg/ml de PI (núcleos de tinción de células muertas) en ambas entradas y TMZ 2 mM o BCNU 10 μM en una entrada y se perfundió a través del dispositivo durante 48 h. De manera similar, se prepararon hidrogeles de PEG-Ac de 4 brazos degradables y adhesivos que contenían 106 células/mL de células U87 teñidas con DiOC, como se describió anteriormente, se cultivaron durante 48 h y se expusieron a TMZ durante 48 h. Se tomaron imágenes de las células encapsuladas utilizando un microscopio de fluorescencia invertida Axiovert 200 M con un aumento de × 10. La viabilidad celular se calculó como:

donde NL representa el número de células vivas y ND representa el número de células muertas.

La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS; Microscopio de fluorescencia Zeiss LSM 510, Zeiss, Alemania) se utilizó para medir la difusividad in situ de un fluoróforo modelo (Atto 655) en una losa de hidrogel PEGDA al 20 % p/v. Los hidrogeles se formaron como se describe anteriormente, con la modificación de que se añadió Atto 655 (0,5 nM) a las soluciones precursoras de hidrogel. Para las mediciones de FCS, se prepararon hidrogeles (150 µl) en un cubreobjetos de 8 cámaras con fondo de borosilicato alemán n.º 1. Luego, los hidrogeles se empaparon durante la noche en medio DMEM sin rojo de fenol y que contenía Atto 655 0,5 nM para evitar la difusión impulsada por la concentración de Atto 655 desde el hidrogel al medio circundante. También se utilizó Atto 655 (0,5 nM) en agua desionizada para calibrar el volumen confocal del instrumento FCS. Se utilizó un láser pulsado de 633 nm ps para seis mediciones de 300 s para cada ubicación de muestra. Se obtuvo una función de autocorrelación G(τ) para cada medida:

donde N es el número de partículas fluorescentes, p = ro/zo es una constante instrumental, ro es el radio y zo es la longitud axial del punto del rayo láser enfocado, τd es el tiempo de difusión del soluto, T es la amplitud del estado triplete y τT es el tiempo de vida del triplete. La función de autocorrelación se ajustó utilizando un modelo de triplete para tener en cuenta la posible excitación de estados de triplete molecular a intensidades de láser más altas. Por último, la función de autocorrelación se normalizó de la siguiente manera:

donde G(τD) es el valor de la ecuación. (6) en cada punto de tiempo y G(τ0) es el valor de la ecuación. (6) en el momento inicial. El coeficiente de difusión del trazador efectivo para cada proteína en solución se calculó a partir de τD como:

Suponiendo que las difusividades de TMZ y Atto 655 fueran similares debido a sus pesos moleculares relativamente similares (194 g/mol y 887 g/mol, respectivamente), modelamos la concentración anticipada de TMZ en los geles en función de la profundidad y el tiempo del gel. La concentración de TMZ se calculó a través de la segunda ley de difusión de Fick para geometría 1-D (una losa delgada) con las siguientes condiciones de contorno: c(x = 0) = 2 mM TMZ y c(x = ∞) = 0 mM TMZ en t = 0 h, donde c es la concentración de TMZ, x es la ubicación del gel y t es el tiempo:

Todos los datos se presentan como valores medios (± SD) determinados a partir de 3 a 4 experimentos independientes. El análisis estadístico para el análisis del gradiente de concentración y la reproducibilidad de la carga se realizó mediante ANOVA unidireccional con Holm-Sidak o las pruebas de comparación múltiple de Dunn utilizando GraphPad Prism 6®. El análisis estadístico de la pendiente del perfil de intensidad frente al caudal volumétrico se realizó mediante un análisis de regresión lineal utilizando GraphPad Prism 6®. Una p < 0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Aquí diseñamos un dispositivo de microfluidos que nos permitió cargar células encapsuladas en hidrogel en micropocillos de cultivo celular con tapa de membrana para perfundirlos con fluidos que contienen las biomoléculas deseadas o fármacos de diferentes concentraciones (Fig. 1, Fig. S1 complementaria). El dispositivo tiene una combinación de varias características que lo convierten en una buena opción para el cultivo celular de perfusión basado en hidrogel 3D: (i) es una estructura cerrada con canales de carga celular; (ii) hay una matriz 2D de cámaras de cultivo celular tapadas por una membrana para evitar la contaminación o el escape de células a las capas de perfusión; (iii) las células se cargan dentro de un hidrogel para cultivo celular biomimético 3D; (iv) el diseño invertido permite obtener imágenes desde la parte inferior; y (v) el MCGG usa el ancho del canal en lugar de la longitud para variar las proporciones de mezcla.

El dispositivo de microfluidos se construyó con PDMS, que se usa comúnmente en aplicaciones de microfluidos, ya que es fácil de fabricar, inerte, no citotóxico, permeable a los gases y adecuado para imágenes de fluorescencia3,28,29. Es importante destacar que para nuestro diseño, PDMS es compatible y permitió el uso de una aguja de insulina para cargar células y geles en los micropocillos. El sistema de microfluidos constaba de dos capas de canales de microfluidos, separados por membranas para sellar los canales de carga de células inferiores. La capa de perfusión superior (Figs. 1, 2B) contiene los micromezcladores serpenteantes que conducen a los canales de perfusión que proporcionan flujo sobre la membrana para alimentar las células en las cámaras de cultivo de abajo. Los micromezcladores de dos etapas tienen anchos de canal de alimentación de 150/75/150/150 μm aguas arriba de la primera etapa y 150/50/150/50/150 μm aguas arriba de la segunda etapa para producir la serie de dilución de concentración fraccionada de 1:½ :¼:0 (Figura 1B). Los canales de perfusión se dirigen de forma fluida a las cámaras de cultivo celular en paralelo para evitar la diafonía. El dispositivo proporciona un funcionamiento estable durante varios días, consume < 1,5 ml/día y perfunde las células con medio fresco para evitar la citotoxicidad. Con un caudal volumétrico de 1 μl/min, la velocidad lineal es de ~ 1,1 mm/s dentro del canal de alimentación a la capa de perfusión por encima de la cámara de cultivo celular, que es similar al caudal in vivo a través de los capilares30. Por ejemplo, Giulitti et al. demostró que si la perfusión es demasiado lenta (p. ej., 0,6 µL/h), las células aguas abajo pueden experimentar citotoxicidad debido a la distribución heterogénea de nutrientes (mayor concentración aguas arriba) y desechos (mayor concentración aguas abajo)31. Caudales más altos (p. ej., 30–60 μL/h, similar al 1 μL/min utilizado en este estudio) dan como resultado un cultivo celular más homogéneo dentro de todo el dispositivo de microfluidos. Según el diseño del dispositivo, las velocidades de flujo demasiado altas (p. ej., 40 μl/min) también podrían provocar una mezcla incompleta o una citotoxicidad inducida por el esfuerzo cortante32.

En la capa inferior se incorporaron microcanales para cargar células en cámaras de cultivo. Cada fila de cámaras de cultivo celular se carga desde una sola entrada. Si se carga la misma solución que contiene células en cada entrada, se crean cuatro réplicas biológicas como se realizó en este estudio. La carga es más consistente cuando cada cámara de cultivo celular tiene la misma longitud del paso del microcanal (la suma de la longitud del canal desde la entrada hasta el micropocillo y desde el micropocillo hasta la salida) para permitir que los micropocillos se llenen en paralelo simultáneamente ( Figura 2A). Los canales de cada micropocillo de cultivo celular a la salida actuaron como un canal de alivio de la muestra para facilitar el proceso de carga y reducir la presión requerida mientras se cargaba la solución precursora de hidrogel en los micropocillos. Los canales de alivio evitan que las células encapsuladas en hidrogel escapen a la capa de perfusión y bloqueen la perfusión tras la gelificación bajo una presión de carga excesiva. Cada pocillo de cultivo celular se tapó con una membrana PETE (tamaño de poro de 0,2 µm), lo que permitió el intercambio de nutrientes y desechos entre las células y los fluidos de perfusión, pero restringió el paso de partículas grandes, bacterias y células, asegurando que no se pudiera contaminar. ocurren debido a la perfusión. Por último, las células contenidas dentro de la matriz de gel se protegieron del estrés de cizallamiento hidrodinámico de los fluidos de perfusión circulantes para mejorar la recapitulación del sistema in vivo. La ubicación de las cámaras de cultivo en relación con la corriente de perfusión es importante ya que las células ubicadas directamente en la ruta de flujo están sujetas a estrés de cizallamiento hidrodinámico, que puede afectar la morfología celular, la organización del citoesqueleto, la proliferación, las vías de señalización celular y los genes y las proteínas. expresión3.

Aquí, en contraste con un MCGG típico, se logra una dilución en serie fraccionada variando los anchos de los canales de alimentación. Los mezcladores basados ​​en difusión tienen una velocidad máxima a la que se logra una mezcla completa, por lo tanto, variar el ancho de los canales de alimentación en lugar de la longitud permite una estructura de mezcla más compacta. Previamente, se ha creado un parámetro adimensional para determinar la longitud requerida del mezclador para varias geometrías33. La velocidad máxima para la mezcla de gradiente se mide experimentalmente usando un microscopio en nuestros canales serpenteantes de esquina cuadrada de 18,5 mm de largo, como se muestra en la Fig. 2B. Se muestran imágenes que miden la mezcla en la entrada, el medio y el final del canal a caudales de 1, 5 y 10 μL/min (Fig. 3A). En total, se utilizaron cinco caudales volumétricos (1, 1,5, 2, 5 y 10 µl/min) para determinar el grado de mezcla a la salida del canal de mezcla. La mezcla completa se indica mediante una concentración de solución homogénea en todo el ancho del microcanal, lo que produce una pendiente de cero para una gráfica de intensidad frente a distancia. En la Fig. 3B, un AMI de 0 indica una mezcla completa. A un caudal de 1 μL/min, el valor de AMI se calculó en 0,012 a un caudal de 1 μL/min. A mayores caudales, el AMI aumentó, lo que indica una mezcla incompleta, en la que la extensión de la mezcla disminuye a medida que aumenta el caudal. En general, la mezcla depende linealmente del caudal volumétrico (R2 = 0,93). Dada esta longitud de mezcla fija en el dispositivo, se midió la dependencia de la mezcla del caudal para asegurar una mezcla adecuada a 1 μL/min, como se muestra en la Fig. 3B.

Eficiencia de mezcla. (A) Imágenes de microscopía representativas que muestran la progresión de la mezcla de PBS y azul brillante FCF en PBS en las regiones de interés de entrada, media y salida dentro de los canales de mezcla a 10, 5, 2, 1,5 y 1 µL/min. (B) La pendiente del perfil de intensidad para indicar la eficiencia de mezcla en la región de salida del canal de mezcla en función del caudal volumétrico de perfusión. Índice de mezcla absoluto (AMI) calculado en la región de salida del canal de mezcla en función del caudal volumétrico de perfusión. Un valor de AMI de cero indica una mezcla completa.

Dado que la mezcla depende de la difusión, se espera que la eficiencia de la mezcla en función del caudal dependa del tamaño de la molécula, donde el peso molecular y el tamaño determinan la difusividad molecular34. Usamos Brilliant Blue FCF, que tiene un peso molecular (MW) de 792,9 g/mol para caracterizar la mezcla, que es más grande que la mayoría de los agentes quimioterapéuticos como se muestra en la Tabla 1. La mezcla completa de Brilliant Blue FCF disuelta en PBS se logró a 1 µL/min y el tiempo requerido para la difusión fue de 34,0 s. También se calculó el coeficiente de difusión y el tiempo requerido para la difusión a lo ancho del canal para varios quimioterapéuticos aprobados por la FDA: temozolomida, paclitaxel, doxorrubicina, carmustina y lomustina. Por ejemplo, según nuestros cálculos, la temozolomida, que tiene un diámetro más pequeño y una mayor difusividad que Brilliant Blue FCF, se difundiría a través del ancho del canal casi 2 veces más rápido. Este resultado implica que una tasa de flujo volumétrico superior a 1 µL/min aún podría conducir a una mezcla completa. Por otro lado, el paclitaxel, que es similar en tamaño y difusividad al azul brillante FCF, debería requerir un tiempo similar para difundirse a través del ancho del canal (31,2 s). Por lo tanto, se debe usar una tasa de flujo volumétrico de 1 µL/min para lograr una mezcla completa. En general, dado que todas las moléculas consideradas eran más pequeñas que el azul brillante FCF utilizado, anticipamos que la tasa de flujo volumétrico fisiológico de 1 µL/min sería suficiente para lograr una mezcla completa para la mayoría de los experimentos destinados a producir una dilución de concentración de moléculas pequeñas, como los quimioterapéuticos. .

Las concentraciones generadas por el MCGG se midieron perfundiendo 25 μM de Brilliant Blue FCF en PBS en la 'entrada al 100 %' y PBS en la 'entrada al 0 %' a 1 μl/min (Fig. 4A), lo que produjo concentraciones de 100 %:51%:26%:0% (Fig. 4B), similar a la dilución esperada de 100%, 50%, 25% y 0%. Las fracciones de dilución se interpolaron utilizando las intensidades de los microcanales al 100 % y al 0 % antes de la división (Fig. 4C). La intensidad en el canal A (más cercano a la entrada que contiene Brilliant Blue FCF en PBS) se ajustó al 100 %, mientras que la entrada que contenía PBS (Canal D) se ajustó al 0 %. La dilución de concentración generada experimentalmente fue como la dilución de concentración teórica predicha (Fig. 1B), con un valor R2 de 0,99, lo que demuestra aún más que la mezcla completa de los dos fluidos de perfusión se logró a 1 µL/min.

Generación de gradiente. (A) Esquema que indica los canales A–D, donde se midió el gradiente de concentración generado. (B) Concentraciones medidas a un caudal de 1 µl/min, donde el canal A contiene el 100 % de la concentración inicial de azul brillante FCF y el canal D contiene el 0 % de azul brillante FCF. (C) Imágenes representativas del gradiente de concentración en cada canal a un caudal de 1 l/min.

Se caracterizó la reproducibilidad de la carga de hidrogeles en los micropocillos, así como la similitud de la carga en todos los pocillos del dispositivo. El diseño de flujo continuo de los canales de carga facilita la carga constante de las celdas. La densidad numérica de las celdas y su ubicación deben ser estocásticas, siendo el ruido de disparo la principal fuente de variabilidad de carga sin una fuente de sesgo sistemático. Con el diseño de flujo continuo de los canales de carga, la concentración de las células debe ser la misma que en la solución mezclada homogéneamente original en ausencia de acumulación o agotamiento de las células. Para medir la reproducibilidad de la carga, se cargaron hidrogeles de PEGDA con células teñidas con DiOC encapsuladas en los micropocillos con una aguja de insulina y luego se expusieron a la luz ultravioleta para la gelificación. Como los cuatro micropocillos dentro de una columna se cargaron simultáneamente (Fig. 5A), se comparó la densidad promedio de las células dentro de los pocillos de una columna (Fig. 5B). Nuestros resultados indican que la reproducibilidad de la carga fue similar entre las 4 columnas, ya que no hubo una diferencia significativa en la mediana de la densidad celular para cada columna (Fig. 5C).

Reproducibilidad de carga celular. (A) Esquema del dispositivo de puertos y canales de carga y micropocillos de cultivo celular, donde cada columna de cámaras de cultivo celular está codificada por colores, comenzando con la columna 1 en azul. (B) Imágenes fluorescentes de las cámaras de cultivo celular cargadas con hidrogeles con células U87 atrapadas teñidas con DiOC. Barra de escala = 200 μm. (C) Densidad de células dentro de los micropocillos de cultivo celular de cada columna. (D) Imágenes de la parte inferior, un tercio, dos tercios y la parte superior de un hidrogel cuando se carga en un micropocillo de cultivo celular. Los hidrogeles se marcan con fluorescencia verde mediante la unión de ligandos modificados con FITC al PEG-Ac de 4 brazos. Barra de escala = 500 µm.

En un experimento separado, usamos PEG fluorescente (verde) cargado con perlas fluorescentes rojas para determinar si el hidrogel ocupaba todo el pozo de manera uniforme y si las perlas estaban distribuidas uniformemente a través de la profundidad del hidrogel. Las imágenes capturadas en toda la profundidad del pozo indicaron que el hidrogel llenó los micropocillos y las perlas fluorescentes permanecieron bien distribuidas en todo el hidrogel (Fig. 5D). Sin embargo, el gel verde parece no polimerizarse cerca de la pared del PDMS y la membrana, que son regiones con alta exposición al oxígeno durante la polimerización. Se sabe que el oxígeno inhibe la polimerización UV35 y que tiene una concentración elevada en PDMS36. Además, las moléculas hidrofóbicas pequeñas, como el fotoiniciador que se usa aquí, se difunden fácilmente en el PDMS, lo que posiblemente agote su concentración en la solución precursora del gel, lo que también podría explicar el "halo" que se ve en la proximidad de las paredes del PDMS. Esta forma de estructura de hidrogel aumenta el área superficial a través de la cual puede ocurrir el intercambio de soluto, pero no altera la cantidad total de soluto que se puede intercambiar, que está determinada por el flujo volumétrico a través de la capa de perfusión. Dependiendo de la aplicación exacta, esta forma de hidrogel puede ser beneficiosa o perjudicial. El trabajo futuro investigará métodos para reducir la concentración de oxígeno en el PDMS antes de la polimerización utilizando métodos no citotóxicos. Hemos desarrollado métodos para polimerizar completamente tapones de hidrogel dentro de microcanales PDMS37 pero no hemos probado la citotoxicidad de este protocolo. Tenga en cuenta que cuando se cargó un gel de PEG-Ac de 4 brazos, que polimeriza mediante la adición de tipo Michael, en los pocillos de cultivo celular, se polimerizó por completo, incluso en las inmediaciones de las paredes del PDMS (Fig. S5 complementaria) porque la polimerización mediante La adición de tipo Michael no se ve afectada por el oxígeno y no depende de un iniciador de molécula pequeña. Estos datos también mostraron que se puede acomodar una variedad de matrices de hidrogel con el dispositivo actual.

Un desafío de cargar celdas en dispositivos de microfluidos en general es eliminar las burbujas de aire que pueden quedar atrapadas en los micropocillos durante la carga. Para evitar las burbujas de aire, otros han cargado primero el sistema con agua y luego lo han desgasificado38. Elegimos cargar el dispositivo en seco (no precargado con agua) para eliminar la dilución de la solución precursora del gel con agua. Las burbujas de aire son una ocurrencia rutinaria en los dispositivos microfluídicos39,40. Si bien mostramos que en nuestro sistema, las burbujas no afectaron negativamente la viabilidad celular (consulte la Fig. S7 complementaria), podrían crear diferencias entre las cámaras de cultivo celular replicadas. Una mejora que podría considerarse en el futuro sería cambiar la geometría de los microcanales dentro del dispositivo39 para eliminar la esquina afilada entre los canales de carga y los depósitos. Las esquinas afiladas actuales presentes tanto en la capa de carga como en la de perfusión podrían atrapar aire, ya que el ángulo de la esquina es menor que el ángulo de contacto del líquido de llenado, lo que crea una situación de menor humectabilidad.

En primer lugar, determinamos el tiempo que tardaría una molécula pequeña (p. ej., quimioterapéutico) perfundida en difundirse en el hidrogel y alcanzar la misma concentración que el canal de perfusión. Para medir esta difusión, usamos un fluoróforo Atto 655 (887 g/mol) para modelar la difusividad de un fármaco de molécula pequeña como TMZ (194 g/mol) o BCNU (214 g/mol), lo que nos permitió medir la difusión. Coeficiente in situ y en tiempo real usando FCS (Figura complementaria S6). Los coeficientes de difusión del fluoróforo Atto 655 en medios, así como en hidrogeles PEGDA, se midieron en 4,25 × 10–6 y 2,55 × 10–6 cm2/s, respectivamente. Como era de esperar, el coeficiente de difusión en los medios fue significativamente mayor que en el hidrogel, lo que podría explicarse por la obstrucción física, como mostramos anteriormente41. Con los coeficientes de difusión medidos, usamos la ley de difusión de Fick para determinar si TMZ o BCNU podían penetrar en el hidrogel y cuánto tiempo tardarían los fármacos en alcanzar la concentración deseada dentro del gel. Modelamos la concentración de TMZ (a una concentración inicial de 2 mM) y la concentración de BCNU (a una concentración inicial de 10 µM) en función del tiempo (hasta 48 h) a una profundidad de hidrogel de 250 µm (el grosor del gel dentro del micropocillo). Se encontró que la concentración del fármaco era > 1,9 mM en 1 h y > 1,95 mM en 4 h después de la adición de TMZ y > 9,5 µM en 1 h después de la adición de BCNU, lo que indica que durante 48 h de exposición, todas las células deben estar igualmente expuestas a ambos fármacos .

A continuación, probamos la susceptibilidad de las células U87 a dos fármacos diferentes, a saber, TMZ y BCNU, en dos hidrogeles de PEG diferentes. TMZ es el tratamiento estándar actual y BCNU se usa como adyuvante o en combinación con TMZ. Ambos fármacos están aprobados para el tratamiento del glioblastoma y ambos son agentes alquilantes conocidos por inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis42. Los dos geles eran PEGDA y el gel de PEG-Ac de 4 brazos modificado con RGD degradable enzimáticamente. El gel PEGDA, formado mediante fotopolimerización UV, no es degradable e inerte, por lo que no se esperaba que las células interactuaran con él. Sirvió solo como andamiaje y las células encapsuladas en él durante hasta 4 días mantuvieron una alta viabilidad (> 90%) (Figura complementaria S7A) pero permanecieron redondas (Figura complementaria S7B). El gel de PEG-Ac de 4 brazos es degradable y adhesivo celular, y las células pudieron interactuar con el hidrogel y remodelarlo con el tiempo, como lo demuestra la propagación celular en el día 4 y la viabilidad celular > 95 % (Figura complementaria S7).

Tras el tratamiento con TMZ 0, 0,5, 1 y 2 mM, se encontró que las células U87 encapsuladas con PEGDA tenían viabilidades de 86,4 ± 1,9 %, 75,0 ± 1,2 %, 34,0 ± 7,7 % y 15,8 ± 5,7 %, respectivamente (Fig. 6A,B). Se estimó que la EC50 (concentración efectiva necesaria para destruir el 50 % de las células) era de ~ 0,61 mM de TMZ calculada mediante un ajuste de curva sigmoidal (R2 = 0,983). Las células fueron menos susceptibles a TMZ cuando se encapsularon en el hidrogel de PEG-Ac de 4 brazos adhesivo degradable (Fig. 6C, D). La viabilidad celular fue del 95,6 ± 1,2 %, 83,9 ± 12,9 %, 59,1 ± 6,1 % y 44,0 ± 8,2 % para TMZ 0, 0,5, 1 y 2 mM, respectivamente, y la EC50 fue ~ 1,8 mM (R2 = 0,901). Este resultado no fue sorprendente ya que la unión de integrinas se ha implicado previamente en la resistencia a los medicamentos de las células de glioblastoma43,44,45, y hemos mostrado resultados similares anteriormente para los esferoides de glioblastoma46. La EC50 para las células U87 encapsuladas en un hidrogel PEGDA y tratadas con BCNU fue ~ 8,2 µM (R2 = 0,952) (Fig. 6E, F). Como era de esperar para todas las condiciones, la EC50 estimada fue más alta en comparación con el cultivo en monocapa 2D, pero similar a lo informado por otros para las células GBM encapsuladas en hidrogel2. Las células muertas eran visibles en todo el gel después de 48 h de exposición para todas las condiciones, lo que sugiere que el microambiente dentro de los geles era homogéneo (Fig. 6A, C, E).

Respuesta a fármacos. (A) Imágenes representativas de células vivas/muertas U87 tras el tratamiento con TMZ y (B) viabilidad celular en función de la concentración de TMZ (n = 3) para células sembradas en un gel PEGDA no adhesivo y no degradable. (C) Imágenes representativas de células U87 vivas/muertas tras el tratamiento con TMZ, y (D) viabilidad celular en función de la concentración de TMZ (n = 3) para células sembradas en un gel de PEG-Ac de 4 brazos degradable y adhesivo. (E) Imágenes representativas de células vivas/muertas U87 tras el tratamiento con BCNU y (F) viabilidad celular en función de la concentración de BCNU (n = 3) para células sembradas en un gel PEGDA no adhesivo y no degradable. Todas las células se tiñeron con DiOC (verde) y las células muertas se tiñeron con PI (rojo). La barra de escala es de 200 µm.

Nuestros resultados sugieren que el dispositivo podría usarse para probar el efecto de las interacciones célula-matriz en la capacidad de respuesta celular a factores solubles, como los quimioterapéuticos, donde el agente terapéutico podría penetrar fácil y homogéneamente en los hidrogeles sembrados con células. Si bien no se explora aquí, el dispositivo podría adaptarse para su uso con diferentes células y cocultivos celulares y evaluar sus respuestas a diferentes moléculas solubles. Dado que el diseño incluye células encapsuladas en hidrogel, podría usarse para estudiar el efecto de las interacciones célula-matriz y célula-célula en la respuesta celular a factores solubles, como la terapia en un entorno fisiológicamente relevante que incluye perfusión y permite la formación de concentración. diluciones.

En este estudio, diseñamos un dispositivo microfluídico de detección de drogas que incorpora micropocillos llenos de células encapsuladas en hidrogel. El dispositivo presentaba canales de alivio para permitir la carga de hidrogel sin interrupciones y pozos cubiertos con membrana para evitar la contaminación y el bloqueo del canal de perfusión. Caracterizamos la eficiencia de mezcla del dispositivo usando PBS simple y azul brillante FCF y determinamos que un caudal fisiológico de 1 µl/min era el caudal óptimo para lograr una mezcla completa. Usando la ecuación de Stoke y la segunda ley de difusión de Fick, determinamos la cantidad de tiempo requerida para la difusión de los quimioterapéuticos de uso común a través del ancho del canal de mezcla. A la tasa de flujo óptima, la dilución de concentración generada dentro del dispositivo fue comparable a la dilución de concentración esperada. Determinamos además que los procedimientos de carga eran altamente reproducibles ya que la densidad media de las células encapsuladas en hidrogel para cada columna de pocillos era similar para los cuatro pocillos y las células permanecían bien distribuidas por todo el hidrogel. Probamos dos tipos de hidrogel, un PEGDA reticulable por UV y un PEG-Ac de 4 brazos reticulable por adición de tipo Michael, lo que indica que el dispositivo puede adaptarse a una variedad de mecanismos de gelificación. Se destacó un ensayo de detección de fármacos mediante la generación de una curva dosis-respuesta para las células de glioblastoma U87 tratadas con temozolomida y carmustina, quimioterapéuticos de referencia. Una limitación del dispositivo actual es que contiene una matriz de 4 × 4 de pocillos de cultivo celular, pero se podría usar una matriz de 8 × 8 en el futuro para probar múltiples condiciones al mismo tiempo y obtener 7 diluciones (incluida una sin fármaco/soluble). control de moléculas) para construir curvas robustas de dosis-respuesta. Los dispositivos de microfluidos, como el desarrollado aquí, que incorporan células, una matriz y perfusión, son una imitación cercana de los entornos celulares nativos y representan una técnica simple y económica que permite la detección de fármacos multiplexados.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Saint Louis, St Louis, MO, 63103-2010, EE. UU.

Allison Clancy, Joseph Bruns, Jahnavi Nadella, Samuel Stealey y Sylvia P. Zustiak

Departamento de Bioingeniería y Bioquímica y Biofísica, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Dayi Chen, Yanjia Zhang y Aaron Timperman

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AT y SZ concibieron la idea, diseñaron el proyecto y supervisaron y financiaron la investigación. AC y SZ escribieron el primer borrador del manuscrito. DC fabricó dispositivos microfluídicos bajo la dirección de ATJB y AC preparó las Figs. 1, 5 y la figura complementaria S5. DC, AC e YZ prepararon la Fig. 2 y las Figs. complementarias. S1–S4. AC, JN y SS prepararon las Figs. 3 y 4. SS preparado Fig. S6. JB preparó la figura S7. Todos los autores contribuyeron y revisaron el texto principal del manuscrito.

Correspondencia a Aaron Timperman o Silviya P. Zustiak.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Clancy, A., Chen, D., Bruns, J. et al. Dispositivo microfluídico a base de hidrogel con cultivo celular in vitro 3D multiplexado. Informe científico 12, 17781 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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Recibido: 01 Junio ​​2022

Aceptado: 14 de octubre de 2022

Publicado: 22 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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