Estudio de microfluidos en un medidor

Jun 02, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19553 (2022) Citar este artículo

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La precipitación de carbonato de calcio (CaCO3) inducida por microbios (MICP) es una de las principales alternativas sostenibles a la cementación artificial de medios granulares. MICP consiste en inyectar secuencialmente soluciones ricas en bacterias y calcio en el suelo para formar enlaces de calcita entre las partículas del suelo que mejoran la resistencia y la rigidez de los suelos. El rendimiento de MICP se rige por los procesos subyacentes a microescala de crecimiento bacteriano, transporte reactivo de solutos, velocidades de reacción, nucleación y crecimiento de cristales. Sin embargo, el impacto de la heterogeneidad de la escala de poros en estos procesos durante MICP no se comprende bien. Este documento arroja luz sobre el efecto de la heterogeneidad de la escala de poros en la evolución espaciotemporal de MICP, la eficiencia general de la reacción química y la evolución de la permeabilidad mediante la combinación de dispositivos microfluídicos de dos metros de largo de dimensiones y porosidad idénticas con redes porosas homogéneas y heterogéneas y monitoreo en tiempo real. . Los dos chips recibieron, por triplicado, tratamiento MICP con un flujo impuesto y las mismas condiciones iniciales, mientras que las presiones de entrada y salida fueron monitoreadas periódicamente. Este documento propone un flujo de trabajo integral destinado a detectar bacterias y cristales a partir de datos de microscopía de lapso de tiempo en múltiples posiciones a lo largo de una réplica microfluídica de medios porosos tratados con MICP. Los cristales de CaCO3 se formaron 1 hora después de la introducción de la solución de cementación (CS) y el crecimiento de los cristales se completó 12 horas después. La tasa promedio de crecimiento de cristales fue en general más alta en el medio poroso heterogéneo, mientras que se volvió más lenta después de las primeras 3 h de inyección de cementación. Se encontró que la eficiencia de reacción química promedio presentó un pico de 34% en la mitad del chip y se mantuvo por encima del 20% antes de los últimos 90 mm del camino reactivo para la red porosa heterogénea. El medio poroso homogéneo presentó una eficiencia de reacción promedio más baja en general, que alcanzó un máximo de 27 % 420 mm aguas abajo de la entrada y se mantuvo por debajo del 12 % para el resto del canal microfluídico. Estas diferentes tendencias de eficiencia química en las dos redes se deben a un mayor número de cristales de mayor diámetro promedio en el medio heterogéneo que en el medio poroso homogéneo. En el intervalo entre 480 y 900 mm, el número de cristales en el medio poroso heterogéneo es más del doble del número de cristales en el medio poroso homogéneo. Los diámetros promedio de los cristales fueron de 23 a 46 μm en el medio poroso heterogéneo, en comparación con 17 a 40 μm en el medio poroso homogéneo en todo el chip. La permeabilidad del medio poroso heterogéneo se vio más afectada que la del sistema homogéneo, mientras que los sensores de presión capturaron efectivamente una mayor disminución de la permeabilidad durante las dos primeras horas cuando se formaron los cristales y una disminución menos prominente durante el posterior crecimiento de la semilla. cristales existentes, así como la nucleación y crecimiento de nuevos cristales.

Durante la última década, la precipitación con carbonato de calcio (CaCO3) inducida por microbios (MICP) ha surgido como una alternativa sostenible a la estabilización de suelos tradicional basada en el cemento Portland común1. MICP se ha estudiado para una variedad de posibles aplicaciones de ingeniería, como la mejora del suelo para aumentar la rigidez y la resistencia2,3,4 de los suelos granulares, comúnmente conocida como biolechada5; inmovilización de metales pesados ​​y radionúclidos6; Secuestro de CO27 y sellado de fracturas en pozos de secuestro de CO2 para mitigar fugas8. La MICP basada en ureólisis, que es el mecanismo más estudiado, ocurre en dos etapas. En la primera etapa, los microorganismos ureolíticos del suelo, es decir, las bacterias que secretan la enzima ureasa, catalizan la hidrólisis de la urea (Ec. 1). Esta reacción produce iones de amonio (NH4+) que aumentan el pH del microambiente, así como iones de carbonato (CO32–). En consecuencia, la alcalinidad favorece la precipitación de CaCO3 en presencia de suficientes iones de calcio (Ec. 2):

El microorganismo más utilizado en los estudios de MICP mediante ureólisis es Sporosarcina pasteurii (S. pasteurii) (designación de cepa ATCC 11859) porque es una cepa no patógena que ha demostrado una actividad de ureasa más alta que muchas otras cepas9. Sporosarcina pasteurii pertenece al género Bacillus, que se caracteriza por ser una bacteria Gram positiva, formadora de endosporas y aerobia10. Las células tienen un potencial zeta negativo que atrae iones de calcio, favoreciendo así la nucleación heterogénea11. La nucleación heterogénea o sembrada se refiere a la precipitación en superficies como células, burbujas de gas12 y minerales13,14, que reducen las barreras de energía que se requieren para la nucleación y aumentan la tasa de nucleación. Por el contrario, la nucleación homogénea se refiere a la precipitación de CaCO3 a partir de soluciones de cristalización. Por tanto, el mecanismo de precipitación en MICP puede ser inducido de dos formas diferentes: (i) por bacterias que actúan como sitios de nucleación, es decir, vía precipitación epicelular, y (ii) por el aumento del pH alrededor de las células ureolíticas debido a la mencionada urea. reacción de hidrólisis15.

El CaCO3 precipitado llena los espacios porosos de los medios granulares y, lo que es más importante, los dota de verdadera cohesión al unir los granos del suelo, lo que en última instancia conduce a una mayor resistencia al corte y rigidez2. La precipitación de CaCO3 disminuye la porosidad y la permeabilidad de los suelos. La disminución de la permeabilidad debido al tratamiento con MICP es de menos de 1 a 3 órdenes de magnitud en la mayoría de los casos, lo cual es una ventaja de MICP en comparación con las lechadas químicas que pueden reducir la permeabilidad hasta 8 órdenes de magnitud16.

La entrega uniforme de reactivos a distancia es importante para la remediación de grandes zonas objetivo en la aplicación de campo de MICP17,18. Una tasa de precipitación más alta puede provocar obstrucciones cerca del punto de inyección, mientras que con una tasa de precipitación más baja, se puede lograr una mayor uniformidad. Las concentraciones químicas variables de urea y cloruro de calcio en la solución de cementación (CS) afectan la tasa de precipitación y los patrones que causan heterogeneidades a microescala. Los tamaños, formas y distribución espacial del CaCO3 precipitado en el espacio poroso pueden causar diferencias en la permeabilidad y resistencia a macroescala de los suelos biocementados19. Por ejemplo, Al Qabany y Soga19 demostraron que para CS altamente concentrado de cloruro de calcio-urea 1 M19, se formaron cristales más grandes que obstruyeron los poros, lo que provocó una disminución más rápida de la permeabilidad y la falta de homogeneidad de la precipitación. Otro factor que afecta la tasa de precipitación es el tamaño y la gradación de las partículas del suelo17. La precipitación de CaCO3 es más eficaz en los contactos de partículas17. Mortensen et al. 17 informaron una mayor tasa de precipitación en arenas densas bien graduadas y más gruesas que en suelos sueltos, más finos y mal graduados, lo que se atribuyó predominantemente a las propiedades intrínsecas del material base sujeto a MICP.

La eficiencia de la reacción química, que se define como el porcentaje de calcio y urea inyectados que se convierte en CaCO3, es un parámetro importante a controlar durante la aplicación a escala de campo de MICP para evitar el desperdicio de materias primas20. Al Qabany et al.21 investigaron los factores que afectan la eficiencia a escala de la columna, como la concentración química en el CS, la duración del tratamiento y la tasa de entrada efectiva, que se definió como la relación entre la concentración química y la ausencia de flujo. tiempo permitido para la reacción (el tiempo de retención). Se encontró que para una OD600 de 0,8–1,2, la tasa de entrada efectiva de 0,042 mol/L/h dio como resultado una eficiencia de reacción superior al 80 % para todas las muestras de arena, independientemente de la concentración química utilizada (0,25–0,5–1 M de urea -cloruro de calcio). Zeng et al.22 informaron una eficiencia química muy baja del 5% en un experimento a escala de campo, que se atribuyó a las rutas de flujo preferenciales, que canalizan los reactivos a zonas específicas de la matriz del suelo (lentes de arena).

Tradicionalmente, las muestras biocementadas se observan mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), que requiere un muestreo destructivo posterior al tratamiento para proporcionar información cualitativa detallada sobre el tejido y la textura de los suelos biocementados23. En los últimos años, se han desarrollado configuraciones experimentales que combinan microfluidos e imágenes para probar procesos a microescala de MICP23,24,25,26,27,28,29 y precipitación de calcita inducida enzimáticamente (EICP)30,31 en tiempo real. Los dispositivos microfluídicos integran redes porosas (conocidas como laboratorio en un chip) y facilitan la obtención de imágenes y el seguimiento. Permiten la visualización de procesos de transporte a microescala debido a su transparencia y pequeño espesor y se utilizan comúnmente para aplicaciones en investigación biomédica32, investigación de monitoreo de agua33, transporte de bacterias en medios porosos34 y recuperación mejorada de petróleo35. Otra tecnología que se ha movilizado para estudiar la nucleación y el crecimiento de monocristales es la microfluídica de gotas36. Mediante el uso de esta configuración, los autores pudieron probar la encapsulación de células por cristales, lo cual es fundamental en términos de disponibilidad de células activas para la continuación de la ureólisis. Teniendo en cuenta lo anterior, el uso de un lab-on-a-chip para estudios MICP permite una serie de observaciones en tiempo real, que incluyen (i) cuantificación de bacterias, (ii) cuantificación de cristales de CaCO3 y (iii) determinación de sus formas.

Xiao et al.27 utilizaron un chip microfluídico en forma de Y hecho de polidimetilsiloxano (PDMS) con dos puertos de entrada para la inyección simultánea de la suspensión bacteriana (BS) y CS que convergieron en un canal microfluídico de reacción de red de poros homogéneos . Las imágenes capturadas en un área de 2,8 mm por 4,5 mm (ancho x largo) del chip mostraron que el CaCO3 precipitó primero en el lado de la inyección de BS y luego en el lado de la inyección de CS. Además, el efecto de diferentes concentraciones de cloruro de calcio en la difusión y movilidad de las bacterias, la cinética de crecimiento de cristales y la distribución de cristales en MICP se exploraron en el estudio de Xiao et al.29. Los resultados mostraron que una concentración de 0,5 M redujo la movilidad de las bacterias, restringiéndolas al lado de inyección de BS. Por otro lado, con una concentración de 0,01 M, se logró una distribución más homogénea de bacterias en todo el ancho del chip al final del tratamiento MICP, lo que también condujo a una distribución más homogénea de cristales.

Wang et al.24,25,26,28 utilizaron un microfluídico PDMS con dimensiones de 15 mm por 15 mm, diseñado en base a las imágenes transversales de un suelo arenoso 3D Ottawa 30–50 solidificado y seccionado. Wang et al.26 demostraron que una mayor densidad bacteriana dio como resultado un mayor número general de cristales y una tasa de crecimiento de cristales más rápida. Más precisamente, la densidad bacteriana más alta (~5,2 × 108 células/mL) produjo 2 × 107 cristales/mL, con un volumen de cristal promedio de 450 μm3, mientras que la densidad bacteriana más baja (~0,6 × 108 células/mL) produjo una menor cantidad de cristales (1.1 × 106 cristales/mL) pero un volumen promedio mayor de 8000 μm3. El crecimiento de cristales concluyó a las 1,5 h cuando la densidad bacteriana era de 5,2 × 108 células/mL, mientras que una concentración bacteriana 10 veces menor dio como resultado 15 h de crecimiento de cristales. Wang et al.28 realizaron el primer intento publicado de utilizar los resultados de experimentos de microfluidos para optimizar los experimentos de columna. Más específicamente, los experimentos de microfluidos proporcionaron información sobre el tamaño y la cantidad de cristales para intervalos de inyección bajos (3–5 h) y altos (24 h) que también se observaron en los experimentos de columna y fueron críticos para la eficiencia del proceso de MICP y el resistencia mecánica de los suelos tratados.

Kim et al.30 utilizaron un dispositivo microfluídico de vidrio homogéneo, con dimensiones de 21,3 mm por 12,7 mm y exploraron la cinética de precipitación para el tratamiento multiciclo con EICP. Un algoritmo integral de análisis de imágenes para segmentar la estructura de poros y el CaCO3 precipitado. Hasta donde sabemos, el trabajo de Kim et al.30 es el primero en comparar la tasa de nucleación observada durante el experimento en el micromodelo, que simula las condiciones de mala mezcla en un medio poroso homogéneo, con la nucleación predicha. tasa basada en la teoría clásica de la nucleación. Dado que la microfluídica solo permite obtener imágenes en 2D, se tuvieron que hacer suposiciones con respecto a la forma de los cristales (esféricos y semiesféricos) para evaluar el crecimiento de los cristales en tres dimensiones. Weinhardt et al.31,37 presentaron una configuración experimental para la medición robusta de la presión en canales microfluídicos PDMS de geometrías de estructura de poros cuasi 1D y cuasi 2D y pocos mm de longitud durante la precipitación de CaCO3 a través de EICP y observaron la influencia de la geometría en la porosidad-permeabilidad relación. El uso de tomografía microcomputarizada de rayos X (XRCT), que resuelve la tercera dimensión de los precipitados de CaCO3 después del final del tratamiento EICP, sugirió que las formas esferoidal y frustum se pueden usar para calcular el volumen de CaCO3 precipitado a partir de proyecciones 2D.

Aunque los estudios anteriores han visualizado una variedad de estrategias de inyección de BS y CS con diferentes intervalos de inyección, densidades bacterianas y concentraciones de CS en dominios microfluídicos de diferentes geometrías en tiempo real, están limitadas a un área de unos pocos mm2. Sin embargo, MICP es un fenómeno de transporte reactivo durante el cual los reactivos se consumen a cierta distancia del punto de inyección y la tasa de desprendimiento de bacterias puede diferir con la distancia. Además, se espera que la heterogeneidad de la escala de poros afecte la distribución espacial de los reactivos debido a las zonas de mayor velocidad que pueden transferir bacterias a distancias más largas. Hasta donde sabemos, aún no se ha estudiado el impacto de la heterogeneidad de la escala de poros en la eficiencia de la reacción química de MICP.

El objetivo de este artículo fue investigar el efecto de la heterogeneidad de la escala de poros en la eficiencia de la reacción química de MICP. Se fabricaron dos tipos de microfluidos de un metro de largo con la misma porosidad inicial: microfluidos homogéneos y heterogéneos. Este trabajo presenta una nueva configuración experimental para la evaluación de la eficiencia de la reacción química y la comparación del efecto de la masa de CaCO3 precipitada producida sobre la permeabilidad de medios porosos homogéneos y heterogéneos. La precipitación de CaCO3 fue monitoreada tanto temporal como espacialmente en diferentes lugares a lo largo del camino de un metro de largo, ofreciendo información sobre la escala de poros. Se desarrolló un algoritmo de procesamiento de imágenes para analizar las imágenes experimentales y detectar el número de bacterias, así como la nucleación y crecimiento de minerales precipitados individuales y aglomerados con respecto al tiempo de reacción y distribución espacial. Con base en las imágenes procesadas, se realizó un análisis estadístico integral para estimar la distribución de bacterias y cristales a lo largo de todo el chip que abarca más de diez mil poros para identificar patrones de precipitación distintivos para las dos geometrías.

Para evaluar el efecto de la heterogeneidad de la escala de poros, desarrollamos una configuración experimental integral (Fig. 1a) que utiliza un dispositivo de microfluidos muy largo que cubre varios órdenes de magnitud en el tamaño promedio de los poros que colocamos en un portaobjetos de vidrio de microscopio de 75 mm por 50 mm, como se muestra en la Fig. 1b, c. La misma estrategia de inyección se aplicó a dos geometrías microporosas diferentes con la misma porosidad (n = 0,5) por triplicado: una homogénea (mismo tamaño de poro en toda la viruta) y otra heterogénea, es decir, con distancias entre granos espacialmente variables. La primera geometría consistía en una red regular de granos sólidos cilíndricos idénticos, con un tamaño de garganta de poro (λ1) igual a 50 μm (Fig. 1b), mientras que la segunda geometría consistía en granos sólidos distribuidos irregularmente, con tamaños de garganta de poro que oscilaban entre 25 a 350 μm, con un promedio de λ2 = 70 μm (Fig. 1c)38. Estos medios porosos artificiales tienen L = 990 mm de largo, W = 3 mm de ancho y H = 0,050 mm de espesor, lo que corresponde a L = 19800 λ1, W = 60 λ1 y H = λ1 para el medio poroso homogéneo y L = 14143 λ2, W = 43 λ2 y H = 0.7λ2 para el medio poroso heterogéneo.

( a ) Representación esquemática de la configuración experimental. La estrategia de inyección implica (1) la inyección de agua Milli-Q desde la salida, (2) la inyección de BS desde la salida y (3) la inyección de CS desde la entrada. PS1 y PS2 indican los sensores de presión conectados en la entrada y la salida, respectivamente. Creado con BioRender.com; (b) diseño microfluídico de un medio poroso homogéneo; (c) diseño microfluídico de un medio poroso heterogéneo.

Los chips de microfluidos se fabricaron utilizando un proceso de fotolitografía suave estándar. El dispositivo PDMS fue producido de acuerdo con el protocolo descrito por Karadimitriou y Hassanizadeh39. La base de PDMS se mezcló a fondo con el agente de curado en una proporción de 10:1. Posteriormente, la mezcla se desgasificó al vacío antes de verter en el molde y curar durante al menos 4 h en el horno a 60 °C. Después de retirar el canal microfluídico de PDMS del molde, se perforaron entradas y salidas de 1,2 mm de diámetro. Tanto el chip PDMS como la cubierta de vidrio se trataron con plasma, lo que hace que la superficie del PDMS sea hidrófila26 como la arena. Luego, el chip se unió a la cubierta de vidrio y se colocó en una placa caliente a 100 °C durante al menos 30 minutos para garantizar una unión fuerte y permanente. Posteriormente, el chip de microfluidos se colocó en un desecador para desgasificar el PDMS durante aproximadamente 30 minutos, lo que garantiza la eliminación de las burbujas absorbidas por el PDMS durante la saturación del chip. Como material ligeramente permeable a los gases, el PDMS permite el crecimiento aeróbico de S. pasteurii. Sin embargo, cuando los experimentos duran mucho tiempo, el agua puede evaporarse40. Por lo tanto, se eligió una estrategia de inyección para que los experimentos duraran menos de 24 h.

En el estudio actual, medio de crecimiento microbiano líquido (American Type Culture Collection (ATCC) 1376), que constaba de 20 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de sulfato de amonio y 0,13 mol/L de solución acuosa de tampón Tris con un pH inicial de 9, esterilizados por separado y luego mezclados. Sporosarcina pasteurii almacenada a -80 °C se inoculó en 4 ml de medio de crecimiento ATCC 1376 fresco. Las células bacterianas se cultivaron en una incubadora con agitación a 180 rpm a 30 °C durante 48 h para alcanzar condiciones estacionarias. La densidad óptica (OD) se midió con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm (OD600). La suspensión bacteriana (BS) utilizada en los estudios de microfluidos se obtuvo diluyéndola41 para alcanzar una densidad óptica de 0,4–0,55. Se preparó una solución de cementación (CS) diluyendo concentraciones equimolares (1 mol/L) de urea (CH4N2O) con una molaridad de 60,06 g/mol y cloruro de calcio (CaCl2) (anhidro Sigma-Aldrich) con una molaridad de 110,98 g/ mol en agua Milli-Q.

Los experimentos se realizaron en un ambiente bien controlado con una temperatura de 25 ± 1 °C. A continuación, explicamos en detalle la estrategia de inyección, que consta de tres inyecciones secuenciales: (i) saturación del chip con agua MIlliQ, (ii) inyección de BS e (iii) inyección de CS, durante las cuales se modifica ligeramente la configuración experimental. como se explica a continuación (Fig. 1a). Inyectar BS y CS usando el mismo tubo daría como resultado la mezcla de las dos soluciones y, posteriormente, la ureólisis y la precipitación dentro del tubo, que tiene una sección transversal más grande en comparación con la configuración de microfluidos. Por lo tanto, la precipitación resultante no sería representativa de la distribución espacial a lo largo de la distancia de 1 m. Por lo tanto, el agua Milli-Q utilizada y el BS se inyectaron desde la salida del canal de microfluidos ("salida" en la Fig. 1b, c), mientras que el CS se inyectó desde la entrada ("entrada" en la Fig. 1b, c). ). Los sensores de presión de alta precisión (Elveflow MPS-S-1 con un rango de trabajo de 340 mbar en la entrada y Elveflow MPS-S-0 con un rango de trabajo de 70 mbar en la salida) se colocaron en serie al flujo cerca de 7 cm de la entrada y 4 cm de la salida. Los sensores permitieron estimar la diferencia de presión entre los dos puntos en condiciones de flujo durante la inyección de CS, así como durante la fase de retención y precipitación sin flujo. Los sensores de presión se fijaron en la platina del microscopio con cinta y se conectaron a un controlador de presión Elveflow OB142. El chip de microfluidos desgasificado se colocó horizontalmente en el escenario.

La Tabla 1 presenta la composición de BS y CS y la estrategia de inyección seleccionada. Para la saturación del chip microfluídico con agua Milli-Q, el sensor de presión cerca de la salida se conectó a la salida y a una jeringa de vidrio (Hamilton) con agua Milli-Q de 1 a 10 ml montada en una bomba de jeringa (Harvard Apparatus ), mientras que la entrada permaneció abierta al aire. Para todas las conexiones se utilizó tubería Tygon de 1/16″. El chip se saturó con dos volúmenes de poro de agua Milli-Q a un caudal de 0,2 μL/s. Al final de la inyección, se observó una pequeña burbuja de agua en la entrada para que el aire no penetrara en el chip microfluídico. Posteriormente, se permitió un intervalo de tiempo de 30 min hasta el siguiente paso para que las burbujas de gas fueran absorbidas por el PDMS.

Después de la saturación completa del chip microfluídico, se inyectó BS desde la salida. Para este propósito, la jeringa que contenía el agua Milli-Q fue reemplazada por una jeringa de vidrio Hamilton de 5 mL que contenía BS. La inyección bacteriana de 500 μL (aproximadamente 7 volúmenes de poro de chip de 75 μL) duró 40 min para lograr una distribución aproximadamente homogénea de las bacterias a lo largo de todo el chip.

Al final de la fase de inyección bacteriana, mientras las células se asentaban, se seleccionaron diecinueve posiciones a lo largo del canal para las observaciones. Este paso tuvo una duración aproximada de 1 h, que fue necesaria para fijar las posiciones y focos de las 19 localizaciones diferentes. Durante este tiempo, las células crecieron desde la DO600 inicial de 0,40 a 0,55 antes de la inyección. Por lo tanto, capturamos imágenes en t = 0, que corresponde al inicio de la inyección de cementación y puede representar la concentración bacteriana inicial. Para inyectar CS desde la entrada, primero se retiró con cuidado la jeringa de vidrio conectada a la salida y se colocó el tubo de salida en un tubo Falcon de 50 ml para la recolección de efluentes. El tubo Falcon contenía 50 ml de agua Milli-Q y se cubrió con parafilm y papel de aluminio durante las condiciones de inyección y sin flujo para evitar la evaporación y asegurar un flujo constante/sin flujo, respectivamente. La hidrólisis de la urea comenzó en la entrada tan pronto como el tubo que contenía el CS se conectó al dispositivo de chip, ya saturado con BS. Luego, se montó una jeringa Hamilton de vidrio de 10 ml en la bomba de la jeringa y se conectó a través del sensor de presión al tubo de entrada (Fig. 1a). Antes de conectar la tubería de entrada al canal, se saturó por completo para que apareciera una gota de líquido en el extremo de la tubería para garantizar la saturación total al momento de la conexión. La inyección de cementación se realizó con un caudal de 0,018 μL/s, lo que corresponde a una velocidad de filtración de 0,24 mm/s, igual a la velocidad de filtración calculada para una muestra de arena preparada en laboratorio con una altura de 10 cm y un diámetro de 5 cm. , y porosidad de 0,4, que se inyectó a un caudal de 10 mL/min4. El tiempo de retención de CS fue de 12 a 24 h. El caudal aplicado corresponde a un número de Reynolds de \(Re = \frac{{\rho \overline{\lambda }\overline{u}}}{\mu } \ll 1\) (Tabla S1), donde \( \uprho\) es la densidad del agua (kg m−3), \(\overline{\lambda }\) es el tamaño promedio de la garganta del poro (m), \(\overline{u}\) es la velocidad promedio del fluido ( ms−1) y \(\mu\) es la viscosidad dinámica del agua (kg m−1 s−1). Por lo tanto, el flujo en la viruta se puede caracterizar como flujo progresivo, también conocido como flujo de Stokes, que está dominado por fuerzas viscosas. Se inyectaron 6 volúmenes de poro de chip de CS durante 6,75 h, período durante el cual se capturó la nucleación y el crecimiento de cristales bajo el suministro de solución fresca y continuó durante el período de retención. A modo de comparación, Xiao et al.29 informaron que un solo paso de inyección constaba de 7 volúmenes de poros de chip, mientras que Kim et al.30 implementaron un tratamiento de 10 ciclos en el que cada ciclo constaba de aproximadamente 100 volúmenes de poros y se repetía a intervalos de 48 h. Sin embargo, estos trabajos se refieren a chips mucho más cortos y la inyección de un solo volumen de poro requiere solo unos minutos.

Las imágenes de lapso de tiempo se realizaron con un microscopio Nikon Eclipse Ti2 invertido totalmente automatizado (objetivo de contraste de fase Plan Fluor 10 ×) equipado con una cámara digital en color Nikon DS-Ri2 y controlado por el software NIS-Elements. Se registraron imágenes grandes, compuestas por 9 imágenes en mosaico con un tamaño de 8813 píxeles (2,57 mm en la dirección transversal) por 13 252 píxeles (3,87 mm en la dirección longitudinal) y campos de 3 × 3 en 19 posiciones a lo largo del camino (Fig. 2a ) con dos configuraciones diferentes, contraste de fase (Fig. 2b) y campo claro (Fig. 2c). Las 19 posiciones muestreadas incluyeron el orificio de entrada y salida, 3 posiciones (izquierda, media, derecha) cerca de la entrada y la salida, y en el medio de cada fila. Las imágenes se capturaron con microscopía de contraste de fase modificada (un anillo ph3 combinado con un objetivo ph1 para que la iluminación se produzca casi lateralmente), lo que da como resultado un fondo oscuro con las bacterias ligeramente más brillantes y los cristales apareciendo brillantes. En cambio, en las imágenes capturadas con una configuración de microscopía de campo claro (sin condensador), el contorno de los cristales aparece oscuro, mientras que las bacterias y el fondo aparecen brillantes. El tiempo de exposición de la cámara se fijó en 50 ms para la imagen de contraste de fase y en 2 ms para la imagen de campo claro. Utilizamos una alta resolución de 0,29 μm/píxel para observar tanto las bacterias como los cristales. Como se mencionó anteriormente, las posiciones se seleccionaron durante la sedimentación bacteriana, mientras que el enfoque se realizó en función de células inmóviles individuales que residen en la parte inferior del chip (en el portaobjetos de vidrio). La duración de la inyección de un volumen de poro de CS fue de aproximadamente 62 min, mientras que el sistema de adquisición tardó 10 min en recopilar imágenes desde la posición 1 hasta la posición 19 con las dos configuraciones ópticas mencionadas. Para optimizar el tiempo computacional de la gran serie de datos recopilados, el intervalo de tiempo de adquisición de la imagen fue de 1 hora durante las condiciones de flujo y de 2 horas durante la fase de retención, ya que se esperaba una tasa de crecimiento más lenta. Por lo tanto, la evolución temporal de MICP en el chip de microfluidos se controló en tiempo real.

(a) Posiciones muestreadas; (b) Sección de dimensiones 1.022 mm × 1.022 mm del canal verde de la imagen original captada con microscopía de contraste de fase y (c) del canal verde de la imagen original captada con microscopía de contraste de fase.

Desarrollamos un algoritmo integral de procesamiento de imágenes en lenguaje MATLAB para identificar el CaCO3 precipitado y las bacterias del procesamiento combinado de los dos tipos de imágenes sin procesar (contraste de fase y campo claro).

Una imagen experimental sin procesar es una imagen en color RGB de 24 bits, que consta de tres matrices de 8813 × 13,252, cada una de las cuales representa los colores rojo, verde y azul. Cada matriz contiene valores que van desde 0 (negro) hasta 255 (blanco). Los tres canales se extrajeron por separado como imágenes en escala de grises de 8 bits con el uso del software NIS Elements (Figs. S1, S2). Determinamos que las células bacterianas tienen la mayor intensidad en el canal verde (Fig. S1), mientras que los cristales también exhiben la máxima absorbancia en el canal verde (Fig. S2). Por lo tanto, solo los canales verdes de las imágenes adquiridas se procesaron para segmentar la estructura del medio sólido (los granos), las bacterias y el CaCO3 precipitado. Después de la conexión de los tubos en la entrada y la inyección de CS, se formaron grandes agregados bacterianos cerca de la entrada debido a la unión de iones de calcio con carga positiva a las células de S. pasteurii con carga negativa26 (Fig. S3). La intensidad de estos agregados es similar a la del CaCO3 precipitado; por lo tanto, las imágenes capturadas más cerca de la entrada (x = ~5 mm) no se procesaron más.

Como primer paso, se seleccionaron imágenes de cada posición en dos momentos diferentes: (i) el comienzo de la inyección de CS (t = 0), cuando solo se pueden observar bacterias, y (ii) después del final de la inyección de CS (t = 10 h), cuando se pudieron observar tanto bacterias como cristales. Las imágenes se normalizaron en 255 para que cada píxel tuviera valores entre 0 (píxel oscuro) y 1 (píxel brillante). A continuación, explicamos el flujo de trabajo para detectar las tres fases: granos sólidos, bacterias y minerales CaCO3 precipitados.

Para separar los granos sólidos cilíndricos (es decir, el círculo en nuestras imágenes) de la imagen de campo claro capturada en t = 0 (Fig. 3a), la imagen se binarizó con la función "Imbinarize" en MATLAB que reemplaza los valores por encima de un umbral adaptativo con 1 (blanco) y los valores por debajo del umbral con 0 (negro). Este método de umbral adaptativo selecciona un umbral basado en la intensidad media local en la vecindad del píxel. Se utilizó la opción "oscuro" "ForegroundPolarity" para detectar los contornos de los pilares, ya que su intensidad es menor que la del fondo. El umbral fue determinado por el parámetro "Sensibilidad", que puede tomar valores de 0 a 1 (ver Material complementario). Al usar una sensibilidad más alta, se definen más píxeles como contornos de los pilares. La imagen binaria resultante consiste en el perímetro de los granos circulares y las bacterias, así como el ruido dentro de los granos circulares presentados en negro, y el espacio poroso, así como el interior de los granos circulares sólidos presentados en blanco (Fig. 3b).

Flujo de trabajo que presenta la extracción de imágenes binarias de los pilares de las imágenes de campo claro en t = 0 (a) Sección de dimensiones 1.022 mm × 1.022 mm de la imagen sin procesar del canal verde, (b) Binarización de imágenes, (c) Inversión y filtrado de ruido y bacterias con "bwpropfilt", (d) Rellenar los pilares de blanco con "imfill".

Los píxeles que representaban bacterias y ruido dentro de los granos circulares se eliminaron con el uso de la función "bwpropfilt" en la imagen binaria inversa. Como resultado, se creó una imagen binaria con los círculos correspondientes al perímetro de los pilares en blanco y el espacio poroso en negro (Fig. 3c). Finalmente, los granos sólidos circulares se rellenaron con color blanco utilizando "imfill" (Fig. 3d).

Las bacterias se separaron de la imagen de contraste de fase capturada en t = 0 (Fig. 4a). Cada imagen se binarizó con "Imbinarize" con el uso del método de umbral adaptativo, configurando el parámetro "ForegroundPolarity" en la opción "oscura". El valor de “Sensibilidad” se definió con ensayo y error entre 0,1 y 0,2 para detectar las bacterias, ya que su intensidad es ligeramente superior a la del fondo y muy inferior a la intensidad del perímetro de pilares y cristales. En la imagen binaria resultante, las bacterias y el perímetro de los pilares se muestran en blanco, mientras que los espacios porosos, así como el interior de los granos circulares, se muestran en negro (Fig. 4b). Posteriormente, configuramos los píxeles que corresponden a los pilares de la imagen binaria previamente adquirida en la Fig. 3d en blanco (Fig. 4c). Finalmente, separamos las bacterias de los pilares filtrando las partículas de área entre 10 y 900 píxeles2, correspondientes a 2,9–261 μm2, según lo definido con Image Region Analyzer. Se derivó una imagen binaria donde las bacterias aparecían blancas sobre un fondo negro (Fig. 4d). Las bacterias exhibieron longitudes variables porque crecen después de la división celular (Fig. S4). Se siguió el mismo procedimiento para separar las bacterias en t = 10 h (Fig. 4f-h) de la imagen de contraste de fase capturada en este punto de tiempo (Fig. 4e).

Flujo de trabajo que presenta la extracción de la imagen binaria de bacterias de la imagen de contraste de fase en t = 0 (a) Sección de dimensiones 1,022 mm × 1,022 mm de la imagen sin procesar del canal verde; (b) Binarización de imágenes, (c) Establecer los píxeles que corresponden a los pilares en la Fig. 3d en blanco, (d) Eliminar los pilares con "bwpropfilt"; en t = 10 (e) Imagen sin procesar del canal verde; (f) Binarización de imágenes, (g) Establezca los píxeles que corresponden a los pilares en la Fig. 3d en blanco, (h) Retire los pilares con "bwpropfilt".

Posteriormente, el CaCO3 precipitado se separó de la imagen de campo claro capturada en t = 10 h (Fig. 5a). Se utilizó el método de umbralización adaptativa, configurando el parámetro "ForegroundPolarity" en la opción "Ibinarize" a "oscuro". La "sensibilidad" se definió con ensayo y error entre 0,4 y 0,5 para detectar el perímetro del CaCO3 precipitado. En la imagen binaria resultante, el perímetro del cristal, los pilares y algunas bacterias aparecían blancos, mientras que el fluido de los poros y el interior de los granos circulares aparecían negros (Fig. 5b). La función MATLAB "Imclose" se utilizó para suavizar los bordes de los contornos de los cristales y cerrar los agujeros existentes (Fig. 5c). Luego, usamos la función "imfill" para llenar los cristales y los pilares con blanco (Fig. 5d). Además, los píxeles correspondientes a los pilares en la Fig. 3d se establecieron en cero. Luego, a esta imagen binaria se le restó la imagen binaria de la Fig. 3d para eliminar los pilares con su perímetro (Fig. 5e). Debido a los cambios en la iluminación durante el experimento, se mantuvo el contorno de algunos pilares y se requirieron pasos adicionales para eliminarlos para que no se contabilizaran en el volumen del CaCO3 precipitado (ver Material complementario). La fase de CaCO3 separada se muestra en la Fig. 5f.

Flujo de trabajo que presenta la extracción de la imagen binaria de cristales de la imagen de campo claro en t = 10 h (a) Sección de dimensiones 1,022 mm × 1,022 mm de la imagen sin procesar del canal verde; (b) Binarización de imágenes, (c) Función MATLAB "Imclose" para suavizar los bordes de los contornos de los cristales y cerrar los agujeros existentes, (d) Función "imfill" para llenar los cristales y los pilares con blanco (e) Establecer el píxeles que corresponden a los pilares en la Fig. 3d a negro, (f) Resultado final de la segmentación del cristal (g) Resultado final del algoritmo de procesamiento de imágenes que segmenta fluido poroso (blanco), granos sólidos (negro) y bacterias (cian) en t = 10 h.

La imagen procesada final producida por el algoritmo presenta el espacio poroso en blanco (valor de píxel de 0), la bacteria en cian (valor de píxel de 1), el CaCO3 en rojo (valor de píxel de 2) y los pilares en negro (valor de píxel de 1). de 3) (Fig. 5g). Con el uso de este algoritmo, los cristales pequeños se pueden distinguir de las bacterias del mismo tamaño debido a la menor intensidad de su perímetro en el canal verde de la imagen de campo claro.

La cobertura de la superficie bacteriana se estimó calculando el área de los píxeles (con la función "bwarea" de MATLAB) con un valor de 1 en la imagen binaria de la bacteria (Fig. 4d). Con base en el tamaño informado de las células de Sporosarcina pasteurii de aproximadamente 0,9–1,2 μm de ancho por 2–3,5 μm de largo, y dado que las bacterias se multiplican por división celular23, para los siguientes cálculos asumimos que las dimensiones de una bacteria individual son de 4 μm de largo por 1 μm de ancho. Para calcular el número de bacterias, dividimos la cobertura de la superficie bacteriana por el tamaño promedio de una bacteria individual de 4 μm2. La concentración bacteriana se estimó dividiendo el número de bacterias por el volumen de poro de cada imagen, asumiendo un ancho de 1 μm en la 3.ª dimensión, debido a la forma de bastón de Sporosarcina pasteruii43. El volumen de poro se estimó restando el volumen de grano del volumen total de la posición muestreada. El volumen de grano en cada posición muestreada se obtuvo calculando el área de los píxeles con valor 1 en la imagen binaria de los pilares (Fig. 3d) y multiplicando por la profundidad del microfluido (50 μm).

Asumiendo una forma esférica de los cristales30,37, su diámetro equivalente D se definió como el promedio de sus ejes menor y mayor (único o agregado); por lo tanto, su volumen equivalente es \(V_{cr,i} = \frac{4}{3}\pi \left( \frac{D}{2} \right)^{3}\). Se calculó la masa total de CaCO3 precipitado en cada posición muestreada:

donde ρ = 2,71 g/cm3 es la densidad de la calcita y n es el número de minerales detectados (que pueden ser monocristales y agregados de cristales).

La eficiencia de la reacción química E de MICP se define como la relación de la masa de CaCO3 medida sobre el valor máximo teórico como si todo el calcio disponible localmente hubiera reaccionado, suponiendo que el calcio se distribuye uniformemente a lo largo del canal. Por lo tanto, la configuración adoptada permite arrojar luz sobre patrones de precipitación específicos y responder preguntas como: (i) ¿El CaCO3 se deposita preferentemente en las cercanías de la entrada, donde el calcio está disponible principalmente? (ii) ¿La heterogeneidad de la red de poros afecta la deposición de CaCO3 a lo largo de la ruta reactiva?

La concentración de calcio en el CS inyectado es \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} M_{{{ \text{Ca}}^{2 + } }}\), donde \(c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 1\frac{{{\text{mol}}} {L}\) es la concentración molar de calcio y \(M_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40,08\frac{{\text{g}}}{{\text{ L}}}\) es la masa molar del calcio. Por lo tanto, \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40,08\frac{{\text{g}}}{{\text{L}}}\).

De acuerdo con la estequiometría en la ecuación química. (2), 1 mol de \({\text{Ca}}^{2 + }\) reacciona con 1 mol de \({\text{CO}}_{3}^{ - 2}\) para formar 1 mol de CaCO3. Por lo tanto, 40,08 g/mol de \({\text{Ca}}^{2 + }\) pueden formar teóricamente 100,09 g/mol CaCO3 si todo reacciona con el carbonato antes de eliminarse del chip de microfluidos.

La masa teórica del CaCO3 precipitado es:

donde \(M_{{{\text{CaCO}}_{3} }} = 100,09\;{\text{g/mol}}\) es la masa molar de CaCO3, \(Q\) es el caudal , y \({\Delta }t\) es el intervalo de tiempo desde el comienzo de la inyección de CS.

La eficiencia química local en cada posición se calculó de la siguiente manera:

donde \(m_{{{\text{CaCO}}_{3} ,{\text{t }}}}^{{({\text{s}})}}\) es la masa total estimada del CaCO3 precipitado en cada posición muestreada calculado por (3), \(PV_{l}\) es el volumen de poro en la posición específica, y \(PV_{TOT} = 74\;\upmu {\text{L}}\ ) es el volumen total de poros del canal de microfluidos. Cada posición corresponde a aproximadamente el 0,3 % de \(PV_{TOT}\). Al final de la inyección de CS, la masa teórica del CaCO3 precipitado es \(44.3\;{\text{mg}}\) en todo el chip, mientras que en cada posición muestreada es de 110 a 130 μg dependiendo de la temperatura local. espacio poroso disponible.

Se cree que la densidad bacteriana afecta la tasa de crecimiento, el tamaño y la cantidad de precipitados de CaCO326. La Figura 6a presenta la concentración bacteriana a lo largo del chip promediada sobre los triplicados al comienzo de la inyección de CS (t = 0) (Fig. 6a) y en t = 12 h (Fig. 6b). En t = 0, la concentración promedio de bacterias es más uniforme en el medio homogéneo que en el medio poroso heterogéneo a 0-800 mm, con un rango de ~8 × 107 células/ml a 1,03 × 108 células/ml en el medio poroso heterogéneo , la concentración bacteriana disminuye de ~2 × 108 células/mL a 1 × 108 células/mL en los primeros 400 mm y presenta un pico a los 420 mm antes de caer a ~1–1,05 × 108 células/mL en el intervalo 600 –800 mm, donde permanece aproximadamente un 50% superior a la concentración en el medio poroso homogéneo. Cerca de la salida, se detectó una concentración bacteriana más baja de ~3 × 107 células/mL a 4 × 107 células/mL en los sistemas de microfluidos homogéneos y heterogéneos.

( a ) Concentración bacteriana de S. pasteurii al comienzo de la inyección de CS (t = 0); (b) en t = 12 h a través del camino reactivo de un metro de largo. Los puntos representan promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación absoluta media de los triplicados.

Durante la inyección de CS, las bacterias que no estaban adheridas a los pilares o al portaobjetos de vidrio fueron transportadas o encapsuladas en cristales de CaCO3 (Fig. 7). En t = 12 h, el medio poroso heterogéneo retuvo una concentración bacteriana promedio ligeramente más alta de ~3 × 107 células/mL a 7 × 107 células/mL que en el medio homogéneo, donde una concentración promedio de ~2.5 × 107 células /mL a 5 × 107 células/mL se observaron en 0–900 mm, mientras que cerca de la salida, la mayoría de las bacterias fueron expulsadas.

El crecimiento de monocristales y agregados de cristales en poros seleccionados del chip microfluídico homogéneo capturó ~423 mm desde la entrada.

Las imágenes del crecimiento de cristales en los poros seleccionados de los chips de microfluidos homogéneos y heterogéneos se muestran en la Fig. 7 y la Fig. 8, respectivamente. La nucleación de cristales comenzó 1 h después del comienzo de la inyección de CS en los medios porosos homogéneos y heterogéneos. La Figura 7 muestra cristales individuales de CaCO3 formados 3 h después del comienzo de la inyección de CS ~ 423 mm desde la entrada. Cristales nucleados tanto en los pilares como en el portaobjetos de vidrio, donde las bacterias permanecieron adheridas. Inicialmente, todos los cristales exhibieron un tamaño que no era lo suficientemente grande para unir los granos sólidos adyacentes. En t = 4 h, se formaron cinco monocristales más (dos están fuera de foco), mientras que los cristales existentes crecieron. Uno de los cristales individuales creció lo suficiente como para unir las dos partículas adyacentes. Otros dos cristales se fusionaron y formaron un agregado cristalino que también unía dos granos sólidos adyacentes. En t = 5 h, todos los cristales se hicieron más grandes. Sin embargo, no se observó más crecimiento de cristales en esta posición seleccionada durante los siguientes períodos de 1 h y 40 min de inyección continua de CS o durante el período sin flujo hasta t = 18 h.

Evolución de la agregación de cristales en el espacio poroso entre tres granos sólidos cilíndricos de la réplica heterogénea de un medio poroso. Este poro está ubicado en una ubicación muestreada a ~730 mm de la entrada.

La Figura 8 muestra cuatro pequeños cristales individuales de CaCO3 que se formaron 1 h después del comienzo de la inyección de CS. Como en Wang et al.13, los puntos de nucleación únicos que están cerca uno del otro crecieron por separado hasta que se fusionaron para formar agregados de cristales (mesocristales2). Aquí, la mayor parte del crecimiento ocurrió dentro de las primeras 4 h, mientras que continuó a un ritmo muy lento hasta las 18 h. Esta tendencia también se puede verificar mediante las gráficas del crecimiento de cristales en masa (Fig. 9). Esta figura presenta el crecimiento de la masa cristalina en dos posiciones: (a) cerca de la entrada y (b) en el medio del microfluido. Se puede observar que el crecimiento fue globalmente mayor en el medio poroso heterogéneo. En ambos medios porosos, la mayor parte del crecimiento se observó dentro de las primeras 4 h. Sin embargo, en el medio poroso heterogéneo, la tasa de crecimiento en las siguientes 9 h de tratamiento con MICP fue mayor que la del medio poroso homogéneo que presentó una meseta. El crecimiento de cristales se completó 5 h (t = 12 h) después del final de la inyección de CS de 6 h 40 min en la mayoría de los casos.

Crecimiento de la masa cristalina durante 12 h de tratamiento con MICP en dos posiciones: (a) x = 30 mm y (b) x = 574 mm a lo largo del medio poroso homogéneo y heterogéneo. Los puntos representan promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación absoluta media.

La distribución del CaCO3 precipitado en la dirección transversal del flujo varía de una posición a otra, con cristales que ocupan todo el plano o cerca de los límites (Fig. S5). Esto se puede atribuir a la precipitación de CaCO3 que altera la ruta de flujo o rutas preferenciales que llevan los reactivos a zonas donde se mejora la mezcla. Sin embargo, los experimentos con tintes podrían proporcionar más información sobre el régimen de flujo en los dos chips y cómo afecta la mezcla de reactivos en el espacio poroso en evolución.

La eficiencia de la reacción química en el presente trabajo se define como el porcentaje de calcio inyectado que se convierte en CaCO3. La masa estimada del CaCO3 precipitado presenta un pico en el medio del canal microfluídico para medios porosos tanto homogéneos como heterogéneos (Fig. 10a). La Figura 10b presenta la eficiencia de reacción química estimada en los medios porosos homogéneos y heterogéneos. Tanto los medios porosos homogéneos como heterogéneos presentan una eficiencia de reacción no uniforme con respecto a la distancia. En el medio poroso homogéneo, la eficiencia es baja cerca de la entrada y alcanza un máximo a 420 mm con un promedio de 22%, mientras que se mantiene por debajo del 11% entre 600 y 990 mm. En cambio, el medio poroso heterogéneo presenta un valor pico de eficiencia de reacción del 37% con una desviación estándar mayor a la mitad de la microfluídica, y arroja valores entre 15 y 28% a distancias entre 500 y 900 mm de la entrada. Este hallazgo se acompaña además de una desviación más pequeña para la red porosa heterogénea después de que se analizaron los triplicados. Postulamos que la discrepancia entre los valores de eficiencia medidos en el presente estudio y los informados en la literatura para muestras a escala de laboratorio, por lo general por encima del 40 %2, se debe a la mayor disponibilidad de superficies en los experimentos de columna 3D donde las características del grano, como la rugosidad44 o la angularidad de las partículas y las trayectorias de flujo tridimensionales más complejas favorecen la unión celular y la precipitación de calcita.

(a) Masa final del CaCO3 precipitado; (b) eficiencia de reacción estimada al final del tratamiento MICP (t = 12 h) cuando se completó el crecimiento de cristales. Los puntos representan los promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación absoluta media de los triplicados.

Con base en los hallazgos anteriores, una observación preliminar es que al usar extremos opuestos para la introducción de BS y CS, el biocementado aumenta en el medio del chip y posteriormente evoluciona hacia la ruta de flujo de CS. Sin embargo, la arquitectura de la propia red de flujo parece influir en esta evolución en términos de eficiencia de reacción y propiedades cristalinas. Una posible explicación es que la tendencia predominante del CaCO3 en la red porosa homogénea es la de pequeños monocristales que no crecen lo suficiente como para obstruir las gargantas de los poros y eventualmente atraer más reactivos, lo que resulta en una menor eficiencia. Para la arquitectura porosa heterogénea, la tendencia es diferente, con varios puntos de nucleación que crecen en agregados más grandes (Fig. 11), y las gargantas de los poros obstruidos, por lo tanto, crecen en tamaño e influyen dinámicamente en la tortuosidad de la red.

(a) Diámetro medio de los cristales. (b) Número final de cristales en t = 12 h. Los puntos representan los promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación absoluta media de los triplicados.

Estas tendencias distintivas se ilustran con más detalle en la Fig. 11a, b, donde los números y tamaños de cristal varían para los dos chips. Los cristales parecen ser más grandes en el medio heterogéneo (\(D_{eq}\) = 35–40 μm) que en el medio homogéneo (\(D_{eq}\) = 28–35 μm) entre 600 y 800 mm y produjo una desviación absoluta media más grande en la segunda mitad del chip (Fig. 11a). Además, se capturó una mayor cantidad de cristales (200-300 cristales) en la red porosa heterogénea entre 480 y 900 mm, lo que refleja una mayor masa y eficiencia de calcita en comparación con la red homogénea (con 60-100 cristales en el mismo intervalo) , con menor biocementación captada para los primeros 200 mm.

La permeabilidad de los canales de microfluidos se midió durante la inyección de CS. Reordenando la ley de Darcy para el flujo incompresible en términos de la permeabilidad intrínseca k (m2), entonces:

donde \(Q\) es el caudal impuesto (m3/s), \(\mu\) es la viscosidad dinámica del agua (N∙s/m), L (m) es la longitud del canal microfluídico, A ( m2) es el área de la sección transversal (HxW), \(p_{1}\) (N/m2) es la presión medida en la entrada y \(p_{2}\) (N/m2) es la presión medida en la salida

La inyección de CS durante la cual se formaron y crecieron cristales duró como se mencionó anteriormente durante 6 horas y 40 minutos. La Figura 12 muestra la diferencia de presión medida entre la entrada y la salida durante la inyección de CS para la tercera réplica del experimento en el medio poroso homogéneo y heterogéneo. Los datos sin procesar se suavizaron con el uso del filtro Savitzky-Golay45 en Matlab, que es una técnica de ventana móvil que se basa en el ajuste polinomial de mínimos cuadrados locales en el dominio del tiempo. Los sensores de presión pudieron capturar el aumento en la diferencia de presión debido a la reducción de la porosidad por la nucleación y el crecimiento de cristales, que alcanzaron un estado casi estable 4-5 h más tarde. Esto está de acuerdo con la tendencia observada con respecto al crecimiento de cristales tanto cualitativamente (Figs. 7, 8) como cuantitativamente (Fig. 9) de que la mayor parte del crecimiento de cristales ocurre en las primeras 4 a 5 h de la inyección de CS. La Figura 12 muestra la evolución derivada de la permeabilidad intrínseca con el uso de la ecuación. (6).

(a) Datos sin procesar y filtrados (con el filtro Savitzky-Golay45) de la evolución de la diferencia de presión. ( b ) Evolución de la permeabilidad intrínseca calculada durante la inyección de CS.

Después del final de la inyección de CS, se observó una reducción del 16% en la permeabilidad del medio poroso homogéneo, mientras que para el medio poroso heterogéneo, la reducción fue del 22%. La diferencia en la reducción de la permeabilidad entre los dos chips es solo del 6%, lo que implica que la diferencia microscópica en el tamaño y el número de cristales no afecta predominantemente a la permeabilidad macroscópica. La baja reducción de la permeabilidad muestra que hay suficientes rutas de flujo alternativas que no están obstruidas. Los cambios generales en la permeabilidad permanecen dentro del rango esperado de 1 orden de magnitud19. La precipitación de CaCO3 en gargantas de poros angostos podría aumentar la resistencia mecánica y la rigidez25,46, en contraste con la precipitación en gargantas de poros abiertos que podrían reducir eficientemente la permeabilidad19,25.

Supervisamos y visualizamos MICP en tiempo real dentro de chips homogéneos y heterogéneos. En este trabajo se presentó una nueva configuración experimental para la evaluación de los cambios de permeabilidad durante el tratamiento MICP y los cálculos de eficiencia. Se cuantificó el número de bacterias y la masa de precipitados en diferentes posiciones a lo largo de las trayectorias para expresar la distribución de calcita y la eficiencia de la reacción y, en última instancia, determinar el efecto de las redes de poros en los patrones de precipitación. El trabajo introdujo un flujo de trabajo de procesamiento de imágenes basado en MATLAB para facilitar el manejo de una gran cantidad de datos producidos por la adquisición integral de imágenes. Entre las principales conclusiones de este trabajo se encuentran las siguientes:

Con una inyección continua de 6 volúmenes de poro de CS, se formaron cristales de CaCO3 1 h después del comienzo de la inyección de CS y se completaron 12 h después en ambos canales microfluídicos.

El crecimiento de cristales en términos de la masa producida de CaCO3 en diferentes posiciones a lo largo del chip es en general mayor en el medio poroso heterogéneo considerando que se aplicaron condiciones de tratamiento idénticas.

Al utilizar extremos opuestos para la introducción de BS y CS, en el medio poroso heterogéneo, la biocementación aumentó al 34% en la mitad de la viruta (420 mm) y posteriormente evolucionó hacia la trayectoria del flujo CS con valores superiores al 20%, mientras que en el medio poroso homogéneo, se alcanzó un pico del 27 % 420 mm después del punto de inyección de CS, y la eficiencia de la reacción se mantuvo inferior al 12 % en el resto del medio microfluídico. Esto se atribuye a las tendencias observadas de un mayor número de cristales que crecen en diámetro a pesar de la distribución bacteriana inicial casi idéntica para ambos medios. Esto implica que la evolución dinámica de la trayectoria del flujo reactivo es una fuente clave para comprender la evolución final del depósito de CaCO3 inducido por MICP.

Los hallazgos anteriores se capturan después de comparar triplicados donde las condiciones de tratamiento iniciales (OD, parámetros de flujo, configuración de inyección) eran idénticas antes de la inyección en los chips homogéneos y heterogéneos. En el medio poroso homogéneo, la velocidad promedio es uniforme, lo que conduce a una distribución bacteriana uniforme. Por el contrario, en el medio poroso heterogéneo, que consta de zonas de mayor y menor velocidad, se acumulan más bacterias en la segunda mitad del chip, lo que posiblemente también ofrezca más sitios de nucleación disponibles para los cristales. Esto sugiere que las propiedades intrínsecas de los materiales porosos y la arquitectura de sus redes porosas influyen en el destino de la precipitación y los tortuosos caminos reactivos. Nuestro estudio arroja nueva luz sobre la evolución de MICP y su adaptación a la red de flujo disponible mediante el aprovechamiento de los avances tecnológicos en microscopía, análisis de grandes datos y dispositivos microfluídicos, campos que se espera crezcan dentro del área tradicional de la geomecánica.

La configuración experimental propuesta y el marco de análisis de imágenes se pueden extender al monitoreo en tiempo real de MICP a través de múltiples patrones de tratamiento usando diferentes recetas con el uso de microvolúmenes.

Los conjuntos de datos y el código utilizados para este estudio estarán disponibles tras su publicación en DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.7319582.

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Este trabajo ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (Acuerdo de subvención n.º 788587). Los autores también desean agradecer al Laboratorio de Mecánica de Fluidos Ambientales de la Universidad de Lausana (Unil), al Dr. Stéphane Mahé por facilitar el cultivo bacteriano y a la Dra. Mayumi Hamada por la microfabricación de los canales microfluídicos de un metro de largo.

Laboratorio de Mecánica de Suelos, EPFL, 1015, Lausana, Suiza

Ariadni Elmaloglou, Dimitrios Terzis y Lyesse Laloui

Laboratorio de Mecánica de Fluidos Ambientales, UNIL, 1015, Lausana, Suiza

pietro de ana

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AE llevó a cabo los experimentos de laboratorio. Los autores AE, DT y PdA contribuyeron al diseño, análisis e interpretación de los experimentos de laboratorio. LL y DT adquirieron el apoyo financiero para el proyecto. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Dimitrios Terzis.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Elmaloglou, A., Terzis, D., De Anna, P. et al. El estudio de microfluidos en un camino reactivo de un metro de largo revela cómo la heterogeneidad estructural del medio da forma a la biocementación inducida por MICP. Informe científico 12, 19553 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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Recibido: 14 junio 2022

Aceptado: 10 de noviembre de 2022

Publicado: 15 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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