Detección rápida de SARS

Nov 14, 2023

Nature Biomedical Engineering volumen 6, páginas 944–956 (2022)Citar este artículo

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Las pruebas rápidas de ácido nucleico son fundamentales para la vigilancia de enfermedades infecciosas. Aquí, informamos un ensayo para la prueba rápida de COVID-19 y su implementación en un prototipo de dispositivo microfluídico. El ensayo, que llamamos DISCoVER (para diagnósticos con informes enzimáticos de coronavirus), implica la lisis de muestras sin extracción a través de reactivos estables y de bajo costo, amplificación de ARN isotérmica multiplexada seguida de transcripción de T7 y escisión mediada por Cas13 de un fluoróforo apagado. . El dispositivo consta de un cartucho de microfluidos accionado por gravedad de un solo uso que se inserta en un instrumento compacto para la ejecución automática del ensayo y la lectura de la fluorescencia en 60 minutos. DISCoVER puede detectar el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en la saliva con una sensibilidad de 40 copias μl–1, y fue 94 % sensible y 100 % específico cuando se validó (contra PCR cuantitativa) utilizando ARN total extraído de 63 muestras de hisopos nasales (33 SARS-CoV-2 positivos, con valores de umbral de ciclo de 13–35). El dispositivo identificó correctamente todas las muestras clínicas de saliva analizadas (10 positivas para SARS-CoV-2 de 13, con valores de umbral de ciclo de 23–31). Las pruebas rápidas de ácido nucleico en el punto de atención pueden ampliar el uso de diagnósticos moleculares.

La detección rápida de ácidos nucleicos en el punto de atención es un componente crítico de una infraestructura de pruebas sólida para controlar la transmisión de enfermedades. Brotes como la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) han puesto de relieve las limitaciones del modelo de laboratorio de diagnóstico centralizado y su largo tiempo de muestra a respuesta. Las pruebas desarrolladas en laboratorio, como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), se llevan a cabo en instalaciones que requieren una infraestructura de equipo y personal que requiere mucha mano de obra para el acceso de muestras, la extracción de ácidos nucleicos, el termociclado y el análisis de datos. El transporte de muestras y el tiempo de informe de resultados también contribuyen en gran medida a los tiempos de respuesta de las pruebas centralizadas. El desarrollo de un dispositivo de microfluidos fácil de usar junto con la detección in situ permitiría aumentar el volumen y el acceso a las pruebas moleculares rápidas.

Hasta ahora, más de 6 millones de muertes por COVID-19 han resultado de más de 500 millones de infecciones por su agente causal, el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Los innumerables desafíos de una alta tasa de infección asintomática1, pruebas insuficientes y la ventana de tiempo estrecha para que las pruebas moleculares sean altamente sensibles2,3 pueden combatirse mediante un amplio despliegue de diagnósticos moleculares en el sitio, como al ingresar al lugar de trabajo o al aula. También existe un tremendo potencial para las pruebas de vigilancia comunitaria para aumentar los flujos de trabajo clínicos, donde los casos positivos se confirman mediante la derivación a un suministro más limitado de pruebas de grado clínico. Los métodos de muestreo alternativos y las tecnologías de prueba también pueden ayudar a diversificar la cadena de suministro de diagnóstico, ya que la tubería estándar para las pruebas clínicas puede verse limitada por la escasez de kits de extracción de ARN o hisopos4,5.

Por lo tanto, buscamos desarrollar un método que no requiriera extracción de ARN o hisopos del tracto respiratorio superior y que pudiera integrarse en un flujo de trabajo de microfluidos rápido y automatizado. Los ensayos basados ​​en qPCR se han desarrollado previamente con adición directa de muestras y, por lo general, utilizan una temperatura alta para la lisis de las muestras6. Otros enfoques han explotado agentes caotrópicos, reducción química e inhibidores de RNasa6,7,8,9. Además, se informa que las muestras de saliva tienen una concordancia del 97 % con los hisopos nasofaríngeos (NP)10,11.

La detección basada en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) es un nuevo enfoque prometedor para el diagnóstico de ácidos nucleicos. Estos métodos se basan en la activación dependiente del ARN guía de las nucleasas Cas13 o Cas12 para inducir actividad de nucleasa de ADN monocatenario o ARN monocatenario no específico, respectivamente, con el fin de escindir y liberar una molécula informadora enjaulada12,13,14, 15,16,17,18,19. El reportero liberado se puede medir cuantitativamente con un detector de fluorescencia para leer el resultado de la prueba. La detección basada en CRISPR es muy específica, pero las nucleasas Cas13 por sí solas pueden tardar hasta 2 h en alcanzar la sensibilidad atomolar para aplicaciones de diagnóstico20,21. Por el contrario, la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) realiza una amplificación de ácidos nucleicos de alta sensibilidad en menos de 20 minutos con límites atomolares de detección20 (LOD). Sin embargo, a pesar de la sensibilidad y la velocidad de LAMP, dichos métodos isotérmicos a menudo son propensos a una amplificación no específica22,23.

En este artículo, para abordar estos desafíos, informamos DISCOVER (para diagnósticos con informes enzimáticos de coronavirus), una prueba sin extracción de ARN que combina dos mecanismos de amplificación distintos para la sensibilidad con una sonda mediada por Cas13 para la especificidad (Fig. 1). Después de la lisis directa y la inactivación de las muestras de saliva a través de la desnaturalización y la reducción, la amplificación LAMP es seguida por la transcripción T7 para proporcionar dos capas de amplificación objetivo. Para demostrar las pruebas CRISPR virales en un formato de muestra a respuesta, integramos el flujo de trabajo DISCoVER en un sistema de microfluidos con un lector de fluorescencia compacto para la detección en tiempo real. En una prueba de concepto en el punto de atención, la inactivación de la muestra y la posterior amplificación y detección con este dispositivo se pueden apilar de manera que el tiempo de inactivación no limite la velocidad en el flujo de trabajo (Figura 1 complementaria).

Las muestras de los pacientes, como la saliva, se recogen y se inactivan con calor en un tampón de lisis directa, seguido de la carga en un cartucho de microfluidos accionado por gravedad de un solo uso. El paso de inactivación varía de 5 a 20 min dependiendo de la normativa institucional37. Luego, el cartucho se inserta en un instrumento complementario que ejecuta automáticamente el ensayo DISCoVER en un sistema cerrado para minimizar la contaminación de la reacción. En el paso 1, una reacción inicial de rLAMP emplea dos mecanismos para la amplificación de los ácidos nucleicos diana. RFU, unidades relativas de fluorescencia. Las enzimas Cas13 están programadas con un ARN guía para reconocer específicamente las moléculas de ARN deseadas sobre productos amplificados no específicamente. La activación posterior de la actividad de la ribonucleasa Cas13, en el paso 2, da como resultado la escisión de las moléculas indicadoras para señales saturadas dentro de los 5 minutos posteriores a la detección CRISPR. Incluyendo el tiempo de activación del dispositivo, el tiempo de lectura en un sistema finalizado es de 48 min. En la mitad izquierda del cartucho, los ARN guía dirigidos al SARS-CoV-2 permiten la detección rápida y selectiva de concentraciones atomolares del virus. La mitad reflejada del cartucho se utiliza para un control de proceso interno, lo que permite obtener un resultado de prueba negativo al garantizar la presencia de muestras de pacientes adecuadas. Al explotar el cambio de plantilla y la capacidad de programación CRISPR, el sistema DISCoVER en el punto de atención puede contribuir a una mayor vigilancia de diversos patógenos.

DISCOVER incorpora un paso de amplificación de 30 minutos seguido de una lectura de Cas13 de 5 minutos y logra una sensibilidad atomolar en muestras de saliva no extraídas. También multiplexamos la amplificación con un control de proceso basado en la detección de un gen humano de referencia para confirmar la presencia de suficiente material celular en la muestra. Validamos DISCoVER en una matriz de muestra a base de saliva que contiene virus SARS-CoV-2 vivo y ARN total extraído de hisopos nasales de pacientes con valores de umbral de ciclo (Ct) que oscilan entre 15 y 35. Observamos un valor predictivo positivo (VPP) de 100 % y un valor predictivo negativo (VPN) del 93,75 % para el ensayo DISCoVER en relación con qPCR. Las muestras de saliva positivas artificiales se analizaron de principio a fin en un dispositivo de microfluidos con detección de fluorescencia en tiempo real integrada como prueba de concepto para la detección automatizada. Se utilizó un control de proceso a bordo para permitir la discriminación entre resultados de prueba positivos, negativos e inválidos. Para validar aún más la solidez del sistema de microfluidos automatizado, se analizaron muestras de saliva artificiales y se indicó sensibilidad atomolar. Finalmente, las muestras clínicas naturales recolectadas en el campo se procesaron en el dispositivo para demostrar la capacidad del ensayo para diferenciar muestras positivas y negativas de pacientes reales. En general, el sistema DISCoVER permite una detección viral portátil, rápida y sensible para la vigilancia de patógenos.

En primer lugar, buscamos comparar las propiedades de detección de ácidos nucleicos de las enzimas Cas13 y Cas12, evaluando la actividad de división informadora de Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) y la bacteria Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCas12a) con secuencias espaciadoras de ARN guía coincidentes en una serie de dilución de sus correspondientes secuencias sintéticas. moléculas activadoras (Fig. 2a). Observamos que la detección de LbuCas13a es sustancialmente más rápida que LbCas12a a bajas concentraciones de activador. A 100 pM de esta secuencia activadora, LbuCas13a alcanza la mitad de la fluorescencia máxima 30 veces más rápido que LbCas12a en sus respectivas condiciones de reacción (Fig. 2b y Métodos). Sin embargo, el LOD de LbuCas13a todavía está en el rango femtomolar después de 60 min (ref. 24), que ya está más allá del tiempo máximo de muestra a respuesta que probablemente sea relevante para un ensayo de punto de atención.

a, cinética de detección de Cas13 y Cas12 a concentraciones variables de activador. La línea y las regiones sombreadas indican media ± desviación estándar (sd) con n = 3 repeticiones técnicas. b, tiempo de Cas13 y Cas12 hasta la mitad de la fluorescencia máxima. †, el tiempo hasta la mitad de la fluorescencia máxima fue demasiado rápido para una detección confiable. ††, no se pudo determinar el tiempo hasta la mitad de la fluorescencia máxima dentro del tiempo de ejecución del ensayo de 120 minutos. Los valores son la media ± sd con n = 2 repeticiones técnicas. c, Esquema de la secuencia del genoma del SARS-CoV-2, con las ubicaciones del conjunto de cebadores LAMP indicadas. d, Gráficos de fluorescencia representativos de la amplificación LAMP de 100 copias μl–1 de ARN sintético de SARS-CoV-2 o NTC. Las regiones sombreadas indican media ± sd con n = 3 repeticiones técnicas. e, Tiempo hasta el umbral de nueve conjuntos de cebadores LAMP seleccionados, dirigidos al ARN sintético del SARS-CoV-2 o NTC. Las réplicas que no se amplificaron se representan en 0 min. Las barras de error representan la media ± sd de las réplicas técnicas amplificadas, n = 4. f, ensayo LOD de LAMP usando N conjunto 1 conjunto de cebadores. Las réplicas que no se amplificaron se representan en 0 min. Las barras de error representan la media ± SD de las réplicas técnicas amplificadas, n = 4.

Para lograr la sensibilidad atomolar, elegimos LAMP como un método rentable y rápido para la amplificación isotérmica. LAMP emplea una transcriptasa inversa, una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena y tres conjuntos de pares de cebadores para convertir el ARN viral en sustratos de ADN para LAMP. Examinamos nueve conjuntos de cebadores LAMP dirigidos a distintas regiones a lo largo del genoma del SARS-CoV-2 (Fig. 2c y Tabla complementaria 1)25,26,27,28. Cuando se dirigió a fragmentos de ARN genómico de SARS-CoV-2 a 100 copias μl–1, todos los conjuntos dieron como resultado señales LAMP positivas. La fluorescencia máxima se alcanzó en 20 minutos para todos los conjuntos de cebadores, y el tiempo hasta el umbral se determinó a través del modo de determinación de cuantificación de ciclo de umbral único (Cq) como se indica (Fig. 2d). Los conjuntos de cebadores LAMP dirigidos al conjunto 1 de Orf1ab, el conjunto N 1 y el conjunto N 2 se amplificaron constantemente en menos de 15 minutos (Fig. 2e).

Cada conjunto de cebadores LAMP dio como resultado una señal de control sin plantilla (NTC), aunque con un retraso en relación con la condición positiva que contenía ARN viral (Fig. 2d). Esta alta tasa de falsos positivos, posiblemente debido a la formación de dímeros de cebadores, en principio puede reducirse con una segunda sonda que reconozca selectivamente la secuencia de ácido nucleico amplificada. Por lo tanto, buscamos combinar la sensibilidad de la detección LAMP con la especificidad del reconocimiento de objetivos Cas13.

Para evitar la detección de productos de amplificación no específicos por parte de Cas13, los ARN guía deben tener una superposición mínima de secuencias con las secuencias de los cebadores. Debido a la complejidad de la concatemerización LAMP, los cebadores LAMP se superponen mucho y amplifican regiones diana cortas para aumentar la velocidad de reacción24,29. Nuestros conjuntos de cebadores LAMP generaron amplicones con secuencias no superpuestas de cebadores que oscilan entre 1 y 60 nt. El conjunto N 1, dirigido al gen N del SARS-CoV-2, se eligió para su uso posterior debido a su bajo tiempo hasta el umbral y un tamaño de amplicón capaz de acomodar los ARN guía Cas13 (Fig. 2e y Tabla complementaria 1). A continuación, realizamos una serie de diluciones de ARN viral genómico y determinamos que el LOD de N set 1 era de 25 copias μl–1 (Fig. 2f), comparable con estudios anteriores que informan LOD entre 10 y 100 copias μl–1 (refs. 7, 30,31).

Como Cas13 se dirige al ARN monocatenario (Fig. 2a), mientras que LAMP amplifica los sustratos de ADN, empleamos la transcripción de los productos LAMP para permitir la compatibilidad del sustrato. Las secuencias del promotor de la polimerasa de ARN T7 se incorporaron en las secuencias del cebador LAMP para la transcripción posterior y la detección de Cas13. Llamamos a esto 'conversión de la amplificación LAMP a ARN' o 'rLAMP'. LAMP emplea tres pares de cebadores: cebadores externos hacia adelante y hacia atrás (F3/B3) para el desplazamiento inicial de la cadena diana, cebadores internos hacia adelante y hacia atrás (FIP/BIP) para formar la estructura central LAMP de tallo-bucle, y cebadores de bucle hacia adelante y hacia atrás (FLoop /BLoop) para una capa adicional de amplificación basada en loops (Datos extendidos Fig. 1). A través de múltiples iteraciones de unión y extensión de cebadores, estas estructuras de bucle de tallo se amplifican en concatémeros compuestos de repeticiones invertidas de la secuencia objetivo (Fig. 3a).

a, Esquema del mecanismo rLAMP para la amplificación exponencial de ADN utilizando cebadores F3/B3 y FIP/BIP, lo que da como resultado estructuras repetidas invertidas de orden superior. Las flechas rojas indican la ubicación de la secuencia del promotor de T7, insertada en el cebador mBIP. Tras la transcripción de T7, el ARN resultante contiene una o más copias de la secuencia diana Cas13 (naranja). b, Esquema de la ubicación de diferentes ubicaciones del promotor T7 en la estructura de pesas de rLAMP y los cebadores de bucle. c, tiempo de rLAMP hasta el umbral de seis inserciones distintas del promotor T7. Las réplicas que no se amplificaron se representan en 0 min. Las barras de error representan la media ± sd de las réplicas técnicas amplificadas, n = 4. d, geles PAGE desnaturalizantes de productos mBIP rLAMP para verificar la transcripción mediada por T7. AfeI se escinde en la región objetivo de crRNA de los productos moldeados, lo que se espera que dé como resultado una única especie principal transcrita. e, Cinética de la transcripción de T7 y detección de Cas13 en productos mBIP rLAMP. Los valores son la media ± sd con n = 3 repeticiones técnicas. f, detección de Cas13 de ocho réplicas técnicas de amplificación de mBIP rLAMP en ARN genómico, representada como cambio de pliegue sobre NTC en diferentes puntos finales de reacción.

Para permitir la transcripción de ARN después de LAMP (rLAMP), probamos sistemáticamente la inserción de secuencias del promotor T7 en tres regiones diferentes de cebadores LAMP: en el extremo 5 'de los cebadores FIP y BIP (5' FIP/5' BIP), en el medio de los cebadores FIP y BIP (mFIP/mBIP), y en el extremo 5 'de los cebadores de bucle (FLoop/BLoop) (Fig. 3b). La adición del promotor T7 no afectó en gran medida el tiempo de rLAMP hasta el umbral del conjunto N 1, dado el ARN genómico viral a 100 copias μl–1 (Fig. 3c). Para confirmar que las secuencias objetivo se amplificaron específicamente, realizamos la digestión con enzimas de restricción en los productos LAMP usando AfeI, que digiere en la región objetivo del ARN guía Cas13 dentro del amplicón rLAMP (Fig. 2a,b complementaria). La falta de digestión de AfeI en todas las condiciones de NTC confirmó que la señal de NTC resulta de la amplificación no específica de secuencias que carecen de la secuencia objetivo de coincidencia de guía.

Para probar si el promotor T7 se incorporó correctamente y fue funcional en el amplicón rLAMP, luego realizamos la transcripción in vitro con la polimerasa de ARN T7. El análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE) indicó que la plantilla viral y las condiciones de NTC dieron como resultado la transcripción de ARN para todos los conjuntos de cebadores (Fig. 3d). Como era de esperar, la digestión con AfeI del producto mBIP rLAMP produjo un solo producto de 147 nt que contenía el promotor T7 (Fig. 2a complementaria). La transcripción posterior de T7 dio como resultado el producto de ARN de 85 nt esperado (Fig. 3d).

A continuación, optimizamos las condiciones del tampón de reacción para respaldar la transcripción de T7 y la detección de Cas13 en un solo paso, seguido de una detección sistemática de la actividad de escisión de Cas13 en presencia de productos rLAMP que contienen inserciones del promotor T7 en diferentes amplicones de rLAMP. Determinamos que el medio de la posición de inserción del cebador BIP (mBIP) resultó en la detección más rápida y, por lo tanto, elegimos este conjunto de cebadores para estudios adicionales (Figura 3 complementaria y Tabla complementaria 2). Cas13 detecta rápidamente el amplicón rLAMP con una plantilla viral, al tiempo que evita la detección de amplicones NTC no específicos, logrando un cambio de más de diez veces en la señal sobre el fondo NTC en menos de 2 minutos (Fig. 3e). La saturación de la señal ocurrió dentro de los 5 minutos, alcanzando una relación señal-fondo de más de 40.

Para confirmar la replicabilidad de la tubería DISCoVER, probamos la detección de Cas13 en ocho réplicas de reacciones mBIP rLAMP con ARN activador incluido en una concentración de 100 copias μl–1 en una reacción de 20 μl. Las ocho réplicas dieron como resultado un aumento de >25 veces en la señal sobre NTC, que permanece estable mucho más allá del tiempo de detección de 5 minutos empleado aquí (Fig. 3f).

Con un protocolo de amplificación y detección implementado, luego optimizamos el procesamiento de muestras para establecer un protocolo simple de calor combinado con reactivos químicos para promover la inactivación viral y amortiguar la actividad de las nucleasas que degradan el ARN presentes en la saliva32. Analizamos dos concentraciones del agente reductor no perecedero Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) junto con el quelante de iones ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (refs. 7,8), reactivos disponibles en el mercado, como los tampones QuickExtract que contienen detergentes y proteinasas. , y DNA/RNA Shield que contiene tiocianato de guanidina caotrópico.

Para probar la compatibilidad de estos reactivos de inactivación con rLAMP, creamos muestras de saliva positivas simuladas agregando los reactivos a saliva tratada térmicamente a 75 °C (ref. 33) y agregando ARN genómico de SARS-CoV-2 en dos concentraciones diferentes: 1.000 copias µl−1 y 200 copias µl−1. En ausencia de reactivos de inactivación, no pudimos detectar ninguna señal de rLAMP, lo que sugiere la degradación del ARN en la saliva por las RNasas endógenas presentes en la muestra (Fig. 4a). Por el contrario, el ARN genómico sin saliva se amplificó rápidamente en menos de 15 min. Solo la condición de baja concentración de TCEP-EDTA protegió el ARN objetivo y conservó la sensibilidad de rLAMP en las cuatro réplicas (Fig. 4a). Este cóctel de reactivos rompe simultáneamente los enlaces disulfuro de proteínas y secuestra cationes divalentes. Se espera que su actividad disminuya la actividad de la RNasa y, al mismo tiempo, interrumpa la formación de gel de mucina, lo que reduce la viscosidad variable de la saliva para simplificar el procesamiento de muestras34,35.

a, Se probó la compatibilidad de las condiciones de lisis de saliva directa con el flujo de trabajo DISCoVER. Las réplicas que no se amplificaron se representan en 0 min. Las barras de error representan la media ± sd de las réplicas técnicas amplificadas, n = 4. IA, reactivo de inactivación; QE, extracción rápida. b, Esquema de la generación de muestras de saliva artificial, cuantificación a través de RT-qPCR y detección a través de DISCoVER para determinar la sensibilidad analítica. c, Cambio de pliegue en la señal DISCoVER en relación con NTC en muestras de saliva positivas para SARS-CoV-2 a los 5 minutos de la detección de Cas13. Las barras de error muestran la media ± sd con n = 20 réplicas biológicas. d, cambio de pliegue en la señal DISCoVER en relación con NTC en 30 muestras de saliva negativas recolectadas antes de noviembre de 2019, a los 5 minutos de la detección de Cas13.

A continuación, buscamos determinar la sensibilidad analítica y la especificidad de DISCoVER en muestras de saliva (Administración de Alimentos y Medicamentos, 2020). Para determinar el LOD, las reservas virales se diluyeron en serie en medio y se cuantificaron con qPCR con transcripción inversa (RT-qPCR) en relación con una curva estándar generada a partir de ARN genómico sintético. Estas concentraciones conocidas de virus se agregaron a muestras de saliva negativas recolectadas antes de noviembre de 2019 en condiciones BSL3 y se ejecutaron a través del flujo de trabajo DISCoVER (Fig. 4b). Realizamos 20 réplicas de DISCOVER para un rango de concentraciones de virus, determinando que 40 copias µl−1 de virus en saliva lisada directamente (Fig. 4c) era la concentración más baja probada donde se amplificaron al menos 19/20 réplicas. Para analizar la especificidad de DISCoVER, se analizaron muestras de saliva de 30 individuos diferentes negativos para SARS-CoV-2 sin ninguna señal de falso positivo (Fig. 4d). La adición de influenza A H1N1 y H3N2, influenza B y ARN sintético de coronavirus humano OC43 no inhibió la detección de SARS-CoV-2, ni resultó en una detección no específica, lo que validó aún más la especificidad de este ensayo (Fig. 4a complementaria) . Además, validamos DISCoVER en múltiples variantes preocupantes del SARS-CoV-2, incluida la variante B.1.1.7 altamente transmisible36 (Fig. 4b complementaria).

En entornos de punto de atención, la inactivación y la lisis de la muestra se confirmarían idealmente mediante un control de proceso interno (Fig. 5a). Esto es particularmente importante para el cribado de población basado en saliva, ya que algunas personas pueden tener una alta viscosidad o cargas de gel de mucina en sus muestras. De acuerdo con las pautas de la Administración de Alimentos y Medicamentos, es necesario un control de proceso interno positivo para determinar si una muestra es SARS-CoV-2 negativa, al mismo tiempo que indica la recolección adecuada de la muestra, la extracción de ácido nucleico, la configuración del ensayo y el funcionamiento del reactivo ('CDC 2019- Panel de diagnóstico de RT-PCR en tiempo real de nCoV - Instrucciones de uso'; https://www.fda.gov/media/134922/download). Si el control del proceso interno es negativo en una muestra clínica, el resultado debe considerarse no válido, a menos que se detecte el SARS-CoV-2, en cuyo caso se presume que la muestra es positiva. Para lograr esto, multiplexamos la amplificación agregando cebadores del gen N y del gen RNase P humano en el paso rLAMP. La detección posterior de Cas13 de RNasa P en muestras de saliva alcanzó la saturación en 5 minutos (Fig. 5b).

a, Esquema de la multiplexación de rLAMP con SARS-CoV-2 (gen N) y conjuntos de cebadores de control interno humano (RNasa P). b, señal DESCUBRE de muestras de saliva positivas para SARS-CoV-2 después de rLAMP multiplexada. Los valores son la media ± sd con n = 3 repeticiones técnicas. c, Cambio de pliegue en la señal DISCoVER en relación con NTC en 30 muestras nasales clínicas negativas a los 5 min de la detección de Cas13. d, cambio de veces en la señal DISCoVER en relación con NTC en 33 muestras clínicas nasales positivas a los 5 min de la detección de Cas13.

Datos fuente

A continuación, validamos DISCoVER en ARN total extraído de muestras de hisopos respiratorios de pacientes. El ARN sobrante de 30 muestras negativas y 33 muestras positivas (valores de Ct de 13 a 35) que se habían analizado previamente mediante RT-qPCR en un laboratorio de pruebas CLIA37 se utilizó como entrada para el ensayo de mesa DISCoVER. (Fig. 5c, d). Pudimos llamar correctamente a 30 de 30 muestras negativas dentro de los 5 minutos posteriores a la detección de Cas13: no se detectó ningún gen N en estas muestras, mientras que la señal de RNasa P se detectó de manera sólida. Es importante destacar que detectamos el gen N en 31 de las 33 muestras positivas dentro del mismo período de tiempo. Para las dos muestras negativas falsas, se detectó RNaseP pero no el gen N, lo que sugiere una diferencia en el LOD entre los dos ensayos. Sobre la base del conjunto de datos de muestras clínicas, informamos que la sensibilidad de DISCoVER en el ARN extraído es del 93,9 % con una especificidad del 100 %. Adicionalmente, observamos que el VPP es del 100%, con un VAN del 93,75%.

Finalmente, desarrollamos un dispositivo de microfluidos compacto y portátil para realizar el ensayo en un entorno que conduce a aplicaciones de punto de atención. La química se adaptó para funcionar en un cartucho de microfluidos impulsado por gravedad, con cámaras de reacción y detección de temperatura controlada (Fig. 6a). El dispositivo contiene bombas de desplazamiento de aire para el flujo fluídico controlado, un calentador resistivo para la cámara rLAMP y un enfriador/calentador termoeléctrico (TEC) para el enfriamiento y calentamiento de la cámara Cas13 (Fig. 6b). La detección de fluorescencia del ensayo se realizó mediante un detector personalizado compacto para la lectura de muestras en tiempo real.

a, Izquierda: ilustración del instrumento final en el que se inserta el cartucho. El recuadro muestra una imagen de todo el cartucho microfluídico accionado por gravedad. Derecha: imágenes de la cámara de dosificación de muestra y reacción de rLAMP (1), dosificación de rLAMP y cámara de mezcla Cas13 (2) y la cámara de detección (3). b, Ilustración frontal (izquierda) y posterior (derecha) de los componentes del instrumento, incluidos el sistema de detección, los calentadores, las válvulas accionadas por aire y las válvulas mecánicas. c, Esquema de la función del cartucho. La reacción se puede separar en cuatro pasos: medición de saliva (1), reacción de amplificación (2), medición posterior a la amplificación + mezcla de Cas13 (3) y reacción de Cas13 en cámaras de detección (4). Los reactivos almacenados en el cartucho se separan mediante una solución hidrofóbica patentada para evitar el inicio prematuro de las reacciones. Después de la reacción LAMP, la muestra se puede dividir en dos reacciones: la parte izquierda del cartucho expondrá la muestra al ARNcr del gen N (paso 3a), mientras que el lado derecho del cartucho actuará como control interno con solo ARNcr de RNasa P (paso 3b). Las muestras de saliva pasaron solo por el paso 3a, mientras que las muestras clínicas pasaron por los pasos 3a y 3b.

Se desarrolló un cartucho de microfluidos para la detección de muestras de saliva positivas o negativas (Fig. 6c). En la primera iteración del diseño del ensayo del cartucho, la muestra de saliva comercial positiva inactivada (75 °C durante 30 min) se carga en el cartucho y se mide activamente en la cámara rLAMP, donde se mezcla con los cebadores del gen N y la mezcla maestra rLAMP. Luego, la solución se calienta a 65 °C durante 30 min mientras los reactivos Cas13 se mantienen a 25 °C con el TEC. Al final de la reacción de rLAMP, se abre la válvula activa debajo de la cámara, lo que permite el flujo asistido por gravedad de 4 μl de la solución amplificada en un canal de medición. Solo el canal izquierdo (Fig. 6c, paso 3a) estaba abierto, lo que permitía que los reactivos Cas13 y su ARN CRISPR dirigido al gen N (ARNcr) se empujaran a través del canal de medición hacia la cámara de mezcla, donde luego se calentó a 37 ° C durante 10 min. El canal derecho (Fig. 6c, paso 3b) se agregó en la versión posterior del cartucho. Cas13 mezclado con la solución de rLAMP se aspiró a la cámara de detección y la reacción se controló mediante un detector de fluorescencia. Los tiempos de activación de microfluidos fueron ~ 8 min en todo el ensayo a bordo. Demostramos la detección de una serie de diluciones de 200 a 40 copias μl−1 de ARN genómico de SARS-CoV-2 en saliva entera, con un tiempo de reacción de principio a fin (incluido el paso de inactivación) de 78 min (Fig. 7a) . Esto indica la posible aplicación en el punto de atención de este sistema de microfluidos, donde DISCoVER puede detectar el ARN del SARS-CoV-2 a partir de muestras de saliva con sensibilidad atomolar.

a, Mapa de calor que representa el cambio de pliegue en la señal DISCOVER en muestras de saliva negativas y positivas en relación con el NTC. b, Mapa de calor que representa el cambio de pliegue en muestras clínicas positivas y negativas de ARN de SARS-CoV-2 de hisopos nasales, en relación con NTC. Los valores de Ct para el objetivo del gen N por detección de qPCR se enumeran en el eje del mapa de calor. c, Gráfico que representa la fluorescencia sin procesar a lo largo del tiempo para ambas cámaras de detección (azul para el gen RNasa P y rojo para el gen N) en muestras NTC (izquierda), negativas (centro) y positivas (derecha, Ct 16). Dentro de cada gráfico hay imágenes fluorescentes de la cámara de detección para el cartucho NTC (sin muestra viral), muestra clínica negativa y positiva (con RT-qPCR Ct que varía de 16 a 21). La cámara de detección de la izquierda es específica para la detección del gen N, mientras que la cámara de la derecha es específica para la RNasa P. d, Resultados de DISCoVER integrado en diez muestras clínicas de saliva y tres muestras clínicas de saliva negativas. El aumento de pliegue se calcula sobre un cartucho en blanco. Un aumento del doble de la fluorescencia sobre los cartuchos en blanco a los 50 minutos fue el criterio determinado experimentalmente para obtener resultados positivos. Las muestras con valor por debajo de este umbral a los 5 min se declararon negativas.

Datos fuente

A continuación, optimizamos el diseño del cartucho multiplexando la detección tanto del gen N como de la RNasa P durante el paso rLAMP para agregar un control de proceso interno (paso 3b en la Fig. 6c). Se realizó rLAMP multiplexado antes de que la reacción amplificada se dividiera en dos cámaras de detección Cas13, cada una de las cuales contenía un solo crRNA dirigido al gen N (cámara izquierda, paso 3a) o RNase P (cámara derecha, paso 3b) amplicón rLAMP (Fig. 6c) .

Luego volvimos a analizar los ARN de tres muestras clínicas respiratorias negativas y tres positivas (Ct 16-21) en el dispositivo DISCoVER completo (Fig. 7b). Detectamos correctamente el SARS-CoV-2 en los tres especímenes positivos (Fig. 7c, abajo), y detectamos solo la señal de RNasa P para los tres especímenes negativos (Fig. 7c, centro). Los cartuchos de NTC sin ninguna muestra viral se procesaron inicialmente para determinar la fluorescencia de referencia, lo que nos permitió determinar el cambio de pliegue de una muestra positiva desde la línea de base (Fig. 7c, arriba).

Para demostrar la robustez y la reproducibilidad de este sistema, procesamos 25 muestras artificiales adicionales en el dispositivo DISCoVER (20 muestras positivas artificiales a 500 copias μl–1 y 5 muestras negativas esperadas a 0 copias μl–1) (Datos extendidos Fig. 2 ). Para permitir un control sólido del proceso en especímenes artificiales elaborados a partir de muestras comerciales de saliva, optimizamos la amplificación multiplexada externa e interna mediante el uso de cebadores del gen ACTB (β-actina) humano en el paso rLAMP en lugar del cebador RNasa P (Fig. de datos extendidos). .2a,b). Para las muestras artificiales de saliva, pudimos acortar el paso de inactivación a 5 min a 95 °C y diseñamos un cartucho simplificado sin el paso de medición (Datos extendidos Fig. 2c) para acortar el tiempo total del ensayo a unos 50 min, incluida la muestra. inactivación38 y tiempo de actuación microfluídica. Las muestras con una señal integrada con un cambio de al menos dos veces con respecto al fondo se denominaron positivas, y las muestras que no alcanzaron ese umbral se consideraron negativas (Datos ampliados, Fig. 2d). Luego validamos el dispositivo en diez muestras de saliva clínica natural recolectadas en el campo de personas que dieron positivo por RT-qPCR para COVID-19 y tres muestras de saliva clínica natural de personas que dieron negativo (Fig. 7d y Tabla complementaria 5). Debido a las pautas de salud y seguridad ambiental con respecto a las muestras de saliva recolectadas en el campo, el tiempo de inactivación de la muestra se extendió a 20 minutos a 95 °C, lo que elevó el tiempo total del ensayo a 63 minutos para esta validación. Las 13 muestras clínicas de saliva recolectadas en el campo y las 25 muestras comerciales artificiales se detectaron correctamente con sensibilidad atomolar en un sistema de microfluidos completamente automatizado con una interacción mínima del usuario (video complementario).

Desarrollamos un flujo de trabajo de detección sin extracción de ARN, demostrando la detección atomolar del ARN del SARS-CoV-2 en saliva sin extraer. El ensayo DISCoVER combina un paso rLAMP de 30 minutos seguido de la transcripción T7 y la detección basada en Cas13, creando un protocolo de prueba rápido con sensibilidad atomolar y alta especificidad. Como cada producto LAMP modificado puede servir como sustrato para el inicio de la transcripción, la señal máxima de Cas13 se alcanza en menos de 5 minutos debido a la rápida generación de concentraciones de sustrato nanomolar (Fig. 3 complementaria). La combinación de amplificación sensible de ácidos nucleicos con especificidad y programabilidad mediadas por CRISPR tiene el potencial de permitir diagnósticos flexibles para la detección de diversos patógenos.

Primero demostramos el sistema DISCoVER en saliva no extraída, con el objetivo de permitir los pasos clave para un diagnóstico en el punto de atención. Dado que un ensayo basado en saliva puede no requerir personal médico para la recolección de muestras, es preferible a los hisopos nasofaríngeos, y la mayor comodidad de la recolección de muestras probablemente incentivará el cumplimiento y el compromiso del paciente con las pruebas frecuentes. También se ha demostrado que la saliva es una matriz de muestra confiable para las pruebas de asintomáticos en la vigilancia comunitaria, ya que las muestras de saliva tienen títulos virales comparables a los hisopos NP11. Para diversificar la cadena de suministro de muestras, DISCoVER también se puede aplicar a otras muestras, como hisopos nasofaríngeos e hisopos nasales autoadministrados.

En comparación con otros métodos de detección CRISPR como DETECTR y STOPCovid V2, DISCoVER no emplea un paso de extracción o purificación de muestras39,40, lo que elimina la dependencia de los kits de extracción de ARN comerciales y mantiene una sensibilidad comparable. El método de lisis directa empleado aquí explota reactivos comunes para la reducción química y la quelación de iones que son simples, ampliamente disponibles a bajo costo y estables a temperatura ambiente. DISCoVER mantiene la sensibilidad atomolar en comparación con otros ensayos de detección basados ​​en CRISPR que incluyen extracción y purificación de ARN viral20,39,41.

Validamos aún más la capacidad de DISCoVER para detectar múltiples variantes del SARS-CoV-2, específicamente la variante preocupante B.1.1.7, que ha sido de amplio interés médico debido a su posible mayor transmisibilidad36. Con el desarrollo adicional de conjuntos de sondas DISCoVER específicas para mutantes, puede ser posible detectar una variante de interés sobre otra de forma más selectiva. Aquí optimizamos para la vigilancia de pan-SARS-CoV-2, utilizando cebadores diseñados para detectar tantas variantes de SARS-CoV-2 como sea posible. Para probar aún más la especificidad de DISCoVER, analizamos el reconocimiento cruzado del ARN genómico viral de otros patógenos respiratorios comunes, incluida la influenza A H1N1 y H3N2, la influenza B y el coronavirus humano OC43. No observamos un efecto perceptible en la cinética o la especificidad de DISCoVER.

También demostramos la detección multiplexada de SARS-CoV-2 con un control interno humano durante la etapa de amplificación DISCoVER. Esto podría ampliarse para la detección multicolor utilizando enzimas Cas adicionales con motivos de escisión ortogonal, cada uno de los cuales actúa sobre indicadores específicos para distintos canales fluorescentes42. La multiplexación de orden superior se puede desarrollar aún más para los tipos de influenza A y B y otros virus respiratorios comunes que sería deseable detectar en una sola prueba. La capacidad inherente de las enzimas centrales en DISCoVER para convertir cualquier secuencia de ARN y ADN implica que se puede detectar cualquier patógeno que sea inactivado y lisado por nuestro protocolo.

Validamos DISCoVER en 33 muestras de pacientes positivas y 30 negativas, informando un VPP del 100 % y un VPN del 93,75 % para el ARN total extraído de hisopos nasales. Observamos una especificidad del 100 % y una sensibilidad del 93,9 % en comparación con las pruebas de qPCR para muestras con valores de Ct que oscilan entre 13 y 35. Finalmente, demostramos la integración de DISCoVER con un sistema de microfluidos y un dispositivo de detección. Con elementos simples de calentamiento y enfriamiento y bombas de desplazamiento de aire, el cartucho de microfluidos accionado por gravedad puede realizar el flujo de trabajo DISCoVER tanto en saliva positiva artificial como en muestras de pacientes en <50 minutos, incluida la inactivación, con una lectura de fluorescencia en tiempo real. Un mayor desarrollo y despliegue de este ensamblaje muestra potencial hacia un sistema de punto de atención, que facilitará en gran medida los diagnósticos moleculares frecuentes in situ.

Para la bacteria Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCas12a), el ARNcr y el ADN activador se sintetizaron a través de Integrated DNA Technologies (IDT). La detección con Cas12a se realizó utilizando 1 × tampón NEB 2.1 (B7202S), proteína LbCas12a 100 nM, crRNA 100 nM, concentraciones variables (100 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM) de ADN de doble cadena activador y 200 nM DNaseAlert (IDT). LbCas12a y crRNA se mezclaron previamente a una concentración de 10x en una proporción molar de 1:1 y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min antes de agregarlo a la reacción. La reacción se calentó a 37 °C con detección a intervalos de 15 s con un lector de microplacas multimodo Tecan Spark. Para la sustracción de fondo, los valores de fluorescencia de la reacción sin activador se sustrajeron de los valores de fluorescencia de las reacciones de muestra en cada punto de tiempo. La máxima fluorescencia se obtuvo mezclando DNase I y 200 nM DNaseAlert con 1x tampón NEB 2.1. Este valor de fluorescencia máxima saturada se dividió por la mitad; Se calculó el tiempo para alcanzar esta fluorescencia media máxima para cada concentración de activador.

Para Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a), el crRNA y el activador se sintetizaron comercialmente a partir de Synthego. La detección con Cas13a se realizó utilizando tampón de reacción Cas13 1x, proteína LbuCas13a 100 nM, crRNA 100 nM, concentraciones variables (100 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM) de ARN monocatenario y 200 nM Reportero Cas13 (IDT). LbuCas13a y crRNA se mezclaron previamente a una concentración de 10x en una proporción de 1:1 y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min antes de agregarlo a la reacción. El resto de la reacción, y el tiempo hasta la mitad de la fluorescencia máxima, se realizó o analizó como se describe anteriormente. La fluorescencia máxima se obtuvo mezclando RNasa A y el reportero Cas13 200 nM con tampón 1X. El tampón de reacción Cas13 5x (pH 6,8) está compuesto por HEPES-Na 100 mM pH 6,8 (Sigma), KCl 250 mM (Sigma), MgCl2 25 mM (Sigma) y glicerol al 25 % (Thermo Fisher).

La expresión y purificación de Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) se realizó como se describió previamente24 con modificaciones, que se resumen aquí: Cas13a marcado con His6–MBP–TEV se preparó en Escherichia coli Rosetta2 (DE3) cultivada en TB a 37 °C. Con una DO600 de 0,6–0,8, los cultivos se enfriaron en hielo durante 15 min antes de la inducción con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido 0,5 mM y la expresión durante la noche a 16 °C. Los sedimentos celulares que medían cerca de 10 ml en un tubo Falcon de 50 ml se resuspendieron en 100 ml de tampón de lisis cada uno. His6–MBP–TEV Cas13a soluble se aclaró mediante centrifugación a 15 000 g, luego se cargó en una columna HiTrap NiNTA de 5 ml (GE Healthcare) y se eluyó sobre un gradiente lineal de imidazol (0,01–0,3 M) mediante cromatografía líquida de proteína rápida (ÄKTA Pure) . Después de diálisis durante la noche y digestión con TEV, LbuCas13a se purificó mediante intercambio iónico y eliminación de MBP (5 ml HiTrap SP, MBP trap HP, GE Healthcare). Finalmente, se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (S200 16/60, GE Healthcare) con TCEP 1 mM suplementado en el tampón de filtración en gel, y las fracciones máximas se agruparon, concentraron y dividieron en alícuotas en tubos de tira de PCR, luego se congelaron en nitrógeno líquido.

La expresión y purificación de la bacteria Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCas12a) se realizó como se describió anteriormente con la adición de EDTA 1 mM en el tampón de diálisis para evitar la precipitación de proteínas durante la eliminación de etiquetas His por la proteasa TEV43.

Las reacciones de amplificación de ADN LAMP y rLAMP se realizaron con 2x LAMP Mastermix (NEB, E1700), 0,4 µl de colorante LAMP (NEB, E1700), 2 µl de mezcla de cebadores 10x (IDT; 16 μM de FIP/BIP, 4 μM FLoop/ BLoop y 2 μM de F3/B3), y 7,6 μl de muestra. Se añadieron ocho microlitros de muestra a las reacciones en las que no se añadió colorante. Para LAMP multiplexado, se añadió 1 μl de cebador de RNasa P con promotor T7 en el cebador BIP 5 'a los 20 μl de reacción. La detección se realizó a 65 °C durante 30–60 min en una máquina de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad) o en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Thermo). El tiempo hasta el umbral se calculó utilizando el modo de análisis de umbral único. El LOD para LAMP se determinó como la concentración en la que se observó amplificación con al menos el 95 % de las muestras. Las reacciones de amplificación de LAMP para muestras clínicas se realizaron con 2x LAMP Mastermix, 2 µl de mezcla de cebadores del gen 10× N, 1 µl de mezcla de cebadores RNase P y 5 µl de muestra en una reacción de 20 µl.

Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (Twist Bioscience, SKU 102024) se utilizó como plantilla para realizar la pantalla de cebadores y establecer los rangos de LOD. El volumen de plantilla a utilizar y la concentración final de plantilla en la reacción se calcularon sobre la base de la concentración inicial proporcionada por el vendedor como 106 copias µl−1.

La digestión de restricción de los productos de ADN de rLAMP se realizó en 3 µl de producto de rLAMP amplificado utilizando 2 µl de AfeI (NEB R0652L), 2 µl de tampón 10X CutSmart y 13 µl de agua. Estos 20 µl de reacción se calentaron a 37 °C durante 30 min. Los productos de rLAMP digeridos y no digeridos se trataron con 4 µl 1 U µl−1 RQ DNasa I y 1 µl de tampón de reacción 10X (Promega, M6101). La reacción se calentó a 37 °C durante 30 min y se añadió 1 µl de solución STOP (Promega M6101), seguido de incubación a 65 °C durante 10 min. Los productos rLAMP se analizaron utilizando geles de TBE-urea al 15 % (Thermo Fisher, EC68855BOX).

Se utilizó saliva negativa para SARS-CoV-2 (Lee Biosolutions, 991-05-S-25) para verificar la compatibilidad de la saliva con el flujo de trabajo DISCoVER. Todas las muestras de saliva se recolectaron antes de noviembre de 2019 según el proveedor. Cuando se usó ARN sintético viral, Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (SARS-CoV-2 aislado Wuhan-Hu-1) se agregó a la saliva comercial y se usó como plantilla para muestras simuladas. Para la determinación de LOD, las semillas virales de SARS-CoV-2 se añadieron a un fondo de saliva negativa bajo contención BSL-3 y se usaron como plantilla para muestras simuladas.

La saliva comercial se mezcló con reactivos de lisis y se calentó a 75 °C durante 30 min o 95 °C durante 5 min utilizando un bloque de calor. Twist Synthetic RNA se añadió después de completar la inactivación térmica de la saliva. Las semillas virales se agregaron a la saliva en la instalación BSL3 antes de la inactivación por calor. El reactivo de inactivación 1 fue TCEP 2,5 mM/EDTA 1 mM a una concentración de 1x cuando se mezcló con saliva. El reactivo de inactivación 2 fue TCEP 100 mM/EDTA 1 mM a una concentración de 1x cuando se mezcló con saliva. El reactivo de inactivación 3 fue Quickextract DNA (Lucigen QE09050), el reactivo de inactivación 4 fue Quickextract RNA (Lucigen QER090150) y el reactivo de inactivación 5 fue RNA/DNAShield (Zymo 76020-420).

Las muestras clínicas de saliva recolectadas en el campo del estudio de trabajadores agrícolas del Valle de Salinas se lisaron en un baño de perlas a 95 °C durante 20 minutos. Según ref. 37, el tiempo de inactivación utilizado para muestras artificiales hechas de saliva comercial también se puede usar aquí, pero no pudimos probar esto debido a las restricciones impuestas por UC Berkeley Environment, Health, and Safety (EH&S) en los protocolos de inactivación de muestras clínicas.

Para determinar el LOD, las reservas virales de SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020; BEI Resources, NR-52281) amplificadas una vez en células Vero-E6 (ATCC) se diluyeron en medio (DMEM + 10% FBS + 1% penicilina –estreptomicina) para obtener varias concentraciones, se añadieron a la saliva y se inactivaron añadiendo 1x de reactivo inactivador de bajo TCEP/EDTA y calentando las muestras a 75 °C. Las diluciones de virus en el medio se inactivaron calentándolas a 75 °C durante 30 min para cumplir con los requisitos de EH&S (UC Berkeley) y la RT-qPCR se realizó con el kit Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR (NEB E3006) y el gen E. - cebadores dirigidos para determinar la concentración final de ARN viral. Se utilizaron fragmentos de ARN genómico sintético (Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2) para obtener una curva estándar para los cálculos. La muestra simulada se detectó como positiva si el cambio de pliegue (proporción del valor de fluorescencia de la muestra al valor de fluorescencia del control sin molde) es superior a 2 en 5 min. El LOD para las muestras simuladas se determinó como la concentración en la que hubo detección con al menos el 95 % de las muestras.

El ARN extraído de muestras de hisopos respiratorios se obtuvo del Laboratorio Clínico del Innovative Genomics Institute (IGI). Estos especímenes fueron recolectados con fines diagnósticos de SARS-CoV-2, y previamente se les había realizado el ensayo LuNER37. En resumen, un proveedor de atención médica recolectó muestras respiratorias de los pacientes (de la orofaringe, las fosas nasales anteriores o el cornete medio). El ARN se extrajo en el laboratorio clínico de IGI utilizando un flujo de trabajo automatizado basado en el kit de aislamiento de ácido nucleico de patógenos/virales MagMAX (Thermo Fisher A42352) y luego se analizó en busca de genes N y E y RNaseP. Se anuló la identificación de las muestras y se proporcionó al ARN extraído valores clínicos de Ct para los experimentos descritos aquí.

Determinamos que un cambio doble entre una señal positiva y un control negativo a los 5 min en la detección de Cas13 es suficiente para distinguir las muestras de saliva positivas artificiales y negativas esperadas. Este umbral derivado experimentalmente se usó para llamar positivos y negativos en muestras clínicas. Se determina que una muestra es positiva si tanto el gen N como el cambio de la señal de control del proceso es superior al doble en 5 min. Se determina que una muestra es positiva si el gen N muestra un cambio doble en 5 minutos, incluso si el control del proceso no muestra un cambio doble, ya que esto podría indicar pérdida o degradación de material celular humano en la saliva. Se determina que una muestra es negativa si el control del proceso muestra un cambio de >2 veces en 5 min mientras no aparece la señal del gen N. Si tanto el gen N como el cambio de pliegue del control del proceso están por debajo de 2, la prueba se considera inválida.

Se diseñó una guía LbuCas13a dirigida al SARS-CoV-2 priorizando la sensibilidad, la especificidad y la estructura secundaria prevista. Se identificaron veintiséis espaciadores candidatos de 20 nucleótidos dentro de la región del amplicón N set 1 del genoma de referencia del SARS-CoV-2 (wuhCor1), dirigidos tanto a la cadena directa como a la inversa. La sensibilidad se determinó alineando por pares los genomas de SARS-CoV-2 disponibles de GISAID con el genoma de referencia y calculando el número de discrepancias entre la muestra y el genoma de referencia para cada espaciador candidato. Luego se calculó el porcentaje de genomas de SARS-CoV-2 detectados por cada espaciador, con no más de un desajuste, y se descartaron los espaciadores que coincidían con menos del 99 % de los genomas de SARS-CoV-2. Para garantizar la especificidad, los espaciadores candidatos que se determinó que eran sensibles se alinearon con otros genomas de referencia de coronavirus humanos, específicamente, SARS, MERS, 229E, NL63, OC43 y HKU1. Se descartaron los espaciadores que coincidían con cualquiera de estos otros coronavirus con dos o menos desajustes. Los espaciadores restantes también se alinearon con el transcriptoma humano, lo que nuevamente permitió dos desajustes, y los espaciadores con alineaciones se descartaron para garantizar que la guía no fuera complementaria a las transcripciones humanas fuera del objetivo. Para asegurarse de que las secuencias espaciadoras permitieran la unión de Cas13a al andamio de repetición directa, la repetición concatenada y la secuencia espaciadora se plegaron usando RNAfold y se evaluó la estructura de horquilla correcta en la repetición directa y la cadena simple en la secuencia espaciadora. De los cinco posibles espaciadores del SARS-CoV-2 que superaban nuestros criterios de sensibilidad, especificidad y estructura, se eligió uno para su uso como ARN guía. Se seleccionó una guía de control dirigida a la RNasa P con los mismos criterios para evitar la coincidencia de transcripciones humanas y del SARS-CoV-2 y para garantizar una estructura de ARN adecuada. En el experimento de validación (Fig. 7d y Datos extendidos Fig. 2d), debido a la diferencia en la composición de la saliva entre las muestras comerciales y clínicas, la amplificación multiplexada se optimizó interna y externamente mediante el uso de cebadores del gen ACTB humano en el rLAMP. paso en lugar del cebador RNase P. Las guías ACTB se eligieron utilizando la misma tubería que N set 1 y RNase P.

La transcripción se realizó en el producto rLAMP amplificado usando 2 µl de 1 mg ml−1 de polimerasa T7, 4 µl de mezcla NTP 100 mM (NEB N0450), 1 µl de DTT 200 mM, 4 µl de tampón de transcripción 5x, 2 µl de Producto LAMP y 7 µl de agua. Estos 20 µl de reacción se calentaron a 37 °C durante 30 min. El tampón de transcripción 5x está compuesto por Tris-Cl 150 mM, pH 8,1 a temperatura ambiente, MgCl2 125 mM, Triton X-100 al 0,05 % (Sigma Aldrich, X100) y espermidina 10 mM, y se almacena a -20 °C.

La detección de Cas13 se realizó como una reacción de 20 µl usando 2 µl de producto de transcripción diluido 1:100 de LAMP, 1 µl de tampón de reacción Cas13 5×, 2 µl de indicador Cas13 2 µM, 2 µl de ribonucleoproteína (RNP) 10×, 13 µl de tampón de reacción 1x Cas13. El RNP 10x se preparó como una proporción 2:1 de Cas13:crRNA con una concentración final de Cas13 de 20 nM y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min antes de agregarlo a la reacción. Esta reacción de 20 µl se calentó a 37 °C y se leyó cada 30 s en un lector de microplacas multimodo TECAN Spark usando el canal FAM (excitación 485 nm, emisión 535 nm).

Se realizó T7 en un solo recipiente y Cas13 combinando 2 µl de 1 mg ml−1 de polimerasa T7, mezcla de NTP 20 mM, DTT 10 mM y MgCl2 25 mM con la mezcla de reacción Cas13. Se utilizan dos microlitros de una dilución 1:100 del producto rLAMP para 20 µl de reacción T7-Cas13 en un solo recipiente. Para analizar muestras clínicas, se utilizan 2 µl de producto 1× rLAMP para 20 µl de reacción T7-Cas13 de un solo recipiente.

Se añadió ARN viral sintético de influenza A H1N1 (Twist Bioscience, SKU 103001), influenza A H3N2 (Twist Bioscience, SKU 103002), influenza B (Twist Bioscience, SKU 103003) y coronavirus humano OC32 (Twist Bioscience, SKU 103013) saliva (Lee Biosolutions, 991-05-S-25), con y sin Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2. rLAMP y la transcripción de T7 en un solo recipiente como se describe anteriormente se realizaron con el gen N crRNA.

El ARN viral sintético de la variante del SARS-CoV-2 B.1.1.7_710528 Control 14 (Twist Bioscience, SKU 103907) y la variante del SARS-CoV-2 B.1.1.7_601443 Control 15 (Twist Bioscience, SKU 103909) se añadió a la saliva inactivada (Lee Biosolutions, 991-05-S-25). La transcripción de rLAMP y T7 de un solo recipiente como se describe anteriormente se realizó con el ARNcr del gen N.

Wainamics Inc. diseñó y fabricó un instrumento prototipo. El instrumento se diseñó específicamente para demostrar la viabilidad del sistema y con características que permitirían una transición fácil a un instrumento de uso final fabricable. Se integró una combinación de componentes estándar, componentes personalizados (diseñados en SolidWorks), una placa electrónica personalizada basada en un microcontrolador Teensy 3.2 y software personalizado (escrito en C) para fabricar un instrumento prototipo. El sistema estaba destinado a demostrar la viabilidad del ensayo a bordo de un prototipo de dispositivo termoplástico de forma automatizada. Se tuvo cuidado de garantizar que todos los elementos de diseño fueran transferibles a los métodos de fabricación de gran volumen comúnmente utilizados (por ejemplo, troquelado, moldeado por inyección, etc.).

Los componentes diseñados a medida para el sistema prototipo se fabricaron utilizando métodos de fabricación comunes, incluido el mecanizado comercial de control numérico por computadora (CNC) (Protolabs) de componentes de aluminio y Delrin, modelado por deposición fundida (FDM), impresión 3D (Dremel 3D45) y estereolitografía (SLA) 3D. impresión (Formlabs Form3). Los componentes disponibles comercialmente utilizados consistieron en una bomba de jeringa Norgren Kloehn V6c con válvula rotativa de ocho vías, válvulas de solenoide de tres vías Burkert Tipo 6724, un controlador de temperatura de Laird Thermal Systems (TC-XX-PR-59) que controla una unidad TEC de Marlow Industries (NL2064T-11AB), ventiladores de control (Sunon Fans MF25101V1-1000U-A99) y calentadores de cartucho resistivo (E3D, 12 V 40 W). Una interfaz gráfica de usuario personalizada en una PC con Windows 10 permitía al usuario controlar diversas funciones del sistema y el cartucho (es decir, activar valores, controlar los volúmenes de aire desplazados al cartucho por la bomba, controlar el caudal de aire desplazado, controlar las temperaturas del calentador, etc). La grabación de secuencias de comandos permitió al usuario generar y registrar secuencias de comandos del sistema del instrumento que se utilizaron para ejecutar automáticamente el ensayo en el cartucho para garantizar la precisión y la coherencia en todas las ejecuciones del ensayo del cartucho.

Se midió que el tiempo de actuación fluídica era ~8 min. Un elemento clave del instrumento es un colector personalizado que forma un sello hermético al cartucho de plástico cuando se acopla, lo que permite la activación del líquido dentro del cartucho. El colector consta de siete puertos conectados con válvulas comerciales a una sola bomba de jeringa personalizada. Los puertos están sellados al cartucho mediante juntas integradas en el colector. En el cartucho de plástico, cada uno de los puertos está aislado del instrumento por una membrana hidrofóbica que permite el paso de aire pero no de fluidos acuosos, protegiendo así el instrumento de la contaminación por cualquier reactivo de ensayo o saliva. Cuando se aplica presión de aire positiva o presión negativa a los puertos del colector apropiados, la presión empujará o jalará líquido dentro del cartucho de acuerdo con el caudal y el volumen de aire desplazado. Las válvulas del colector también pueden ventilar a la atmósfera, lo que permite que se equilibre la presión dentro del cartucho. El volumen de aire desplazado y las velocidades de flujo de la bomba se ajustan para permitir una mezcla completa de los reactivos y una pérdida mínima de volumen residual dentro de los canales.

El prototipo general del instrumento mide aproximadamente 12′ de ancho, 18′ de profundidad y 12′ de altura. Un instrumento de diseño personalizado con placa electrónica personalizada, colector personalizado con bombas y válvulas integradas y óptica personalizada podría ser tan pequeño como 8 'x 9' × 9 '.

El calentador resistivo y el TEC se ajustan midiendo las temperaturas alcanzadas dentro del cartucho durante el funcionamiento utilizando un cartucho con termopares integrados. La temperatura establecida suele ser de 5 a 8 °C más alta que la temperatura real dentro del cartucho debido a las pérdidas de transferencia de calor a través del plástico. Los puntos de referencia para los calentadores se establecen en consecuencia con una compensación correspondiente. Para el cartucho utilizado en las pruebas clínicas, el calentador de la cámara de reacción LAMP se ajustó a 72 °C y la cámara de detección Cas13 se ajustó a 39 °C.

El cartucho fue diseñado por Wainamics Inc. en SolidWorks. Los cartuchos prototipo se diseñaron y fabricaron teniendo en cuenta la capacidad de fabricación. Se laminaron capas de metacrilato de polimetilo cortadas con láser de varios espesores (0,25 a 1 mm, Clarex Precision de Nitto Jushi Kogyo Co.) usando adhesivos sensibles a la presión compatibles con PCR (Adhesivo Research AR90880 y AR92712) para lograr las geometrías de canal deseadas. Todas las geometrías de los canales se diseñaron para traducirse y reproducirse fácilmente mediante técnicas de fabricación en serie, como el moldeo por inyección y el troquelado rotativo. Cada capa se cortó con láser de CO2 (BossLaser) y todo el cartucho fue ensamblado a mano por Wainamics Inc. Se usaron membranas hidrofóbicas (Sterlitech PTFE029025) para permitir el paso de gas, no líquido, para evitar la contaminación del instrumento prototipo. Se utilizó lámina de caucho de silicona (McMaster-Carr 1460N11) para fabricar válvulas de cartucho accionables para controlar el flujo de la solución.

Se usó un cartucho que contenía termopares (Omega Engineering) incrustados en epoxi térmico (McMaster-Carr, #7548A11) para fines de calibración de temperatura. Los ajustes de potencia para los calentadores resistivos y TEC se ajustaron manualmente utilizando las lecturas del cartucho de calibración de temperatura. En la figura complementaria 5 se muestra una ejecución de calibración de temperatura utilizando la retroalimentación de un cartucho de prueba térmica. La diferencia entre la temperatura establecida y la temperatura registrada aumenta a temperaturas más altas (no es estable). Por lo tanto, es importante calibrar el sistema verificando la temperatura establecida necesaria para que coincida con la temperatura de reacción requerida.

Debido a las pérdidas de reactivos a lo largo de los canales, se realizaron múltiples experimentos de calibración para garantizar los volúmenes de reacción correctos (Tabla complementaria 3). Para medir la cantidad de volumen perdido entre el 'reservorio de inicio' y la 'cámara de destino', el protocolo experimental fue el siguiente: Se cargó un volumen dado de tinte fluorescente en el reservorio de inicio. Por otra parte, se añadió un volumen conocido de PBS con Tween-20 al 0,1 % a la cámara de "destino". Se ejecutó la secuencia fluídica experimental para hacer fluir el colorante desde el depósito hasta la cámara. Una vez mezclado, se extrajo el colorante diluido en la cámara y se evaluó su fluorescencia mediante un lector de placas. En el lector de placas, se evaluó simultáneamente una titulación conocida del tinte para crear la curva de calibración. Al comparar la fluorescencia del tinte extraído del cartucho con la curva de calibración, pudimos deducir el volumen del tinte recuperado después del flujo fluídico y la cantidad de tinte perdido en los canales. Se usó una solución de fluoresceína 100 nM (Sigma F6377) en PBS 1x (Sigma P5493) con Tween-20 al 0,1 % (Sigma P1379) con fines de prueba visual de fluidos. También se utilizó FamT10 (IDT) en PBS 1x en varias concentraciones (0 nM a 200 nm) como solución de calibración para la caracterización óptica del cartucho con el sistema de detección.

Para obtener imágenes de los volúmenes de muestra de 40 μl en las cámaras de reacción, necesitamos un campo de visión (FOV) bastante grande y una apertura numérica (NA) modesta que permita una profundidad de enfoque suficiente sin que se superpongan las imágenes de los pozos de muestras adyacentes. Para lograr esto en un dispositivo compacto de costo relativamente bajo, diseñamos un sistema personalizado usando un par de oculares (Edmund Optics, PN # 66-208 y 66-210), lo que produce un sistema con NA 0.09, FOV diámetro 12.0 mm, y aumento de 0,54 (elegido para que coincida con el tamaño del sensor de la cámara Thorlabs CS165MU1 con el FOV; el muestreo en ≥Nyquist no es necesario en esta aplicación de "cubo ligero") (Tabla complementaria 4). El sistema general es compacto, con una longitud de pista nominal (de la muestra a la cámara) de ~75 mm. Los filtros de fluorescencia eran de Chroma Technologies, ET470/40x, T495lpxr y ET535/70m, con excitación proporcionada por un LED de 965 mW y 470 nm (Thorlabs M470L4 impulsado por un LEDD1B), proporcionando un máximo de ~225 mW en la muestra de 12 mm de diámetro FOV en una geometría Kohler de epi-iluminación. El control personalizado del hardware de imágenes se implementó en MATLAB (2020a), utilizando controladores Thorlabs y SDK (ThorCam) para controlar la adquisición de la cámara y la comunicación en serie a una placa Arduino Bluefruit Feather para activar electrónicamente la iluminación LED en sincronía con la adquisición de imágenes de la cámara.

El cartucho múltiplex tiene dos cámaras de detección tanto para el gen N como para el control interno (RNaseP o ACTB). Todos los días, antes de ejecutar el ensayo en muestras de saliva, se tomaron imágenes de un cartucho en blanco lleno de tampón y de un portaobjetos fluorescente para las correcciones de uniformidad de iluminación y de fondo, respectivamente. Se seleccionó una región de interés (ROI) (150 × 400 píxeles) en cada cámara, y se tomaron imágenes del cartucho en blanco con la misma ganancia y tiempo de exposición que los experimentos posteriores (2 dB y 150 ms). La intensidad medida en cada ROI se usó para normalizar las imágenes de muestra al fondo. Para corregir la falta de uniformidad de la iluminación, se tomaron imágenes de un portaobjetos fluorescente limpio con una ganancia de 1 y una exposición de 0,1 s.

Tanto la corrección de la uniformidad del fondo como la de la iluminación se realizaron mediante un método de corrección prospectivo44. En resumen, las intensidades medidas para cada píxel, x, de las cámaras de reacción se relacionan con las intensidades reales a través de

donde S es un factor de escala lineal que modela las distorsiones de una imagen debido a una iluminación no uniforme; B es la señal de fondo dependiente de la iluminación que explica la dispersión y la fluorescencia de fondo de las cámaras de muestras; y D es un término aditivo de luz cero, que se debe al desplazamiento de la cámara y al ruido térmico de patrón fijo. S, B y D se determinaron a partir de imágenes de un cartucho en blanco y un portaobjetos fluorescente uniforme adquiridos antes de los experimentos al comienzo de cada día. Las imágenes experimentales se procesaron de acuerdo con la ecuación (1) para recuperar señales de muestra corregidas. Se desarrolló un script de MATLAB personalizado para controlar los parámetros de iluminación y detección, el tiempo de exposición, la ganancia, el intervalo de tiempo entre cada adquisición de imágenes y el número total de fotogramas a capturar. El script también permitió una vista previa en vivo del cartucho para una alineación y selección óptimas de ROI dentro de las cámaras de reacción. Una vez que se inició el ensayo, el script también activó automáticamente la adquisición de imágenes a medida que la mezcla de reacción se bombeaba a las cámaras de detección. En este punto, el script mostraba imágenes capturadas en cada momento y la intensidad media correspondiente de los ROI seleccionados durante el experimento.

Inicialmente se desarrolló un sistema de prueba de concepto con un solo canal de reacción para la detección del gen N positivo o negativo. En este sistema se usó saliva comercial (Lee Biosolutions, 991-05-S-25), enriquecida con ARN de SARS-CoV-2 sintético Twist como muestra positiva o con agua para muestra negativa, en este sistema para la calibración del instrumento y resultados rápidos. Como se muestra en la Fig. 5, la reacción se puede dividir en cuatro pasos: (1) dosificación de saliva, (2) reacción LAMP, (3) dosificación LAMP + mezcla de ARNcr del gen Cas13/N y (4) reacción Cas13 en la cámara de detección. Debido a las pérdidas de reactivos a lo largo de los canales, se realizaron múltiples experimentos de calibración como se describió anteriormente, para garantizar los volúmenes de reacción correctos (como se menciona aquí; los volúmenes de carga se pueden encontrar en la Tabla complementaria 3). En el paso 1 (parte superior), la bomba de jeringa aspira activamente 16 μl de saliva en el canal de dosificación. La bomba de jeringa puede empujar activamente el cebador (4 μl) y la mezcla maestra (20 μl), separados mediante una solución hidrófoba patentada (35 μl), a través del canal de medición hacia la cámara de mezcla LAMP. Se introducen 50 μl adicionales de aire (a 250 μl min-1) en la cámara para permitir que las burbujas de aire mezclen la reacción LAMP (paso 2). El calentador resistivo se enciende para calentar la cámara LAMP a 65 °C durante 30 min y permitir que ocurra la reacción. Simultáneamente, el TEC se ajusta a 25 °C para mantener Cas13, la mezcla T7, el extintor de fluorescencia (FQ) y los reactivos crRNA a temperatura ambiente. Después de la reacción LAMP (paso 3), la válvula activa inferior se abre y la gravedad hará que 4 μl del producto LAMP fluyan a través del canal de medición izquierdo. La bomba de jeringa empuja activamente 32 μl de T7mix + FQ con 4 μl de ARNcr del gen Cas13 + N a través de los canales de medición hacia la cámara de mezcla izquierda. Se introducen 50 μl adicionales de aire en ambas cámaras para mezclar. En el paso 4, se aspiran activamente 45 μl de la solución en las respectivas cámaras de detección. El TEC se enciende a 37 °C y las imágenes de fluorescencia se adquieren cada 15 s durante 15 a 30 minutos.

Una vez que el cartucho detectó muestras de saliva positivas y negativas, diseñamos un nuevo cartucho para la detección clínica de ARN extraído. Estas muestras fueron muestras clínicas sobrantes extraídas del laboratorio de pruebas de Enmiendas para la Mejora del Laboratorio Clínico (CLIA). Como solo pudimos acceder a 5 μl por muestra clínica, no se utilizaron los fluidos de medición de saliva (paso 1 en la Fig. 5c). En cambio, la muestra clínica se cargó directamente en la cámara LAMP. La reacción se puede separar en los tres pasos siguientes de la Fig. 5c: (2) reacción LAMP, (3) medición LAMP + mezcla Cas13/crRNA y (4) reacción Cas13 en cámaras de detección. También multiplexamos los pasos 3 y 4 para que la parte izquierda del cartucho exponga la muestra al ARNcr del gen N (paso 3a) mientras que el lado derecho del cartucho actuará como control interno con ARNasa P crRNA (paso 3b), para mostrar que había suficiente material celular presente en la muestra. A continuación informamos los volúmenes de reacción; los volúmenes de carga se pueden encontrar en la Tabla complementaria 3. En el paso 2, los 5 μl de muestra clínica se cargan directamente en la cámara LAMP. A continuación, la bomba de jeringa puede empujar activamente el cebador (4 μl) y la mezcla maestra (20 μl), separados mediante una solución hidrófoba patentada (35 μl), hacia la cámara de mezcla LAMP. Se introducen 50 μl adicionales de aire en la cámara para permitir que las burbujas de aire mezclen la reacción LAMP. El calentador resistivo se enciende para calentar la cámara LAMP a 65 °C durante 30 min y permitir que ocurra la reacción. Simultáneamente, el TEC se ajusta a 25 °C para mantener los reactivos Cas13 y crRNA a temperatura ambiente. El paso 3 dividirá la muestra LAMP en dos reacciones: la parte izquierda del cartucho expondrá la muestra al ARNcr del gen N (paso 3a), mientras que el lado derecho del cartucho actuará como control interno con solo ARNcr de RNasa P (paso 3b ). Después de la reacción LAMP, las dos válvulas activas inferiores se abren y la gravedad hará que 4 μl del producto LAMP fluyan a través de los canales de medición pasivos izquierdo y derecho. La bomba de jeringa empuja activamente 32 μl de T7 mix + FQ con 4 μl de Cas13 + crRNA (gen N en el reservorio izquierdo y RNasa P en el reservorio derecho) a través de los canales de medición hacia la cámara respectiva del gen N (izquierda) y la RNasa P (derecha). Se introducen 50 μl adicionales de aire en ambas cámaras para mezclar. En este punto, se aspiran activamente 45 μl de la solución en las respectivas cámaras de detección (paso 4). La cámara izquierda tendrá el producto LAMP mezclado con Cas13 y el gen N, mientras que la cámara derecha, control interno, mezclará LAMP con Cas13 y RNase P crRNA. El TEC se enciende a 37 °C y las imágenes de fluorescencia se adquieren cada 15 s durante 15 a 30 minutos.

Debido a la dificultad de acceder a un gran número de muestras clínicas, demostramos la solidez del sistema analizando la saliva de distintos individuos (Lee Biosciences) donde se generaron muestras positivas al introducir ARN Twist Synthetic SARS-CoV-2 en la matriz de saliva. Debido a la diferente composición de saliva de las muestras comerciales, seleccionamos controles de proceso alternativos (datos extendidos, Fig. 2a) para abordar la señal variable de RNase P. Primero, probamos sistemáticamente la inserción de secuencias del promotor T7 en diferentes regiones de cebadores LAMP para ACTB, tanto en saliva comercial como en extracto de ARN de células HEK 293FT (Datos extendidos Fig. 2b), y realizamos una pequeña guía de pantalla para integrarlo en el Tubería DISCoVER (Datos extendidos Fig. 2c). Debido a las señales del gen N más bajas en los experimentos iniciales en relación con ACTB, optimizamos la amplificación multiplexada para que consistiera en una reacción con una proporción de 2: 1 del gen N al cebador ACTB y la adición de polimerasa Bst 2.0 adicional. Luego analizamos 25 muestras de saliva individuales, es decir, 20 muestras como positivos artificiales que contenían ARN genómico de SARS-CoV-2 y 5 muestras negativas (Datos extendidos Fig. 2d) para demostrar la reproducibilidad y solidez de este flujo de trabajo.

El diseño del cartucho se simplificó para permitir un diseño más compacto, mezcla mejorada y precisión de volumen (Datos extendidos Fig. 2d). La reacción se puede dividir en los siguientes pasos: (1) reacción LAMP, (2) medición LAMP + mezcla Cas13/crRNA y (3) reacción Cas13 en cámaras de detección. Los pasos 2 y 3 se multiplexaron para que la parte izquierda del cartucho exponga la muestra al ARNcr del gen N (paso 2a), mientras que el lado derecho del cartucho actuará como control interno con ARNcr ACTB (paso 2b), para mostrar que había suficiente material celular en la muestra. En el paso 1, se cargan 18 μl de muestra de saliva directamente en la cámara de muestras. La bomba de jeringa podría empujar activamente una solución hidrófoba patentada (30 μl), así como el cebador (10 μl) y la mezcla maestra (40 μl), separados a través de un poco más de solución hidrófoba (15 μl), en la cámara de mezcla LAMP. Se introducen 50 μl adicionales de aire en la cámara para permitir que las burbujas de aire mezclen la reacción LAMP. El calentador resistivo se enciende para calentar la cámara LAMP a 63 °C durante 45 min y permitir que ocurra la reacción. Se empuja algo de aire cada 15 minutos para mezclar la solución y mejorar el resultado de la reacción. Simultáneamente, el TEC se ajusta a 25 °C para mantener los reactivos Cas13 y crRNA a temperatura ambiente. El paso 2 dividirá la muestra LAMP en dos reacciones: la parte izquierda del cartucho expondrá la muestra al ARNcr del gen N (paso 2a), mientras que el lado derecho del cartucho actuará como control interno con solo ARNcr ACTB (paso 2b) . Después de la reacción LAMP, las dos válvulas activas inferiores se abren y la gravedad hará que 4 μl del producto LAMP fluyan a través de los canales de medición pasivos izquierdo y derecho. La bomba de jeringa empuja activamente 40 μl de T7 mix + FQ, 15 μl de solución hidrofóbica y 10 μl de Cas13 + crRNA (gen N en el reservorio izquierdo y ACTB en el reservorio derecho) a través de los canales de medición hacia el respectivo gen N (izquierda) y ACTB ( derecha) cámara. Se introducen 50 μl adicionales de aire en ambas cámaras para mezclar. En este punto, se aspiran activamente 45 μl de la solución en las respectivas cámaras de detección (paso 3). La cámara izquierda tendrá el producto LAMP mezclado con ARNcr de gen Cas13 y N, mientras que la cámara derecha, control interno, también tendrá el producto LAMP pero mezclado con ARNcr de Cas13 y ACTB. El TEC se enciende a 37 ° C y las imágenes de fluorescencia se adquieren cada 10 s durante 30 min. El cambio de pliegue se determinó entre 5 y 10 minutos para llamar al resultado del ensayo (Fig. 5g y Datos extendidos Fig. 2d).

Las muestras clínicas de saliva recolectadas en el campo se recolectaron de adultos mayores de 18 años que residían en California y estaban recibiendo una prueba de COVID (antígeno, PCR o prueba de amplificación mediada por transcripción) en la Clínica de Salud del Valle de Salinas o cualquier otra prueba del Valle de Salinas. sitio (número de protocolo UC Berkeley IRB 2021-04-14268). Los participantes cuyas muestras se analizan en este cuerpo de trabajo incluyeron trabajadores agrícolas y no agrícolas. Las mujeres embarazadas también fueron invitadas a participar. La evaluación y la inscripción se realizaron en persona en las clínicas que realizan las pruebas de COVID-19, así como por teléfono para los pacientes que recientemente dieron positivo en la Clínica de Salud del Valle de Salinas. Para todo el reclutamiento y la recopilación de datos, el personal clínico y de investigación usó máscaras y guantes. Para la recolección en persona, los investigadores de campo proporcionaron al participante un recipiente de boca abierta y le pidieron que escupe en él hasta una marca predeterminada de ~3 ml. Luego se le dio al participante una tapa para el recipiente, una toallita desinfectante y una toalla de papel. Luego se le pidió al participante que tapara herméticamente el recipiente y limpiara todo el exterior del recipiente con la toallita. El investigador de campo, con guantes y otros equipos de protección personal, recibió el contenedor, lo etiquetó con una pegatina que contenía el número de identificación del participante y la fecha de recolección, y lo colocó en una hielera con bolsas de hielo. Para el reclutamiento en el hogar de personas con COVID positivo, los investigadores de campo llamaron por teléfono a los pacientes que dieron positivo y determinaron su interés en participar en un estudio de investigación. Luego, el investigador de campo entregó un kit de recolección de muestras en el hogar del participante. El kit incluía instrucciones visuales y escritas para la recolección de muestras, así como un recipiente de boca abierta preetiquetado. El investigador de campo guió al participante a través de la recolección de muestras por teléfono. El investigador de campo recuperó el kit del participante al finalizar y colocó la muestra de saliva en una hielera con bolsas de hielo. Luego, las muestras se almacenaron a -80 °C hasta el transporte a UC Berkeley en hielo seco y, posteriormente, se mantuvieron nuevamente a -80 °C. Todas las muestras se recolectaron bajo la supervisión ética del Comité para la Protección de Sujetos Humanos de UC Berkeley.

Cuando estaban listas para la prueba, las 66 muestras disponibles del estudio se descongelaron y se inactivaron con calor durante 20 minutos a 95 °C según las pautas universitarias de EH&S en BSL-2, a pesar de que 5 minutos fueron suficientes para la inactivación con saliva37. Como las muestras de saliva no se habían analizado previamente, se realizó RT-qPCR en cada muestra para obtener un perfil de positividad del conjunto de muestras. La RT-qPCR se realizó con el kit Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR (NEB E3006) en cebadores dirigidos al gen N para determinar la concentración final de ARN viral y cebadores dirigidos a ACTB como control del proceso. De las 66 muestras examinadas, se eligieron 13 muestras (10 positivas, 3 negativas) en un rango de valores Ct (Tabla complementaria 5) para ejecutarlas en el dispositivo de microfluidos DISCoVER para validar la capacidad del dispositivo para diferenciar muestras negativas y positivas que ya estaban confirmadas por un ensayo estándar de oro en RT-qPCR. Cada una de estas muestras de donantes de saliva se ejecutó en el sistema de microfluidos de acuerdo con el protocolo descrito en el flujo de trabajo de muestras artificiales y se analizó de la misma manera con una observación del aumento de fluorescencia dos veces sobre los cartuchos de fondo como indicador de positividad para cada objetivo (Fig. .5g).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todas las secuencias de ácidos nucleicos utilizadas se proporcionan en el manuscrito o en la Información complementaria. Los datos sin procesar de las muestras clínicas se proporcionan como datos de origen. Todos los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante este estudio están disponibles para fines de investigación de los autores correspondientes a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código utilizado para controlar el hardware de imágenes está disponible como información complementaria.

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Descargar referencias

Agradecemos a todos los miembros de los laboratorios Hsu, Savage, Fletcher y Doudna por su apoyo y asesoramiento, ya AJ Ehrenberg, E. Charles y B. Thornton por sus útiles debates. Agradecemos a M. Ott y R. Kumar por su ayuda en la coordinación de la recolección de muestras de saliva natural. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Shurl & Kay Curci, donantes anónimos, Emergent Ventures, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y DARPA bajo el premio N66001-20-2-4033. Los puntos de vista, las opiniones y/o los hallazgos expresados ​​pertenecen a los autores y no deben interpretarse como que representan los puntos de vista o las políticas oficiales del Departamento de Defensa o del Gobierno de los EE. UU. Agradecemos a los NIH por su apoyo (PDH R01GM131073, DP5OD021369 y DFS R01GM127463). JAD es investigador del Instituto Médico Howard Hughes (HHMI). AF recibió el apoyo de una beca de investigación para graduados de la NSF.

Estos autores contribuyeron igualmente: Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid.

Departamento de Bioingeniería, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid, Sungmin Son, Abdul Bhuiya, Maria Diaz de Leon Derby, Andrew R. Harris, Liana F. Lareau, Daniel A. Fletcher y Patrick D. Hsu

Instituto de Genómica Innovadora, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid, Noam Prywes, Maria Lukarska, Dylan CJ Smock, Gavin J. Knott, Qi Dang, Eli Dugan, Shin Kim, Tina Y. Liu, Jennifer R. Hamilton, Henry Lin-Shiao, Elizabeth C. Stahl, Connor A. Tsuchida, Peter Giannikopoulos, Matthew McElroy, Shana McDevitt, Arielle Zur, Iman Sylvain, Alison Ciling, Madeleine Zhu, Clara Williams, Alisha Baldwin, Erica A. Moehle, Liana F. Lareau, Jennifer A. Doudna y Patrick D. Hsu

Universidad de California, Berkeley–Universidad de California, San Francisco Programa de Posgrado en Bioingeniería, Berkeley, CA, EE. UU.

Sita S. Chandrasekaran, Alison Fanton, Bérénice Charrez, Abdul Bhuiya & María Díaz de León Derby

Wainamics Inc., Pleasanton, CA, EE. UU.

Arthur M. Escajeda, Roger Mcintosh, Huyen Tran y Ming X. Tan

Departamento de Física y Astronomía, Universidad Estatal de San José, San José, CA, EE. UU.

Neil A. Suiza

División de Biofísica Molecular y Bioimagen Integrada, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Maxim Armstrong y Jennifer A. Doudna

Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Maria Lukarska, Dylan CJ Smock, Gavin J. Knott, Erik Van Dis, Eli Dugan, Shin Kim, Tina Y. Liu, Sarah A. Stanley, Jennifer A. Doudna y David F. Savage

División de Enfermedades Infecciosas y Vacunología, Facultad de Salud Pública, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Scott B. Biering y Eva Harris

Centro de Biología Computacional, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

amanda simulacro

Instituto de Descubrimiento de Biomedicina de Monash, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia

Gavin J. Knott

Centro de Investigación Ambiental y Salud Comunitaria (CERCH), Escuela de Salud Pública, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Katherine Kogut y Brenda Eskenazi

Escuela de Salud Pública, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

sara a stanley

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Jennifer A. Doudna

Departamento de Química, Universidad de California, Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Jennifer A. Doudna

Instituto Gladstone de ciencia de datos y biotecnología, Institutos Gladstone, San Francisco, CA, EE. UU.

Jennifer A. Doudna

Instituto Arc, Palo Alto, CA, EE. UU.

Patricio D. Hsu

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SSC, SA, AF, ARJ diseñaron y realizaron experimentos, analizaron los datos y prepararon el manuscrito. PDH concibió el proyecto, diseñó experimentos, proporcionó supervisión general para este trabajo y escribió el manuscrito, con aportes de todos los autores. DFS y JAD proporcionaron información experimental, editaron el manuscrito y co-supervisaron este trabajo. BC proporcionó experiencia en microfluidos y editó el manuscrito. AME, HT, RM y MXT diseñaron y construyeron el cartucho de microfluidos y el instrumento de diagnóstico. SS, AB, NAS, MA, ARH y MDdLD diseñaron y construyeron el instrumento óptico integrado con el dispositivo de microfluidos, bajo la supervisión de DAFNP editó el manuscrito y, con ML, contribuyó al diseño experimental. QD realizó experimentos de cuantificación estándar. DCJS, TYL y GJK purificaron proteínas para ensayos y, con ED y SK, proporcionaron experiencia bioquímica. AM desarrolló métodos computacionales para la selección de ARN guía con LFL, y SBB y EVD realizaron el trabajo BSL-3 con la supervisión de EH y SAS El Consorcio de Pruebas IGI (JRH, EL-S., ECS, CAT, PG, MM, SM, AZ, IS, AC, MC y CW) realizaron pruebas de qPCR de diagnóstico de las muestras de hisopado respiratorio. EAM, KK y BE coordinaron la recolección de muestras de saliva en el estudio de trabajadores agrícolas del Valle de Salinas.

Correspondencia a Jennifer A. Doudna, David F. Savage o Patrick D. Hsu.

Los Regentes de la Universidad de California y Wainamics han presentado patentes relacionadas con este trabajo. PDH es cofundador de Spotlight Therapeutics y Moment Biosciences y es miembro de la junta directiva y del consejo asesor científico, y es miembro del consejo asesor científico de Vial Health and Serotiny. DFS es cofundador de Scribe Therapeutics y miembro del consejo asesor científico de Scribe Therapeutics y Mammoth Biosciences. JAD es cofundador de Caribou Biosciences, Editas Medicine, Scribe Therapeutics y Mammoth Biosciences. JAD es miembro del consejo asesor científico de Caribou Biosciences, Intellia Therapeutics, eFFECTOR Therapeutics, Scribe Therapeutics, Mammoth Biosciences, Synthego, Algen Biotechnologies, Felix Biosciences e Inari. JAD es Director en Johnson & Johnson y tiene proyectos de investigación patrocinados por Biogen, Pfizer, AppleTree Partners y Roche. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Biomedical Engineering agradece a Jin Wang y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Los cebadores FIP y BIP, asistidos por cebadores F3 y B3 a XX, se unen al ADN objetivo en F2c y B2c, agregando regiones complementarias de ADN al amplicón (F1c y B1c). Su complementariedad con F1 y B1 da como resultado estructuras de bucle, que facilitan una mayor unión de FIP y BIP en los bucles (F2c y B2c) y la extensión, amplificando el objetivo mediante la formación de concatémeros largos. Los cebadores Floop y Bloop también pueden unirse a los bucles y extenderse, aumentando aún más la amplificación. La adición del promotor T7 en el extremo 5' del cebador de bucle proporciona un sustrato para que la polimerasa T7 se transcriba, lo que da como resultado un producto de ARN que contiene repeticiones invertidas del amplicón objetivo.

( a ) Pantalla de conjuntos de cebadores de control de procesos en muestras comerciales de saliva. ( b ) Selección de las ubicaciones del promotor T7 en el conjunto de cebadores ACTB en extracto de ARN y muestras comerciales de saliva. (c) Esquema del diseño del cartucho. La reacción se puede separar en tres pasos: 1. reacción de amplificación; 2. Medición posterior a la amplificación + mezcla Cas13; 3. Reacción Cas13 en cámaras de detección. Los reactivos almacenados en el cartucho se separan mediante una solución hidrofóbica patentada para evitar el inicio prematuro de las reacciones. Después de la reacción LAMP, la muestra se divide en dos reacciones: la parte izquierda del cartucho expondrá la muestra al ARNcr del gen N (paso 2a) mientras que el lado derecho del cartucho actuará como control interno con solo ARNcr ACTB (paso 2b ). (d) Resultados de DISCoVER a bordo en 25 muestras de saliva individuales (20 muestras con ARN genómico de SARS-CoV-2 a 500 cp/μL, 5 muestras negativas esperadas). Un aumento del doble de la fluorescencia sobre los cartuchos en blanco a los 10 minutos fue el criterio determinado experimentalmente para obtener resultados positivos. Las muestras con valor por debajo de este umbral a los 10 minutos se declararon negativas.

Tablas complementarias, figuras y pie de video.

Secuencias para LAMP, rLAMP, RT–qPCR y Cas13.

Demostración del flujo de trabajo DISCoVER.

Script de MATLAB para el control del hardware de imágenes.

Los datos fuente para las Figs. 5c, dy 7d.

Springer Nature o su licenciatario tienen derechos exclusivos sobre este artículo en virtud de un acuerdo de publicación con el autor o los autores u otros titulares de derechos; el autoarchivo del autor de la versión manuscrita aceptada de este artículo se rige únicamente por los términos de dicho acuerdo de publicación y la ley aplicable.

Reimpresiones y permisos

Chandrasekaran, SS, Agrawal, S., Fanton, A. et al. Detección rápida de ARN de SARS-CoV-2 en saliva a través de Cas13. Nat. biomedicina Eng 6, 944–956 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

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Recibido: 01 Diciembre 2020

Aceptado: 30 de junio de 2022

Publicado: 11 agosto 2022

Fecha de emisión: agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

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