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May 28, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 708 (2023) Citar este artículo

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Las plataformas de administración de acción ultraprolongada para la profilaxis previa a la exposición (PrEP) al VIH pueden aumentar la adherencia y maximizar el beneficio para la salud pública. Informamos sobre un implante de formación in situ (ISFI) inyectable, biodegradable y removible que se administra por vía subcutánea y puede liberar el inhibidor de la integrasa cabotegravir (CAB) por encima de los puntos de referencia de protección durante más de 6 meses. Los ISFI CAB son bien tolerados en ratones hembra y macacos hembra que no muestran signos de toxicidad o inflamación crónica. En macacos, las concentraciones medianas de CAB en plasma superan los puntos de referencia de protección de PrEP establecidos dentro de las 3 semanas y confieren una protección completa contra los repetidos desafíos rectales de SHIV. La extracción del implante a través de una pequeña incisión en 2 macacos en la semana 12 da como resultado una disminución de 7 a 48 veces en los niveles plasmáticos de CAB en 72 horas. El modelado para traducir la dosificación de CAB ISFI sugiere que una inyección de 3 ml superaría los puntos de referencia de protección en humanos durante más de 5 meses después de la administración. Nuestros resultados respaldan el avance clínico de CAB ISFI para la PrEP de acción ultraprolongada en humanos.

A partir de 2021, 38,4 millones de personas viven actualmente con el VIH y 40,1 millones de personas han muerto por enfermedades relacionadas con el SIDA en todo el mundo desde el comienzo de la epidemia1. La profilaxis previa a la exposición (PrEP) con regímenes orales diarios que contienen emtricitabina (FTC) en combinación con tenofovir disoproxil fumarato (TDF) o tenofovir alafenamida ha sido muy eficaz para prevenir la adquisición del VIH cuando se toma con una alta adherencia2,3. Si bien una alta adherencia resultará en una alta eficacia de la PrEP, mantener una alta adherencia a la PrEP oral diaria sigue siendo un desafío importante4–6. Los bajos niveles de adherencia y la subsiguiente infección también pueden conducir al desarrollo de virus resistentes a los medicamentos7. Además, los bajos niveles de adherencia se observan particularmente entre las mujeres jóvenes de África subsahariana debido al alto estigma, la baja aceptabilidad del producto y/o la incapacidad de revelar el uso del producto a sus parejas sexuales5. Mitigar los problemas de adherencia en el África subsahariana, específicamente en las mujeres, es clave para el éxito de la PrEP, ya que África subsahariana representa más del 60 % de todas las nuevas infecciones por el VIH en todo el mundo1,5. Con este fin, la tubería para las opciones de prevención del VIH se está moviendo hacia el desarrollo de productos de PrEP de acción prolongada (LA) que no requieren una dosificación frecuente y pueden superar algunos de los desafíos de adherencia asociados con la PrEP oral diaria. De hecho, los estudios han demostrado que los productos de acción prolongada tienen una mayor adherencia y aceptabilidad a los regímenes orales diarios5,8,9,10,11, particularmente en poblaciones donde la prevalencia del VIH es más alta. Por lo tanto, una mayor adherencia a la PrEP y la aceptabilidad de la PrEP contra el VIH de acción prolongada pueden, en última instancia, reducir las tasas de transmisión del VIH.

Una formulación inyectable de acción prolongada del inhibidor de la integrasa cabotegravir (CAB LA) fue aprobada a fines de 2021 por la FDA para PrEP en hombres y mujeres12. La aprobación de CAB LA siguió a los resultados de los ensayos HPTN 083 y 084 que mostraron que CAB LA era seguro y más efectivo que FTC/TDF oral diario, lo que probablemente refleja la ventaja de adherencia de la PrEP de acción prolongada13,14,15. Los estudios también definieron que las concentraciones plasmáticas de CAB necesarias para la protección fueran cuatro veces superiores a la concentración inhibitoria del 90% ajustada por proteínas (4× PA-IC90, 664 ng/mL16). CAB LA se administra en inyecciones intramusculares de 3 ml cada mes durante 2 meses inicialmente y cada dos meses a partir de entonces. Si bien CAB LA presenta un gran avance en la PrEP y el tratamiento del VIH, los grandes volúmenes de inyección (3 ml/inyección), las reacciones en el lugar de la inyección14,17 y la incapacidad de autoadministrarse o retirarse para finalizar el tratamiento si es necesario son desafíos que aún deben superarse. dirigido. Además, debido a su larga vida media terminal (>40 días)16 y la incapacidad de eliminarse después de la administración, CAB LA demuestra una larga cola farmacológica con niveles bajos pero detectables de CAB que permanecen en el plasma durante más de 15 meses después de la interrupción del tratamiento18 ,19. Estos niveles subóptimos de CAB pueden dar lugar a infecciones progresivas y al desarrollo de un VIH resistente a los medicamentos, por lo que se requiere PrEP oral suplementaria para cubrir la cola y prevenir futuras infecciones19. Para superar estas limitaciones, los esfuerzos ahora se están desplazando hacia el desarrollo de formulaciones de CAB de acción ultraprolongada, removibles y autoadministradas (p. ej., administración subcutánea) que mantienen los niveles protectores de CAB en plasma a través de intervalos de dosificación prolongados, como cada 6 meses o más. Tales formulaciones pueden facilitar la implementación a gran escala y maximizar la rentabilidad y el beneficio para la salud pública tanto en países ricos como pobres en recursos.

Los implantes de formación in situ (ISFI) pueden proporcionar propiedades deseables para una formulación de CAB de acción ultraprolongada, incluidos intervalos de dosificación prolongados, pequeños volúmenes de inyección y recuperabilidad20,21. Los ISFI consisten en un polímero hidrófobo y biodegradable (p. ej., ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA)), disolventes orgánicos miscibles en agua biocompatibles (p. ej., N-metil-2-pirrolidona (NMP) o sulfóxido de dimetilo (DMSO) ), e ingredientes farmacéuticos activos (API)22,23,24 que se formulan conjuntamente para generar una solución o suspensión líquida homogénea y que se puede inyectar. Tras la inyección en el espacio intramuscular o subcutáneo, el disolvente orgánico miscible en agua se difunde en el entorno acuoso, lo que da como resultado una inversión de fase que genera un depósito sólido o semisólido que comprende el API atrapado dentro de la matriz polimérica precipitada23,24,25,26. Los API se liberan del depósito a través de la difusión a través de la matriz polimérica y mediante la degradación a granel del polímero con el tiempo.

Los ISFI formulados con PLGA y NMP se han estudiado ampliamente para la liberación de acción prolongada de dolutegravir (DTG), un inhibidor de la integrasa del VIH análogo de CAB20,21. En ratones NOD scid con la cadena gamma común y ratones con médula ósea, hígado y timo (BLT), los ISFI liberaron DTG durante más de 11 meses a niveles que eran de 10 a 100 veces superiores al PA-IC90. Estos niveles se asociaron con una alta protección frente a múltiples exposiciones vaginales al VIH en dosis altas y la supresión de la viremia en ratones infectados20,21. Además, aunque no se requiere la extracción del implante debido a la naturaleza biodegradable de PLGA, el estudio mostró la capacidad de recuperar fácilmente el depósito a través de una pequeña incisión en la piel. Después de la eliminación, los niveles de DTG en plasma cayeron por debajo del PA-IC90 dentro de las 24 horas y por debajo del límite de detección después de 7 días20. En conjunto, estas observaciones destacaron el potencial de las ISFI como un novedoso sistema de entrega de acción ultra prolongada y respaldaron la evaluación ampliada de las ISFI que brindan CAB.

Aquí, desarrollamos y caracterizamos una formulación CAB ISFI con alta carga de fármaco y que es susceptible de administración subcutánea en pequeños volúmenes. Definimos estabilidad, microestructura, inyectabilidad y cinética de liberación in vitro e in vivo. Mostramos que esta formulación es segura en ratones hembra y primates no humanos y puede liberar CAB durante 6 a 11 meses a niveles que están por encima de los puntos de referencia establecidos para la protección de PrEP en macacos y humanos. Asociamos la liberación prolongada de CAB del ISFI con una protección duradera contra la infección por SHIV en un modelo de macaco de PrEP que predijo la eficacia clínica de CAB LA y otros regímenes orales de PrEP aprobados. Nuestro estudio identifica una plataforma prometedora para la liberación prolongada de CAB a niveles que se sabe que están asociados con la protección de la PrEP en humanos.

Muchos factores influyen en la cinética de liberación del fármaco de los ISFI, incluidos el tipo de polímero y el peso molecular (MW), el disolvente, la relación polímero-disolvente, la miscibilidad del fármaco y el polímero con el disolvente y las propiedades fisicoquímicas del fármaco20,24,27. Aquí, investigamos el efecto de los solventes, la carga de fármacos, el peso molecular del polímero y las proporciones de polímero a solvente para desarrollar un ISFI con carga máxima de CAB y altas tasas de liberación in vitro. Primero, investigamos la solubilidad de saturación de CAB en varios solventes para determinar el sistema de solventes ideal para la formulación para lograr la máxima carga de fármaco (Tabla complementaria 1). NMP y DMSO son solventes orgánicos miscibles en agua comúnmente utilizados en formulaciones ISFI24, por lo que estos solventes se probaron en varias proporciones de peso. También se investigó la adición de excipientes como Tween 20, Pluronics y Gelucire, ya que pueden mejorar la solubilidad acuosa de fármacos poco insolubles28. Con base en la solubilidad de CAB en estos diversos solventes, una proporción de peso de 1:1 (p/p) de NMP:DMSO (denominado "disolvente") demostró la mayor solubilidad de CAB (solubilidad de saturación de 167,12 ± 12,04 mg/mL) y fue por lo tanto, se utiliza para formular CAB como una suspensión ISFI estable por encima de esta solubilidad de saturación.

Durante la optimización y el desarrollo de nuestro trabajo anterior, todas las formulaciones CAB ISFI se generaron utilizando un polímero biodegradable aprobado por la FDA que consta de 50:50 PLGA, que permite una liberación ultralarga de antirretrovirales de ISFI20,21,29 y tiene un perfil de degradación favorable que incluye provocando una degradación completa en unos pocos meses30,31. Este perfil de degradación es ideal para garantizar la degradación completa del polímero antes de las inyecciones posteriores de ISFI para evitar la acumulación de polímero. Además, todas las formulaciones constaban de 50:50 de PLGA con un peso molecular bajo de 10 kDa o 27 kDa, ya que los PLGA con un peso molecular más bajo pueden adaptarse a una mayor carga de fármaco, provocar una mayor liberación del fármaco y tener una viscosidad más baja para garantizar la capacidad de jeringa31 en comparación con PLGA con un peso molecular más alto cuando utilizado en sistemas ISFI24,32,33.

Se evaluaron estudios de liberación in vitro acumulativos de siete formulaciones CAB ISFI durante 35 días (Fig. 1a) para investigar el efecto de la carga de fármaco, el PLGA MW y las proporciones de polímero a disolvente para determinar la formulación óptima con la mayor carga y liberación de fármaco. tasas (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria). Los resultados mostraron que las tasas de liberación de CAB aumentaron con (1) el aumento de la carga de fármaco (Fig. 1b), (2) el aumento de la cantidad de solvente y (3) la disminución del PM de PLGA (Fig. 1c). Todas las formulaciones exhibieron una liberación repentina muy baja (<3 % de liberación en 24 horas), una liberación sostenida durante más de un mes y una liberación proyectada durante más de 6 meses in vitro (Fig. 1d). ISFI que contienen 349 mg/mL CAB (1:4 p/p PLGA (27 kDa):solvente) (Formulación 4), 500 mg/mL CAB (1:4 p/p PLGA (27 kDa):solvente) (Formulación 5 ), y 500 mg/ml de CAB (1:4 p/p de PLGA (10 kDa):disolvente) (Formulación 7) exhibieron una cinética de liberación de orden cero durante los primeros 35 días. Además, la liberación de CAB fue significativamente diferente (p < 0,05) al variar la carga de fármaco (Fig. 1b) y el PM de PLGA (Fig. 1c). En particular, los ISFI que contienen 500 mg/mL de CAB (1:4 p/p PLGA (10 kDa):solvente) (Formulación 7) y 500 mg/mL (1:4 p/p PLGA (27 kDa):solvente) (Formulación 5) mostró una cinética de liberación comparable (p > 0,05), a pesar de las diferencias en el PM de PLGA.

a Liberación acumulativa de formulaciones CAB ISFI. b Efecto de la carga de fármaco sobre la liberación acumulada de CAB. c Efecto del peso molecular de PLGA sobre la liberación acumulativa de CAB. Todos los estudios de liberación in vitro se realizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4 con Solutol al 2 %) a 37 °C. Datos presentados como promedio ± desviación estándar para n = 3 muestras. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Análisis estadístico: ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey que compara la cantidad de liberación de fármaco con respecto a la formulación y el punto de tiempo en b y c. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 y ns (no significativo) cuando p > 0,05. d Tabla resumen de la cinética de liberación para formulaciones CAB ISFI. Disolvente = 1:1 (p/p) NMP:DMSO.

Es probable que las tasas de liberación similares entre las formulaciones 5 y 7 se atribuyan a la carga de fármaco considerablemente alta en las formulaciones (500 mg/ml de CAB), que impulsa el perfil de liberación de CAB, independientemente de las diferencias en el PM de PLGA. En ambas formulaciones, la relación PLGA a CAB (p/p) es 1:3,5 p/p (41,2 % CAB y 11,8 % PLGA). Por lo tanto, la diferencia de PLGA MW en las Formulaciones 5 y 7 no produjo un impacto tan grande en la liberación de CAB en comparación con otras formulaciones con diferentes PLGA MW, como las Formulaciones 3 y 6 (proporción de PLGA a CAB de 1:0,75 p/p ).

Con base en perfiles de liberación de fármacos similares y prometedores de las Formulaciones 5 y 7, la liberación in vitro de estas formulaciones se extendió a 180 días (Fig. 2a complementaria). Aunque observamos una mayor liberación in vitro de CAB de la Formulación 5 después de ~2 meses en comparación con la Formulación 7, un estudio piloto en ratones no mostró diferencias en las concentraciones de CAB en plasma entre las dos formulaciones hasta por 90 días (Figura complementaria 2b). Se seleccionó la formulación 7 para estudios posteriores debido a su PM de PLGA más bajo (10 kDa). El PM de PLGA más bajo provocó una viscosidad más baja (Tabla complementaria 2) que garantiza la capacidad de jeringa. Además, se espera que el PLGA de 10 kDa (Formulación 7) se degrade más rápido en comparación con el PLGA de 27 kDa (Formulación 5) y se seleccionó para garantizar la degradación completa del polímero y mitigar la acumulación de polímero en dosis posteriores24,32,33.

Finalmente, se seleccionó el CAB de 500 mg/mL (1:4 p/p PLGA (10 kDa):solvente) ISFI (Formulación 7) (denominado CAB ISFI) como la formulación optimizada debido a su alta carga de fármaco y alto contenido de tasa de liberación in vitro y se caracterizó además en términos de microestructura de depósito. Se sabe que la cinética de liberación del fármaco está influenciada por la microestructura del depósito, que también está influenciada por el polímero, el solvente, las propiedades fisicoquímicas del fármaco y la miscibilidad del fármaco con el solvente20,24. Como se muestra en la Fig. 3 complementaria, la microestructura CAB ISFI se analizó cualitativamente con microscopía electrónica de barrido (SEM) y formó un depósito densamente empaquetado con cristales CAB, y la microestructura permaneció inalterada sin formación aparente de poros en la microestructura ISFI durante 90 días de incubación en medios de liberación in vitro. Además, realizamos análisis de rayos X dispersivos de energía (SEM EDX) con microscopía electrónica de barrido en CAB ISFI y placebo ISFI (sin CAB) para confirmar los cristales CAB vistos en imágenes SEM (Fig. 4 complementaria). Los resultados de SEM EDX demostraron la ausencia de cristales dentro del ISFI de placebo y los cristales confirmados estaban compuestos de CAB en el CAB ISFI del análisis elemental (presencia de grupos de flúor, Fig. 4 complementaria). En última instancia, estos resultados corroboran la cinética de liberación in vitro e in vivo de CAB durante 90 días.

Para determinar la vida útil del CAB ISFI optimizado, realizamos estudios de estabilidad en dos condiciones de almacenamiento (40 °C/75 % de humedad relativa (HR) y 4 °C) durante 30 y 90 días seguidos de un análisis de la liberación posterior al almacenamiento. in vitro. La estabilidad se determinó en función de la apariencia física (color, viscosidad, separación de fases) de la formulación ISFI y la estabilidad y concentración del fármaco después del almacenamiento.

Después de 30 días a 4 °C o 40 °C/75 % de HR y 90 días a 4 °C, la formulación CAB ISFI no mostró ninguna diferencia visual en el aspecto físico (color, jeringabilidad, separación de fases). La concentración del fármaco fue comparable a la concentración inicial (t = 0) (<5% de diferencia) sin picos de degradación del fármaco observados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Fig. 5a complementaria). La formulación ya no era inyectable ni homogénea después de 90 días a 40 °C/75 % de HR (Fig. 5b complementaria), lo que impidió el análisis de la cinética de liberación posterior al almacenamiento.

Las Figuras 2a yb muestran la cinética de liberación in vitro posterior al almacenamiento obtenida después de 30 días a 4 °C o 40 °C/75 % de HR y después de 90 días a 4 °C. Independientemente de la condición de almacenamiento, la liberación de CAB después del almacenamiento fue más lenta y significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con la formulación inicial (t = 0). Específicamente, la liberación in vitro de CAB cuando se almacenó a 40 °C/75 % de HR y 4 °C se volvió significativamente diferente en comparación con la línea base después de 7 días (p = 0,0042) y 21 días (p = 0,0004), respectivamente. En última instancia, todas las formulaciones fueron significativamente diferentes (p < 0,0001) en comparación con el valor inicial después de 90 días de liberación in vitro (Fig. 2a).

a Cinética acumulativa de liberación in vitro de CAB ISFI (500 mg/mL CAB (1:4 p/p PLGA (10 kDa):solvente)) al inicio (t = 0), 30 días y 90 días después del almacenamiento a 4 °C y 40 °C/75 % HR. Todos los estudios de liberación in vitro se realizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4 con Solutol al 2 %) a 37 °C. Datos presentados como promedio ± desviación estándar para n = 3 muestras. Análisis estadístico: ANOVA bidireccional con comparaciones múltiples de Tukey que comparan la liberación de CAB con respecto a la formulación y el punto de tiempo. Para el día 90 posterior al almacenamiento de liberación in vitro, todas las formulaciones de almacenamiento provocaron una liberación de CAB significativamente diferente y más lenta que la línea base (p < 0,0001) b Tabla resumen de la cinética de liberación in vitro de CAB ISFI posterior al almacenamiento de a. c Efecto de las condiciones de almacenamiento sobre el PM promedio en peso de PLGA de las formulaciones de placebo medido por análisis de cromatografía de permeación en gel (GPC). d Tabla resumen de la degradación de PLGA en la formulación de placebo después de 30 y 90 días a 4 °C y 40 °C/75 % de HR. Disolvente = 1:1 p/p NMP:DMSO. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Esta disminución en la cinética de liberación probablemente estuvo influenciada por la hidrólisis de PLGA en condiciones de almacenamiento estables. Los degradantes de PLGA pueden cristalizar durante la hidrólisis24, lo que da como resultado una red de polímero más cristalina que puede retardar la liberación del fármaco. Para confirmar la degradación, el análisis de cromatografía de permeación en gel (GPC) de la formulación ISFI de placebo (PLGA 1:4 p/p (10 kDa):disolvente) demostró una disminución del 2,3 % en el peso molecular cuando se almacena a 4 °C y una disminución del 36,1 % en el peso molecular. MW cuando se almacena a 40 °C/75 % de HR durante 90 días (Fig. 2c y d) en relación con el PLGA MW inicial (t = 0). Además, se midió el pH de la formulación de placebo antes y después del almacenamiento. Al inicio del estudio y después de 90 días de almacenamiento a 4 °C, el pH de la formulación de placebo era neutro (pH = 6–7), mientras que el pH se volvió más ácido (pH = 4) después de 90 días de almacenamiento a 40 °C/75 % de HR, lo que confirma aún más la degradación del PLGA a sus subproductos ácidos, específicamente después del almacenamiento a 40 °C/75 % de HR. En general, CAB ISFI fue más estable en el almacenamiento a 4 °C, como se refleja en la degradación mínima de PLGA (2,3 %) y la capacidad de conservar la inyectabilidad y la homogeneidad de la formulación después de 90 días.

Se realizó un estudio de seguridad in vivo de CAB ISFI con ratones hembra BALB/c para evaluar la inflamación local y sistémica posterior a la inyección en comparación con los ratones de control que no recibieron ningún tratamiento ni inyección. Los resultados del estudio mostraron que CAB ISFI fue bien tolerado y los ratones no mostraron ningún signo de toxicidad manifiesta, cambios de comportamiento o pérdida de peso (Fig. 6 complementaria). El análisis histopatológico del implante extirpado y del tejido subcutáneo circundante demostró que el CAB ISFI presentaba una inflamación local de leve a moderada que se mostraba por células inmunitarias infiltradas alrededor del depósito (Fig. 3a). En los días 3 y 7, la mediana de la puntuación de inflamación microscópica de la piel fue de 3 (inflamación moderada) probablemente debido a la respuesta inmunitaria inicial a la inyección y disminuyó en el día 30 en 2 de los 3 ratones probados (Fig. 3b).

a Inflamación local de depósitos extirpados y tejidos subcutáneos circundantes recolectados en los días 3, 7 y 30 después de la inyección (n = 3/punto de tiempo para ratones tratados con CAB ISFI y n = 1/punto de tiempo para ratones de control (sin inyección)) y teñidos con ÉL. Los asteriscos indican implante CAB. Las flechas indican células inmunes infiltradas y áreas de inflamación. Todas las barras de escala representan 1 mm. b Puntuación inflamatoria del tejido subcutáneo que rodea el depósito evaluada usando un microscopio óptico y puntuada a ciegas por un patólogo certificado. Las barras negras representan la mediana de la puntuación de inflamación en cada punto de tiempo (n = 3 por punto de tiempo). Puntuación de inflamación: 0: células inflamatorias presentes dentro de los límites esperados; 1: inflamación mínima, pocas células inmunitarias aumentadas y dispersas presentes; 2: inflamación leve, pequeños grupos de células inmunitarias que se adelgazan o pistas localizadas de inflamación o aumento leve del número de células que rodean difusamente el depósito; 3, trayectos moderados, más gruesos o múltiples de inflamación o un número moderado de células que rodean difusamente el depósito; 4, vías de inflamación graves y coalescentes lo suficientemente grandes como para reemplazar la arquitectura tisular normal o un gran número de células que rodean difusamente el depósito; 5, marcada inflamación presente que está reemplazando áreas expansivas de arquitectura tisular normal. c Concentración de TNF-α (pg/mL) en plasma cuantificada por ELISA en el día 3 (n = 3), 7 (n = 3) y 30 (n = 5) después de la inyección. d Concentración de IL-6 (pg/mL) en plasma cuantificada por ELISA en el día 3 (n = 3), 7 (n = 3) y 30 (n = 5) después de la inyección. e Concentración de CAB (promedio ± desviación estándar) en plasma (1215 mg/kg) durante 90 días (n = 6 por punto de tiempo). Los valores de PA-IC90 de 1× y 4× se indican con líneas de puntos para CAB (166 ng/mL y 664 ng/mL, respectivamente). Las muestras de plasma de ratones individuales se muestran en la Fig. 7 complementaria. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La inflamación sistémica se evaluó mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para cuantificar las citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-6 en plasma. Los resultados no mostraron inflamación aguda o crónica sistémica. El TNF-α osciló entre 0 y 20 pg/mL y fue comparable al grupo de control sin inyección (p = 0,5521) (Fig. 3c). Los niveles de IL-6 en plasma oscilaron entre 0 y 45 pg/mL (Fig. 3d) y los niveles fueron comparables a los observados en el grupo de control sin inyección [p = 0,4188 (ANOVA de 2 vías con comparaciones múltiples)]. La variabilidad en las puntuaciones de inflamación o los niveles de citocinas proinflamatorias puede atribuirse a la variabilidad interindividual o a la variabilidad del ciclo hormonal en ratones34. En general, estos resultados demostraron que los CAB ISFI generalmente se toleraron bien y se consideraron seguros sin signos evidentes de toxicidad o inflamación crónica.

Se llevaron a cabo estudios farmacocinéticos (PK) en ratones hembra BALB/c durante 90 días para evaluar la cinética de liberación de fármacos in vivo de CAB ISFI. Las concentraciones plasmáticas de CAB se cuantificaron utilizando un método de cromatografía líquida de alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem LC/MS-MS y se trazaron durante 90 días (Fig. 3e). Además, evaluamos la cinética de liberación de CAB frente a tres modelos matemáticos (de orden cero, de primer orden y controlado por difusión35). Determinamos que la liberación in vivo de CAB observada en ratones se ajusta mejor a un modelo de orden cero (modelo de orden cero R2 = 0,97; modelo de primer orden R2 = 0,87; modelo controlado por difusión R2 = 0,86) durante los 90 días de duración del estudio PK. Además, la concentración promedio de CAB en plasma fue entre 6 y 53 veces mayor que el 4 × PA-IC90 (664 ng/mL16) entre todos los ratones durante todo el estudio de 90 días (Fig. 3e y Fig. 7 complementaria).

En base a los prometedores datos de seguridad y farmacocinética en ratones BALB/c, se seleccionó la formulación CAB ISFI para evaluar la seguridad, la farmacocinética y la eficacia en macacos rhesus. Sin embargo, dado que el volumen de inyección para macacos (dos inyecciones de 1 ml) sería mucho mayor que para ratones (50 µl), era esencial garantizar la inyectabilidad de la formulación de grandes volúmenes in vitro antes de escalar los estudios con macacos. Para evaluar la inyectabilidad de la formulación CAB ISFI optimizada, utilizamos hidrogeles de poliacrilamida36. Se ha demostrado que los hidrogeles de poliacrilamida imitan las propiedades mecánicas del tejido subcutáneo in vivo en el lugar de la inyección y provocan una mejor correlación con la liberación in vivo de ISFI en lugar de los métodos estándar de liberación in vitro mediante inyección directa en un baño de PBS36,37. Evaluar la inyectabilidad fue esencial para la formulación CAB ISFI debido a su propiedad de inversión de fase rápida tras la inyección, que se atribuye a la alta miscibilidad de los solventes orgánicos con agua y bajo PLGA MW24. Si la inversión de fase es demasiado rápida, la formulación podría solidificarse entre la jeringa y la aguja y bloquear el flujo de inyección.

Como tal, investigamos la inyectabilidad de varias formulaciones de placebo con diferentes proporciones de polímero a solvente y PLGA MW, así como la formulación CAB ISFI optimizada (1: 4 p/p PLGA (10 kDa): solvente). La inyectabilidad de las formulaciones en hidrogeles de poliacrilamida se investigó con agujas de calibre 16 (G), 18 G y 19 G con un volumen de inyección de 1 ml (Tabla complementaria 3). Como se muestra en la Tabla complementaria 3, una inyección de 1 ml en la matriz de hidrogel con una aguja de 19 G de PLGA 1: 4 p / p (10 kDa): placebo solvente o formulación CAB ISFI no tuvo éxito debido a la rápida inversión de fase y rápido formación de depósito que conduce a la obstrucción del flujo de formulación a través de la aguja. Esto probablemente se atribuyó a la combinación de PLGA de bajo peso molecular (10 kDa) y altas cantidades de disolvente (PLGA:disolvente 1:4 p/p). Por otra parte, se inyectó con éxito en la matriz de hidrogel 1 ml de ISFI de placebo preparados con un PM de PLGA superior (27 kDa) o cantidades inferiores de disolvente (1:3 y 1:2 p/p de PLGA:disolvente). Además, la inyección de 1 ml de CAB ISFI optimizado (500 mg/ml 1:4 PLGA (10 kDa):disolvente) en la matriz de hidrogel se logró con éxito con una aguja de 18 G o 16 G. En base a estos resultados, se utilizó una aguja de 16 G para administrar fácilmente la formulación CAB ISFI en estudios con macacos.

Administramos CAB ISFI a seis macacos rhesus hembras. Todos los animales recibieron dos inyecciones separadas de 1 ml (un total de 1000 mg de CAB) con la excepción de un macaco (RH-1080) que recibió una inyección de 1,0 ml y 0,5 ml de ISFI o un total de 750 mg de CAB. Por peso, los animales recibieron entre 72,8 y 143,9 mg/kg de CAB (mediana = 113,8 mg/kg). El macaco RH-42012 era un animal infectado por SHIV y por lo demás sano de un estudio separado y se incluyó solo con fines farmacocinéticos. La figura 4a muestra las concentraciones longitudinales de CAB en plasma. En general, todos los macacos alcanzaron concentraciones plasmáticas de CAB por encima de 4x PA-IC90 en la semana 4 con la excepción de RH-1073, que alcanzó concentraciones de referencia en la semana 24 (1230 ng/ml). Las concentraciones plasmáticas medianas (rango) de CAB en las semanas 4, 8 y 12 fueron 982 [406–1977], 1950 [578–5627] y 2127 [522–2552] ng/ml, respectivamente, o alrededor de 1,5 a 3,2 pliegue por encima del 4× PA-IC90. La eliminación de los dos CAB ISFI en macacos RH-1097 y RH-1093 en la semana 12 dio como resultado una reducción de 7 y 48 veces en los niveles plasmáticos de CAB a las 72 h y una disminución de aproximadamente 10 a 100 veces a las 2 semanas posteriores a la eliminación, respectivamente. (Figura 4a). Del mismo modo, la eliminación de uno de los dos ISFI que permanecieron palpables en el macaco RH-42012 en la semana 14 resultó en una disminución de ~2 veces en el CAB plasmático en una semana (1550–765 ng/mL); Las concentraciones de CAB se mantuvieron por encima de 4x PA-IC90 durante 3 semanas más. En los tres animales restantes con CAB ISFI intactos, las concentraciones plasmáticas medianas de CAB en las semanas 16, 20, 24 y 28 fueron 1923 [534-2082], 2227 [646-2827], 1230 [971-1585] y 886 [ 473–1415] ng/mL, respectivamente, o 1,3 a 3,4 veces por encima del 4× PA-IC90 (Fig. 4b). En particular, los niveles de CAB en plasma en un animal (RH-1048) permanecieron por encima de 4x PA-IC90 en la semana 47 (838 ng/mL). En general, estos resultados demuestran que dos inyecciones de 1 ml de la formulación CAB ISFI optimizada pueden liberar CAB en macacos a niveles superiores al umbral de protección hasta por 6 a 11 meses.

a Evaluación longitudinal de las concentraciones de CAB en plasma. Los dos CAB ISFI se eliminaron de los macacos RH-1097 y 1093 (círculos sólidos azules y morados) en la semana 12 y uno de los dos CAB ISFI se eliminó del macaco RH-42012 en la semana 14 (círculo verde sólido). Las líneas punteadas indican los niveles de CAB después de la eliminación. b El asterisco (*) indica animales con ISFI eliminados en las semanas 12 a 14. Los datos posteriores a la extracción del implante no se incluyen en el cálculo de las medianas. c Niveles de CAB detectados en plasma, tejidos rectales y tejidos vaginales de tres macacos (RH-42012, RA-1048 y RA1080) con CAB ISFI. Las muestras se recogieron de los mismos animales en tres momentos diferentes después de la implantación (semanas 4, 8 y 12). Las barras negras representan la mediana. d Proporción de concentraciones de CAB en tejidos vaginales (VT) y tejidos rectales (RT) en relación con el plasma.

Las concentraciones de CAB también se midieron en tejidos vaginales y rectales de tres macacos (RH-42012, RA-1048 y RA-1080) en las semanas 4, 8 y 12. La Figura 4c muestra que CAB se detectó consistentemente en ambos tejidos, con el única excepción del macaco RH-1048 que tenía CAB indetectable en los tejidos vaginales en la semana 4. Las concentraciones medianas de CAB en los tejidos rectales aumentaron ~3 veces entre la semana 4 y la semana 8 (333–1004 ng/g, respectivamente) y disminuyeron ligeramente en la semana 12 (713 ng/g). Las concentraciones medianas de CAB en los tejidos vaginales también aumentaron alrededor de 2,8 veces desde la semana 4 a la 8 (293–849 ng/g, respectivamente) y se mantuvieron en 823 ng/g en la semana 12. Las proporciones de tejido a plasma (Fig. 4d) se mantuvieron estables con el tiempo y fueron similares en la vagina [mediana = 0,18 (0,15-0,32)] y el compartimiento rectal [mediana = 0,42 (0,23-0,43)].

Para investigar si CAB entregado desde ISFI podría conferir protección rectal, realizamos una serie de experimentos de desafío SHIV en diferentes momentos después de la implantación. Primero evaluamos la protección a corto plazo en dos macacos (RH-1093 y RH-1097) desafiados dos veces por semana entre las semanas 4 y 8 (total de ocho desafíos por animal) (Fig. 5a). Ambos animales estaban protegidos contra la infección por SHIV a diferencia de un control en tiempo real no tratado (RH-1092) que se infectó después de una única exposición a SHIV. La protección a largo plazo se evaluó en dos macacos adicionales (RH-1048 y RH-1080) que fueron expuestos dos veces por semana a SHIV entre las semanas 14 y 18 (8 desafíos por animal) (Fig. 5b). Un animal (RH-1048) que mantuvo los niveles de CAB en plasma por encima de 4 × PA-IC90 recibió seis desafíos adicionales de SHIV entre las semanas 25 y 28. Los dos animales tratados con CAB estaban protegidos de la infección mientras que un control en tiempo real no tratado (RH-1084) se infectó después de una sola exposición al SHIV (Fig. 5b). En general, un solo tratamiento con ISFI protegió por completo a 4 macacos durante un acumulado de 38 exposiciones rectales a SHIV que abarcaron un período de 27 semanas.

a Protección a corto plazo por CAB ISFI. Dos macacos tratados con CAB (RH-1093 y RH-1097) y uno no tratado (RH-1092) fueron expuestos por vía rectal a SHIV entre las semanas 4 y 8 posteriores a la implantación. Cada animal recibió provocaciones rectales de SHIV dos veces por semana durante un máximo de 4 semanas (un total de ocho exposiciones). Las flechas indican exposiciones a SHIV. Los ISFI se extrajeron quirúrgicamente en la semana 12 (círculos sólidos azules y morados) b Niveles de ARN de SHIV en plasma detectados por PCR en tiempo real en animales durante el período de desafío y el período de seguimiento de 32 semanas. c Protección a largo plazo por CAB ISFI. Dos macacos tratados con CAB (RH-1080 y RH-1048) y uno no tratado (RH-1084) recibieron desafíos de SHIV rectal dos veces por semana entre las semanas 14 y 18 posteriores a la implantación (hasta 8 exposiciones). El animal RH-1048 recibió seis desafíos SHIV adicionales entre las semanas 25 y 28 (un total de 14 exposiciones). Las flechas indican exposiciones a SHIV. d Niveles de ARN de SHIV en plasma detectados por PCR en tiempo real en animales durante el período de desafío y el período de seguimiento de 24 a 36 semanas.

Para evaluar la seguridad y la tolerabilidad, examinamos el área que rodea los implantes cada semana durante un máximo de 12 semanas o hasta que se extrajo el implante. Esta evaluación incluyó los seis macacos que recibieron dos inyecciones para un análisis acumulativo de 12 sitios de implantación y un total de 144 observaciones clínicas. Según la escala de Draize, todos los sitios de implantación no tenían nada especial y no mostraron signos de reacciones cutáneas locales durante el período de estudio de 12 semanas (Fig. 6a y Fig. 8 complementaria). Se realizó una evaluación histopatológica semicuantitativa en una biopsia dérmica con sacabocados quirúrgico de 3 mm recolectada en el sitio del implante de tres macacos durante la extracción del implante (12 a 14 semanas después de la implantación). A modo de comparación, se recogió una biopsia con sacabocados quirúrgico de 3 mm de un animal que no recibió una inyección de CAB ISFI. Las biopsias de piel no tenían infiltrados linfoplasmocitarios mínimos presentes entre los animales, incluido el control, y no había evidencia de infección o material extraño (implante residual) presente en ninguna de las secciones de tejido (Fig. 6b y Tabla complementaria 4).

un mapa de calor de las reacciones cutáneas locales en el lugar del implante en los seis animales tratados con ISFI. Las reacciones cutáneas locales se puntuaron usando una escala de Draize (0-ninguna a 4-grave). b Histopatología de la piel. Se recogió una biopsia de piel por animal en el momento de la implantación de los animales tratados RH-1093, RH-1097, RH-42012 (n = 3) y un control no tratado (n = 1). Todas las barras de escala representan 1 mm (H&E, ampliación original ×4).

Para evaluar la capacidad de recuperación de los implantes después de los estudios in vivo, retiramos los CAB ISFI de los ratones en los días 30 (n = 6), 60 (n = 6) y 90 (n = 6) después de la administración haciendo una pequeña incisión en la piel en la eutanasia. Los ISFI se eliminaron con éxito de todos los animales sin tejido fibrótico que rodeara el depósito (Fig. 7a). Los depósitos retirados el día 30 (n = 6), 60 (n = 6) y 90 (n = 6) se procesaron más para evaluar la degradación del polímero (n = 3/punto de tiempo) y las concentraciones residuales de CAB (n = 3/punto de tiempo) . Después de 90 días en ratones, los resultados de estos análisis mostraron una pérdida de masa de depósito del 59,5 ± 13,4 % (Fig. 7b) y una disminución del peso molecular de PLGA del 49,7 ± 5,4 % (Fig. 7c). Es importante destacar que quedaba un 61,6 ± 6,5 % de CAB en los implantes recuperados de ratones en el día 90, lo que demuestra que la liberación de CAB del ISFI puede mantenerse más allá de los 90 días (Fig. 7d).

a Imagen de CAB ISFI recuperada de ratones BALB/c 30, 60 y 90 días después de la inyección. b Masas CAB ISFI 30, 60 y 90 días después de la inyección en ratones (promedio ± desviación estándar; n = 6/punto de tiempo) en comparación con la masa ISFI inicial (día 0) de un volumen de inyección de 50 µL (60,75 mg) . Las masas del día 0 se calcularon sobre la base de un volumen de inyección de 50 µL y utilizando la densidad de la formulación (1,215 g/ml) para determinar la masa aproximada en la inyección. c Cuantificación de CAB residual en ISFI 30, 60 y 90 días después de la inyección en ratones (promedio ± desviación estándar de n = 3 muestras) en comparación con la dosis inicial (25 mg en inyección de 50 µL). d Disminución del peso molecular de PLGA en CAB ISFI 30, 60 y 90 días después de la inyección en ratones (promedio ± desviación estándar de n = 3 muestras) en comparación con PLGA puro (10 kDa). e Cuantificación del fármaco residual de los implantes (inyectados en la parte superior izquierda y derecha de la espalda) recuperados de tres macacos rhesus 84 y 98 días después de la inyección. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además, ambos CAB ISFI se eliminaron de dos macacos (RH-1097 y RH-1093) el día 84 y un ISFI se eliminó de un tercer macaco (RH-42012) el día 98 después de la inyección. Como se muestra en la Fig. 7e, quedaba un promedio de 48,32 ± 11,44 % de CAB por implante después de la extracción del depósito.

Se estimaron las tasas de eliminación de CAB individuales (Fig. 9 complementaria) en función del perfil farmacocinético extravascular para nuestros seis macacos que recibieron dosis de 1,5 a 2 ml de CAB ISFI subcutáneo [mediana (IQR) = 15,9 (9,1 a 25,2) ml/(h*kg) ] y para nueve macacos de referencia histórica que recibieron dosis de 50 mg/kg de CAB LA intramuscular a los 7 y 1 días antes del muestreo PK [mediana (IQR) = 12,4 (11,7–14,3) ml/(h*kg)]38. Las tasas de entrada para estas dos formulaciones de acción prolongada se obtuvieron multiplicando la concentración plasmática observada por la tasa de eliminación estimada de los animales respectivos corregida por el peso en el momento de la administración en nuestros seis macacos tratados con ISFI o el peso supuesto de 8 kg en macacos de referencia históricos (Fig. 8 ). Las tasas de entrada objetivo para la dosificación clínica efectiva se estimaron utilizando parámetros medios de un modelo farmacocinético de población CAB publicado (CL = 151 ml/h, V2 = 5270 ml, Q = 507 ml/h y V3 = 2430 ml)39 para simular plasma humano concentraciones a varias velocidades de infusión IV. Las tasas de entrada de 3 y 0,75 mg/día alcanzaron concentraciones plasmáticas superiores a 4× PA-IC90 y 1× PA-IC90, respectivamente. Las tasas medianas de entrada de CAB ISFI observadas en nuestro estudio con macacos excedieron este umbral de eficacia clínica de 3 mg/día desde el día 28 hasta el día 140 después de la administración. Suponiendo que la tasa de entrada aumenta proporcionalmente con el volumen de inyección, una inyección de 3 ml de CAB ISFI alcanzaría este umbral entre el día 21 y el día 168 o 5,6 meses después de la administración. En comparación con los macacos que recibieron dos inyecciones intramusculares de CAB LA de 50 mg/kg con 6 días de diferencia, los CAB ISFI mantuvieron tasas por encima del umbral de protección previsto durante una mediana de 97 días adicionales (Fig. 8b).

se calcula una tasa de entrada CAB ISFI multiplicando las concentraciones plasmáticas observadas con la eliminación de cada animal respectivo según lo determinado por su perfil PK extravascular. Las líneas de referencia discontinuas y punteadas indican tasas de entrada de 3 y 0,75 mg/día que se prevé que alcancen concentraciones plasmáticas en humanos superiores a 4x PA-IC90 y PA-IC90, respectivamente. b Las tasas de entrada medianas (±IQR) CAB ISFI de a observadas en este estudio (línea verde) se superponen a las tasas medianas proyectadas para un volumen de inyección de 3 ml (suponiendo que la tasa de entrada aumenta proporcionalmente con el volumen; línea morada) y a las estimadas para n = 9 macacos de referencia que recibieron una dosis de 50 mpk (mg por kg) de CAB LA intramuscular los días 7 y 1 antes del muestreo farmacocinético38.

Informamos sobre un CAB ISFI de acción ultraprolongada que extiende los intervalos de dosificación con pequeños volúmenes de inyección, proporciona una protección duradera contra la infección rectal por SHIV y permite la recuperación del producto. Demostramos la liberación de CAB por encima de los puntos de referencia de protección de PrEP establecidos durante un máximo de 6 a 11 meses en macacos y utilizamos estos datos para estimar las exposiciones clínicas. Descubrimos que una inyección de 2 ml o 3 ml de nuestra fórmula mantendrá las concentraciones plasmáticas en humanos por encima de 4 × PA-IC90 durante más de 4 meses o 5 meses, respectivamente.

Los CAB ISFI permanecieron inyectables, no mostraron degradación del fármaco y mantuvieron una concentración homogénea de CAB cuando se almacenaron hasta 30 días a 40 °C/75 % de HR y hasta 90 días a 4 °C, lo que demuestra la estabilidad de la formulación. Aunque los estudios de liberación in vitro posteriores al almacenamiento causaron una liberación más lenta de CAB en ambas condiciones de almacenamiento, solo hubo una diferencia de ~3 % en la liberación acumulada de CAB entre el inicio y después de 90 días de almacenamiento a 4 °C. También realizamos estudios de inyectabilidad de ISFI en hidrogeles de poliacrilamida para comprender si las propiedades de inversión de fase rápida de los ISFI que dan como resultado la posible solidificación del implante podrían ser una limitación asociada con la administración de grandes volúmenes de inyección (≥1 ml). Demostramos que se puede usar un calibre de aguja de 18 G o 16 G para volúmenes de inyección ≥ 1 ml. En ratones BALB/c, las concentraciones plasmáticas de CAB fueron hasta 53 veces mayores que las del PA-IC90 4x durante 90 días. En los macacos rhesus, los CAB ISFI mantuvieron las concentraciones plasmáticas de CAB por encima de 4 × PA-IC90 durante 6 a 11 meses, a diferencia de las formulaciones de CAB de acción prolongada informadas anteriormente que documentaron períodos mucho más cortos de niveles plasmáticos de CAB por encima de los puntos de referencia protectores40,41,42. 43. Nuestros estudios de seguridad in vivo en ratones hembra BALB/c y macacos rhesus hembra mostraron que los CAB ISFI se toleraron bien sin niveles significativos de inflamación local o sistémica. Además, los implantes palpables aún eran recuperables en ratones y macacos hasta 90 días después de la inyección, lo que demuestra la capacidad de retirarse fácilmente en caso de eventos adversos, lo que puede eliminar la necesidad de cubrir una larga cola farmacológica con PrEP oral como es el caso. con la formulación actual de CAB LA. También notamos que aproximadamente el 60 % de CAB permanece en el implante en ratones y entre el 30 y el 60 % de CAB permanece en cada implante en macacos después de la recuperación entre 84 y 90 días después de la inyección, lo que demuestra que los CAB ISFI tienen el potencial de liberarse durante períodos mucho más prolongados. de tiempo.

En los macacos rhesus, una dosis de 50 mg/kg de CAB LA inyectable proporciona concentraciones plasmáticas de CAB superiores al punto de referencia de protección de la PrEP establecido durante aproximadamente 6 semanas44. Aquí, mostramos que dos inyecciones de ISFI de CAB de 1 ml que contienen solo de 1,5 a 2,9 veces más CAB por kg pueden mantener los niveles de CAB en plasma por encima de este punto de referencia durante 6 a 11 meses. En los tejidos rectales y vaginales, las concentraciones de CAB también estuvieron dentro del rango de las observadas en macacos tratados con CAB LA y alrededor de 2 a 4 veces más altas que las alcanzadas en humanos con la dosis clínica de 600 mg de CAB LA, aunque existe una posible limitación. que nuestro análisis solo incluyó las primeras 12 semanas posteriores a la implantación44,45. Además, CAB ISFI de acción ultralarga tiene ventajas notables sobre otras formulaciones de CAB de acción prolongada que se encuentran en desarrollo preclínico. Karunakaran et al. informaron sobre implantes CAB radiopacos de poli(éter-uretano) hidrofílicos de acción prolongada que alcanzaron niveles plasmáticos en macacos por encima de 1× PA-IC90 durante 12 semanas, pero cayeron por debajo de 4× PA-IC90 después de ~2 semanas después de la implantación con seis implantes por macaco41. Cada implante tenía ~274 mg de CAB y liberaba un promedio de 348 µg de CAB/día in vivo41. Zhou et al. y Kulkarni et al. informó sobre un profármaco de CAB nanoformulado inyectable que demostró una liberación prolongada de CAB en macacos (45 mg equivalentes de CAB/kg, ~2 ml de volumen de inyección intramuscular) durante un año, sin embargo, las concentraciones plasmáticas de CAB cayeron por debajo de 4 × PA-IC90 y PA-IC90 después de ~60 días42 y 200 días43, respectivamente. El CAB ISFI inyectable y biodegradable descrito en nuestro estudio demostró niveles de CAB en plasma por encima de 4 × PA-IC90 durante 6 a 11 meses en macacos y mostró una protección del 100 % contra múltiples desafíos rectales de SHIV con solo dos inyecciones subcutáneas de 1 ml.

Nuestros resultados que muestran una protección del 100 % en macacos durante varios meses también representan, según nuestro conocimiento, la actividad de PrEP documentada más larga vista con una sola administración de CAB. Limitamos los desafíos SHIV a períodos en los que los niveles de CAB en plasma estaban por encima de 4 × PA-IC90, ya que esta concentración representa un punto de referencia de protección de PrEP bien establecido en macacos y humanos. Por lo tanto, la protección completa observada a pesar de un acumulado de 38 exposiciones rectales a SHIV no fue del todo inesperada. Será importante definir con más detalle la duración de la actividad de la PrEP de los ISFI de CAB, ya que los niveles por encima de 1× PA-IC90 también se han asociado con una protección significativa (>95 %) contra los desafíos de SHIV rectal en macacos40,46. Este análisis también puede informar sobre posibles reducciones en las dosis o los volúmenes de inyección de CAB ISFI y sobre la posible extensión de la protección más allá de los 5,6 meses previstos con una inyección de 3 ml en humanos. Sin embargo, la documentación de infecciones poco frecuentes en humanos que recibieron CAB LA y mantuvieron los niveles objetivo puede argumentar en contra de la reducción de la dosis de CAB47,48.

El análisis de las concentraciones plasmáticas de CAB en macacos después de la extracción del implante después de 3 meses también proporcionó información importante sobre la recuperabilidad de los ISFI. En dos de los macacos, la extracción de los dos implantes resultó en una disminución rápida de 10 a 100 veces en los niveles plasmáticos de CAB dentro de las 2 semanas, aunque se evidenció algo de material residual del implante en uno de los animales, como lo indica la detección persistente de CAB. en plasma a niveles superiores al PA-IC90. En otro macaco, la extracción de uno de los dos implantes resultó en una disminución rápida de 2 veces en los niveles plasmáticos de CAB en una semana. En todos los casos, aproximadamente la mitad de la dosis de CAB permaneció en el ISFI recuperado, lo que sugiere que los ISFI de CAB tienen el potencial de liberarse durante períodos de tiempo mucho más prolongados. Se necesitan estudios futuros para definir la ventana de removibilidad y comprender el tiempo hasta el agotamiento de CAB de ISFI. Aunque el CAB ISFI propuesto ha demostrado un potencial prometedor para la PrEP contra el VIH, existen algunas limitaciones en esta formulación. Por ejemplo, aunque no observamos ningún signo de toxicidad o eventos adversos en nuestro estudio de seguridad en ratones, nuestros resultados son limitados debido al bajo tamaño de la muestra del estudio (n = 3). Por lo tanto, los estudios futuros incluirán la realización de un estudio de seguridad integral en ratones con un tamaño de muestra más grande y la evaluación de la seguridad a largo plazo hasta 180 días. Otra limitación es que hay una disminución inicial de la concentración de CAB en los macacos durante las dos primeras semanas posteriores a la inyección con una pérdida potencial de la actividad de la PrEP a medida que los niveles caen por debajo de 4x PA-IC90. Este período de baja liberación, si se confirma en humanos, se traduciría en la recomendación de modalidades alternativas de prevención del VIH durante 28 días después de la primera inyección de CAB ISFI con un volumen de inyección de 2 ml o 21 días con una inyección de 3 ml. Las pautas actuales de PrEP de los CDC recomiendan modalidades alternativas de prevención del VIH durante 7 a 20 días después de iniciar la PrEP oral diaria, según la ruta potencial de transmisión49. Otra limitación potencial es que la formulación incluye solventes orgánicos, que podrían causar toxicidad en altas cantidades. La dosis letal media (LD50) y el nivel sin efecto observable (NOEL) de NMP es de 3600 mg/kg y 257 mg/kg, respectivamente en ratones cuando se administra por vía intravenosa50. Alternativamente, la LD50 y NOEL de DMSO es de 4000 mg/kg y 3300 mg/kg respectivamente en primates no humanos y la LD50 en ratones es de 14 000 mg/kg cuando se administra en el torrente sanguíneo51. En nuestro estudio, se administraron ~300 mg/mL por solvente a ratones (700 mg/kg por solvente) y macacos (71 mg/kg por solvente) y no mostraron signos de toxicidad crónica o manifiesta. Aunque los ISFI están muy por debajo de los límites LD50 y NOEL para DMSO y NMP en macacos, los estudios futuros deben incluir esfuerzos para disminuir la cantidad de solvente para reducir los posibles problemas de toxicidad.

Los estudios adicionales para abordar estas limitaciones y avanzar aún más en este estudio incluyen (1) aumentar la liberación en ráfaga de CAB ISFI, la dosis administrada o implementar una dosis inicial oral para garantizar que las concentraciones en plasma permanezcan por encima de 4 × PA-IC90 durante el primer mes después de la inyección (2) determinando el tiempo hasta completar la liberación de CAB y la degradación completa del polímero para evaluar el perfil farmacocinético completo in vivo, y (3) incorporar sulfato de bario para generar un implante radiopaco para el monitoreo de rayos X para facilitar la recuperación si necesarios e investigar la migración del implante. Además, hemos demostrado la capacidad de cargar múltiples ARV en un solo ISFI logrando una cinética de liberación de acción ultra prolongada en ratones20. Por lo tanto, los estudios futuros adicionales pueden incluir la adición de otro ARV a la formulación CAB ISFI propuesta actual para aplicaciones de tratamiento del VIH.

En conjunto, estos resultados destacan la promesa de CAB ISFI como una plataforma de acción ultra prolongada para administrar PrEP y respaldar su avance clínico en humanos. La seguridad preclínica observada y la bioequivalencia farmacocinética ampliada con CAB LA son muy prometedoras y, si se demuestran clínicamente, pueden resultar en una vía acelerada para la aprobación regulatoria, posiblemente sin la necesidad de ensayos de eficacia. Anticipamos que los CAB ISFI serán altamente deseables con una alta adherencia si se avanzan a un entorno clínico. Los estudios han demostrado que los inyectables de acción prolongada obtienen la mayor aceptabilidad y adherencia del usuario en áreas donde la prevalencia del VIH es más alta en comparación con otras posibles formas de dosificación (p. ej., píldora oral diaria y anillos vaginales)5,10 debido a la baja frecuencia de dosificación, la familiaridad, la facilidad de uso y discreción. Además, la formulación propuesta podría autoadministrarse ya que se inyecta por vía subcutánea, lo que podría aumentar aún más la aceptabilidad del usuario y la facilidad de acceso. En general, CAB ISFI de acción ultraprolongada tiene el potencial de administrarse dos o tres veces al año en un entorno clínico y puede avanzar en el panorama del VIH y ampliar las opciones preventivas en todo el mundo.

Se adquirió poli(DL-lactida-co-glicolida, PLGA) 50:50 de LACTEL (Birmingham, AL; Cat. No. B6010-1P, Lot# A17–142, peso molecular 27,2 kDa, viscosidad inherente 0,26-0,54 Dl/ g; Cat. No. B6017-1G, Lote # A15-108, peso molecular 10 kDa, viscosidad inherente 0.15-0.25 Dl/g). N-metil-2-pirrolidona (NMP, USP) se recibió de ASHLAND (Wilmington, DE, código de producto 851263, 100 % NMP). El dimetilsulfóxido (DMSO, ≥99,7 %) se adquirió de Fisher Scientific (Waltham, MA). Solutol-HS 15, solución salina tamponada con fosfato (PBS 0,01 M, pH 7,4) y acetonitrilo (ACN) de grado HPLC y agua se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Gelucire 44/14 (Cat. No. 1356950) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Tween 20 se adquirió de Fisher Scientific (Hampton, NJ; Cat. No. BP337-100). El tetrahidrofurano (THF) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, Mo; Cat. No. SHBF9530V). Acros Organics (Carlsbad, CA; AM Cat. No. 16435000, APS Cat. No. 40116-1000) y solución de bis-acrilamida al 2% y N, N , N', N'-tetrametil etilendiamina (TEMED) se adquirieron de Fisher Scientific (Hampton, NJ; bis-acrilamida Cat. No. BP150-20, TEMED Cat. No. BP1404-250). Se adquirió CAB de alta pureza (≥99 %) de Selleckchem (Houston, TX; n.º de catálogo S7766) y se adquirió DMSO filtrado estéril (≥99,7 %) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; n.º de lote RNBH5297).

Se llevó a cabo un análisis HPLC de fase inversa en un sistema HPLC Agilent 1260 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) con un detector de matriz de diodos y una bomba LC con inyector automático. La fase estacionaria utilizada para el análisis CAB fue una columna Inertsil ODS-3 (5 μm, 4,6 × 150 mm 100 Å, [GL Sciences, Torrance, CA]) mantenida a 40 °C. La separación cromatográfica se logró mediante elución en gradiente utilizando una fase móvil que constaba de ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua y ACN (H2O/ACN 95:5 v/v). El caudal fue de 1,0 ml/min y el tiempo de ejecución total fue de 25 min para cada inyección de 25 ml. CAB se analizó a una longitud de onda de 254 nm y tuvo un tiempo de retención de 11,4 minutos. El rango de calibración para el ensayo fue de 0,48 a 250 µg/mL. Se utilizó el software Agilent OpenLab (versión C.01.08) para la recopilación de datos de HPLC.

La concentración de saturación de CAB en NMP, DMSO, varias proporciones de peso (p/p) de NMP:DMSO (1:1, 9:1 y 2:8 p/p), 9:1 NMP:Gelucire 44/14 ( p/p), 9:1 p/p (NMP:DMSO):Tween 20 (Tabla complementaria 1) para determinar el solvente óptimo en el sistema ISFI para la carga máxima de CAB. La solubilidad de saturación de CAB también se midió en medios de liberación (PBS con Solutol al 2 %) para garantizar las condiciones de sumidero (por debajo de 1/5 de la solubilidad máxima52) durante los estudios de liberación in vitro (Tabla complementaria 1). Se ha demostrado que la adición de Solutol en los medios de liberación aumenta la solubilidad de los fármacos hidrofóbicos en los medios de liberación, lo que garantiza que se mantengan las condiciones de sumidero durante los estudios de liberación in vitro20. La solubilidad de saturación de CAB aumentó 4,3 veces con la adición de Solutol al 2 % en PBS en comparación con PBS solo.

Para determinar la solubilidad de saturación de CAB en los siguientes solventes que se muestran en la Tabla complementaria 1, se pesaron 100 mg de CAB en viales individuales y se agregaron 100 mg de cada solvente respectivo. La mezcla se agitó a 37 °C durante 24 h. Las muestras se centrifugaron durante 30 min a 16 000 × g (Eppendorf Centrifuge 5415R, EE. UU.) para eliminar el exceso de fármaco no disuelto. Se recogieron alícuotas de muestra (n = 3) del sobrenadante saturado y se diluyeron con ACN20. La concentración de fármaco en las alícuotas saturadas se determinó mediante análisis HPLC.

Se mezcló poli(DL-láctido-co-glicólido) (PLGA) 50:50 (peso molecular de 27 kDa o 10 kDa) con una proporción de peso de 1:1 (p/p) de NMP:DMSO a una proporción de 1:2 o 1:4. p/p en un vial de centelleo de 7 ml y se disolvió mezclándolo a temperatura ambiente para obtener una formulación de placebo homogénea. Posteriormente, se añadió cabotegravir (CAB; 100-400 mg/g) a la respectiva solución de polímero/disolvente y se permitió que se solubilizara el fármaco y se produjera una solución o suspensión ISFI estable en su carga de fármaco objetivo. Para garantizar la disolución completa del fármaco en la formulación de placebo y la homogeneidad de la solución o suspensión del fármaco, se recogieron alícuotas de muestra (1–2 mg, n = 4) de la formulación del fármaco y se disolvieron en ACN. La concentración de fármaco se cuantificó mediante análisis HPLC.

Para los estudios in vivo, las formulaciones de ISFI se prepararon en condiciones asépticas en una cabina de bioseguridad. Todos los disolventes y las formulaciones de placebo ISFI se esterilizaron por filtración (filtro de jeringa de nailon estéril Puradisc de 13 mm, 0,2 µm; Cat# 6786-1302). Posteriormente se añadió CAB a la solución de polímero/disolvente filtrada estéril y se solubilizó para producir una solución o suspensión ISFI estable en su carga de fármaco objetivo. Para garantizar la completa disolución y homogeneidad del fármaco, se recogieron alícuotas de muestra (1–2 mg, n = 3) de la formulación del fármaco y se disolvieron en ACN y se cuantificó la concentración del fármaco mediante análisis HPLC.

Las microestructuras de los implantes se evaluaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como se describió anteriormente20,30. En resumen, para evaluar la microestructura de los ISFI in vitro, se inyectaron 30 ± 3 mg de solución o suspensión de ISFI en 200 ml de PBS 0,01 M, pH 7,4 con Solutol al 2 % a 37 °C. En puntos de tiempo predeterminados (3, 30 y 90 días después de la incubación), los implantes se retiraron de la solución del baño, se congelaron instantáneamente y se liofilizaron durante 48 h (FreeZone Benchtop Freeze Dryer, Labconco, Kansas City, MO) . No fue posible la preparación de muestras de ISFI para imágenes SEM antes del día 3 debido a la distorsión del implante probablemente causada por la inversión de fase incompleta y el intercambio de solventes20,27,53. Después de la liofilización, todos los depósitos se cortaron por la mitad para exponer la sección transversal para la obtención de imágenes. Las muestras liofilizadas se montaron posteriormente en un trozo de aluminio utilizando cinta de carbono y se recubrieron por pulverización con 9 nm de aleación de oro-paladio (60:40) (Hummer X Sputter Coater, Anatech USA, Union City, CA). Luego se tomaron imágenes de las muestras recubiertas usando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Zeiss Supra 25 con un voltaje de aceleración de 5 kV, una apertura de 30 µm y una distancia de trabajo promedio de 10 mm (Carl Zeiss Microscopy, LLC, Thornwood, NY). Los ISFI que se sometieron a imágenes/análisis de rayos X de dispersión de energía SEM (EDX) se montaron en trozos de aluminio con cinta de carbón y se recubrieron con 3 nm de recubrimiento conductor de oro. A continuación, se tomaron imágenes de las muestras recubiertas usando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Hitachi S-4700 a un voltaje de aceleración de 20 kV, una corriente de haz de 10 µA y una distancia de trabajo promedio de 12 nm. El análisis EDX se realizó en Oxford INCA PentaFet-X3 conectado al microscopio a un voltaje de aceleración de 20 kV.

Los estudios de liberación in vitro se realizaron de manera similar a lo descrito anteriormente20. En resumen, se investigó la cinética de liberación de fármacos in vitro de CAB ISFI inyectando la solución o suspensión de polímero cargada de fármaco (30 ± 3 mg) en 200 ml de medio de liberación (PBS 0,01 M pH 7,4 con Solutol al 2 %) e incubando bajo el fregadero. condiciones a 37 °C. La adición de Solutol aumenta la solubilidad de CAB en los medios de liberación, lo que garantiza que se mantengan las condiciones de sumidero52. La solubilidad de saturación de CAB aumentó 4,3 veces en PBS con Solutol al 2 % en comparación con PBS solo. Las condiciones de sumidero se definieron como la concentración máxima de CAB en PBS con un 2 % de Solutol inferior a 1/5 veces la solución de saturación52. El medio de liberación se eliminó por completo y se reemplazó con medio fresco cada semana para mantener las condiciones del fregadero. Se recolectaron alícuotas de muestra (1 ml) diariamente durante una semana y luego semanalmente. La concentración de fármaco en el medio de liberación se determinó por HPLC. La liberación acumulativa de fármaco se calculó a partir del análisis HPLC y se normalizó por la masa total de fármaco en el implante. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Los estudios de estabilidad ISFI se realizaron de manera similar a como se describió anteriormente20. Las formulaciones de CAB ISFI se almacenaron a 4 °C o en una cámara de vidrio a 40 °C/75 % de humedad relativa (HR) en una incubadora Fisher Scientific Isotemp (Pittsburgh, PA). La cámara de vidrio donde se encontraban los viales de formulación incluía una solución acuosa saturada de sal de cloruro de sodio para lograr una humedad relativa del 75% a 40 °C54. Se incluyó un sensor de humedad dentro de la cámara de vidrio para verificar una humedad relativa del 75%. Las formulaciones se eliminaron 30 y 90 días después de la incubación y se recolectaron y analizaron por HPLC alícuotas de muestra (1–2 mg, n = 4) para evaluar el contenido de fármaco y la posible degradación del fármaco. Las formulaciones también se inspeccionaron visualmente para detectar cualquier cambio en su estado físico (es decir, color y viscosidad). Se realizó un estudio de liberación in vitro posterior al almacenamiento si la formulación demostraba estabilidad física (es decir, sin decoloración, separación de fases o precipitación), contenido de fármaco similar al control en el tiempo 0 (<10 % de diferencia) y una suspensión homogénea.

La GPC se realizó como se describió previamente30. En resumen, GPC se utilizó para evaluar la degradación de polímeros de ISFI de placebo después del almacenamiento, así como la degradación de polímeros en ISFI CAB que se recuperaron 30, 60 y 90 días después de la inyección de ratones BALB/c. El análisis de GPC de ISFI de placebo, ISFI de CAB y polímero puro se realizó en Tosoh Biosciences EcoSEC Elite HLC-8420 equipado con una columna TSKgel GMH-M. Las dimensiones de la columna son 7,8 mm × 30 cm con un tamaño de poro de 5 micras. Se utilizó tetrahidrofurano como fase móvil a un caudal de 0,5 ml/min. El peso molecular se informó en relación con los estándares de poliestireno y se analizó a través de la detección del índice de refracción (IR).

Se llevó a cabo un estudio in vivo de 30 días para evaluar la inflamación sistémica y local de CAB ISFI en ratones hembra BALB/c (8–10 semanas, Jackson Laboratory). Todos los experimentos se llevaron a cabo con un protocolo aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Carolina del Norte. Las condiciones de alojamiento de los ratones incluyeron un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h a una temperatura ambiente de 68 a 72 °F con una humedad del 30 al 70 %. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 50 µl de la formulación CAB ISFI con una aguja de 19 G (n = 9 ratones). Dos ratones no recibieron una inyección y se usaron como control. En los días 3, 7 y 30 posteriores a la administración, se sacrificaron los ratones (n = 3/punto de tiempo para los grupos de tratamiento con CAB ISFI y n = 1 ratón de control en el día 3 y 30 que no recibieron ningún tratamiento ni inyección) y muestras de sangre. mediante punción cardíaca se recogieron en tubos capilares y se almacenaron a -80 °C para cuantificar las citocinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la interleucina-6 (IL-6) mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, MAX ™ conjuntos de lujo, BioLegend®). El ISFI se recolectó para histología extirpando circunferencialmente el depósito y rodeando 1 cm de piel con tejido adiposo subcutáneo subyacente y colocando todo el espécimen plano sobre cartulina para fijar el tejido plano. La muestra se colocó en formalina tamponada neutra al 10 % en una proporción de 1:10 tejido: fijador a temperatura ambiente durante 72 h, y luego se transfirió a etanol al 70 % a temperatura ambiente hasta que la muestra se agrupó. Las muestras de piel fija se seccionaron por la mitad con el depósito orientado en el centro y la piel cortada se incrustó en el borde en bloques de parafina. Las muestras se seccionaron a 4 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina usando el autostainer XL de Leica Biosystems. Las secciones se tiñeron con Hematoxilina (Richard-Allen Scientific, 7211) durante 2 min y Eosina-Y (Richard-Allen Scientific, 7111) durante 1 min. Se usaron las soluciones Clarifier 2 (7402) y Bluing (7111) de Richard-Allen Scientific para diferenciar la reacción. La inflamación fue calificada por un patólogo veterinario certificado por la junta, de la siguiente manera: 0: células inflamatorias presentes dentro de los límites esperados; 1: inflamación mínima, pocas células inmunitarias aumentadas y dispersas presentes; 2: inflamación leve, pequeños grupos de células inmunitarias que se adelgazan o pistas localizadas de inflamación o aumento leve del número de células que rodean difusamente el depósito; 3, trayectos moderados, más gruesos o múltiples de inflamación o un número moderado de células que rodean difusamente el depósito; 4, vías de inflamación graves y coalescentes lo suficientemente grandes como para reemplazar la arquitectura tisular normal o un gran número de células que rodean difusamente el depósito; 5, marcada inflamación presente que está reemplazando áreas expansivas de arquitectura tisular normal. La inflamación local y sistémica de los grupos de tratamiento se comparó con el grupo de control sin inyección.

Se realizó un estudio in vivo de 90 días para evaluar la farmacocinética in vivo de CAB ISFI en ratones hembra BALB/c (8 a 10 semanas, Jackson Laboratory). Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo con un protocolo aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Carolina del Norte. Las condiciones de alojamiento de los ratones incluyeron un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h a temperatura ambiente de 68 a 72 ° Fahrenheit con 30 a 70 % de humedad. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 50 µl de la formulación CAB ISFI con una aguja de 19 G (n = 6 ratones). A 1 hora, 1 día, 3 días, 7 días, 30 días, 60 días y 90 días, se recogió sangre periférica de ratones en tubos capilares recubiertos con EDTA para aislar el plasma. Todas las muestras se almacenaron a -80 °C hasta el análisis FC. El CAB se extrajo del plasma de ratón mediante una extracción líquido-líquido seguida de un análisis por LC-MS/MS. Brevemente, se mezclaron 25 μL de plasma de ratón con 40 μL de agua:metanol 80:20 que contenía el 13C,2H2,15N-CAB estable, marcado isotópicamente y 300 μL de acetato de etilo. Después de mezclar y centrifugar, la capa orgánica se eliminó y se evaporó hasta sequedad. Los extractos se reconstituyeron con 75 μL de agua 75:25 con ácido fórmico al 0,1 %:acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 % antes del análisis LC-MS/MS. La separación cromatográfica se realizó en una columna analítica Waters XTerra MS C18 (50 × 2,1 mm, tamaño de partícula de 3,5 μm) en condiciones de gradiente con detección en un espectrómetro de masas triple cuádruple AB Sciex API-5000. El rango de calibración para el ensayo fue de 25 a 50 000 ng/mL. Los estándares de calibración y las muestras de control de calidad estaban dentro del 15 % de las concentraciones nominales.

Para evaluar la capacidad de eliminar de manera segura un ISFI posterior a la administración en caso de eventos adversos, se inyectaron por vía subcutánea CAB ISFI (50 µL) en ratones hembra BALB/c (8–10 semanas, Jackson Laboratory) (n = 18) y se eliminaron los ISFI en el día 30 (n = 6), 60 (n = 6) y 90 (n = 6). Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo con un protocolo aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Carolina del Norte. Las condiciones de alojamiento para los ratones incluyeron un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h a temperatura ambiente de 68 a 72 ° Fahrenheit con 30 a 70 % de humedad. Se sacrificó a los ratones y se extrajeron los ISFI haciendo una pequeña incisión adyacente al lugar de la inyección a los 30 (n = 6), 60 (n = 6) y 90 días (n = 6) después de la administración. Los ISFI extraídos en los días 30, 60 y 90 se procesaron adicionalmente para evaluar la pérdida de masa, la disminución del peso molecular del polímero mediante análisis GPC (n = 3/punto temporal) y para cuantificar el fármaco residual (n = 3/punto temporal). Para cuantificar la concentración de fármaco residual, se eliminó cuidadosamente el exceso de tejido de los implantes. Los implantes se colocaron en ACN para facilitar la extracción del fármaco y la concentración residual del fármaco se cuantificó mediante análisis HPLC.

Utilizamos hidrogeles de poliacrilamida para evaluar la inyectabilidad de CAB ISFI a un volumen de inyección similar administrado a primates no humanos (1 ml). La preparación de hidrogeles de poliacrilamida (40 ml) se adaptó de los protocolos previamente informados36,37. Brevemente, se preparó un hidrogel de 40 ml combinando una solución acuosa de acrilamida al 40 % en peso (16 ml), una solución acuosa de bis-acrilamida al 2 % en peso (2 ml) y 22 ml de PBS 0,01 M pH 7,4. La mezcla se enfrió a 4 °C y posteriormente se añadieron APS al 10 % en peso (2 ml) y 200 µl de TEMED y se colocaron a 4 °C durante la noche para permitir la polimerización de la solución. Se inyectó 1 ml de la formulación ISFI o CAB ISFI de placebo en el hidrogel con una aguja de 16, 18 o 19 G para evaluar la capacidad de inyección.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC). Los macacos se alojaron en los CDC bajo el cuidado de los veterinarios de los CDC de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia y se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar las molestias, lo que incluye brindar condiciones de alojamiento adecuadas, suplementos dietéticos y amplias oportunidades de enriquecimiento.

Los macacos rhesus hembras recibieron inyecciones subcutáneas de CAB ISFI (500 mg/mL) en dos lugares diferentes en la parte superior de la espalda (0,5–1 mL por sitio). Brevemente, los animales anestesiados se colocaron en posición de decúbito ventral y la suspensión semiacuosa de ISFI cargada en una jeringa de 3 cc se administró en el espacio subcutáneo utilizando una aguja de 16 G. Se aplicó presión digital brevemente sobre el sitio de administración después de retirar la aguja.

Para evaluar la viabilidad de la extracción del implante y medir la cola del fármaco, se recuperaron quirúrgicamente los ISFI que permanecieron palpables de dos macacos en la semana 12 (RA-1097 y RA-1093; 2 implantes cada uno) y de un animal en la semana 14 (RH- 42012; 1 implante recuperado). Los animales se colocaron en decúbito ventral y las ubicaciones de los implantes se confirmaron mediante palpación digital. Se usó un bisturí quirúrgico para hacer una sola incisión dérmica (~ 1 pulgada) sobre cada implante. El material ISFI se separó cuidadosamente del tejido conjuntivo circundante y se recuperó casi intacto utilizando pinzas. El sitio de la incisión se inspeccionó visualmente en busca de anomalías y posteriormente se enjuagó con solución salina estéril antes de cerrarlo con suturas de polidioxanona. Los animales fueron monitoreados semanalmente por veterinarios asistentes para evaluar los sitios quirúrgicos para la cicatrización adecuada de heridas y para asegurar que no haya signos de infección local.

Para la evaluación farmacocinética longitudinal, seis macacos rhesus hembras recibieron CAB ISFI seguidos de mediciones del nivel del fármaco en plasma sanguíneo y tejidos rectales y vaginales. Cinco de los animales recibieron dos inyecciones de 1 ml (un total de 1000 mg de CAB) y un animal (RH-1080) recibió volúmenes de inyección de 1 y 0,5 ml (un total de 750 mg de CAB). Los niveles de CAB se midieron semanalmente en plasma durante un máximo de 11 meses y en tejidos en las semanas 4, 8 y 12 utilizando un método LC-MS validado como se describió anteriormente55. Se recolectaron biopsias rectales y vaginales de macacos RH-42012, RA-1048 y RA-1080 en las semanas 4, 8 y 12. El límite inferior de cuantificación fue de 1 ng/mg y 10 ng/mL para biopsia y plasma, respectivamente. .

Usamos un modelo de exposición rectal SHIV162P3 de exposición repetida que predijo la eficacia clínica de todos los regímenes de PrEP actualmente aprobados56. SHIV162P3 se obtuvo del Programa de reactivos de referencia e investigación del SIDA de los NIH (ARP-6526) y se expandió en PBMC de macaco rhesus. El stock de desafío final se diluyó a 10 TCID50 y se almacenó individualmente como alícuotas de 1 ml en nitrógeno líquido y se descongeló antes de cada desafío rectal. En este modelo, los macacos rhesus de control no tratados expuestos a 10 TCID50 de SHIV162p3 se infectan después de una mediana de dos desafíos56,57. Se utilizaron seis macacos rhesus hembras en el estudio (10 años; 7–11 kg). A cuatro se les implantaron CAB ISFI y se les expuso por vía rectal a SHIV162p3 dos veces por semana durante períodos en los que las concentraciones de CAB estaban por encima de la IC90 ajustada por proteína cuatro veces (4x PA-IC90). De estos, dos fueron desafiados entre las semanas 4 y 8 posteriores a la implantación para un total de ocho desafíos SHIV cada uno. Los depósitos CAB ISFI se extrajeron quirúrgicamente de ambos animales en la semana 12 para medir la cola del fármaco y se controló la infección por SHIV durante el período de lavado del fármaco. Los dos animales restantes fueron desafiados dos veces por semana entre las semanas 14 a 18; uno de estos animales (RH-1048) recibió seis desafíos adicionales entre las semanas 25 y 28. El resultado de la infección de los animales tratados con CAB en cada grupo se comparó con dos animales no tratados desafiados simultáneamente con el mismo stock y dosis de SHIV162p3. Se recolectó sangre semanalmente durante los desafíos y la fase de seguimiento para las pruebas de diagnóstico. El ARN de SHIV en plasma se cuantificó mediante un ensayo de RT-PCR con una sensibilidad de 50 copias de ARN/ml. Las respuestas serológicas específicas del virus se midieron mediante un ensayo de inmunoensayo enzimático de péptidos sintéticos (BioRad, Genetic Systems HIV-1/HIV-2, Redmond, WA)56. Los animales se consideraron protegidos si eran seronegativos y ARN viral negativos durante los desafíos SHIV y un período de seguimiento de 16 semanas.

Se realizaron controles de bienestar semanales para evaluar la seguridad y tolerabilidad de los implantes CAB ISFI. Los exámenes físicos incluyeron el control del peso de los animales, el estado de salud general y una inspección minuciosa del área que rodea los implantes en busca de reacciones cutáneas visibles (Fig. 8 complementaria). El eritema y el edema se clasificaron visualmente según la escala de Draize y se evaluaron con una puntuación de 0 (ninguna reacción) a 4 (reacción grave)58.

Durante la extracción del implante, se recogieron dos biopsias dérmicas con sacabocados quirúrgicos de 3 mm en la parte media y craneal de la ubicación del implante para medir los niveles de fármaco y para la evaluación histológica. Se pesó una biopsia y se congeló instantáneamente para probar el nivel de fármaco y la otra se fijó en formalina al 10% para el examen histológico. Las biopsias almacenadas en formalina se dividieron en dos, se incluyeron, seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se evaluaron las secciones para determinar el tipo y la intensidad de la inflamación, así como la abundancia de fibrosis y la presencia de necrosis. Las secciones fueron cegadas y evaluadas de forma independiente por dos patólogos veterinarios. Utilizamos una puntuación semicuantitativa basada en las directrices ISO (ISO 10993-6:2007) para células inflamatorias, incluidos neutrófilos, linfocitos, células plasmáticas, macrófagos, eosinófilos y fibroblastos reactivos dentro de la dermis y tejidos subcutáneos y fibroblastos. La distribución y la gravedad de la infiltración por cada tipo de célula se puntuaron en una escala de 0 a 5, en la que 0 representa la ausencia de células y 5 representa una infiltración extensa por el tipo de célula específico.

Cada implante (izquierdo y derecho) se extrajo del tejido y luego se colocó en ACN en un ambiente estéril BSL2+. Luego, la muestra se retiró del ambiente estéril y se colocó en una incubadora con agitación. Se recogieron y analizaron por HPLC alícuotas de muestra (1 ml, n = 3) de la solución de extracción.

Para respaldar la estimación de las tasas de entrada de CAB ISFI en macacos, NCA estimó las tasas de eliminación de CAB individuales utilizando la regla trapezoidal lineal hacia arriba y hacia abajo en Phoenix WinNonlin v8.3 para 4 animales con concentraciones plasmáticas recolectadas durante 98 a 329 días después de la administración de ISFI ( Figura complementaria 9). Esta estimación no se pudo realizar para los 2 animales (RH-1093 y RH-1097) cuyos implantes se retiraron 84 días después de la administración. Por lo tanto, AUCINF se derivó en base a la ecuación \(f=\left(\right.{C}_{{last}}+\left({kel}*{{AUC}}_{{last}}\right) /({kel}*{{AUC}}_{{INF}})\)59 donde f es la fracción de dosis absorbida (es decir, masa cargada – masa residual) y kel se fijó en 0,173 hr-1 según los datos informado en la nueva solicitud de fármaco 39. El aclaramiento se calculó entonces mediante \({Cl}=({Dosis}*F)/({{AUC}}_{{INF}})\). Todos los cálculos supusieron biodisponibilidad (F) a través de la vía de administración SQ fue del 100 %, lo que concuerda con las suposiciones utilizadas para los modelos farmacocinéticos poblacionales informados de la inyección IM de LA CAB39.

Para respaldar la comparación de las tasas de entrada de CAB ISFI vs CAB LA en macacos, se utilizó el software Quintessa Graph Grabber v2.0.2 para extraer datos PK de un gráfico de concentración versus tiempo publicado de 9 macacos que recibieron dos inyecciones IM de 50 mg/kg de CAB LA durante 6 días. aparte38. Se usó NCA como antes para estimar el aclaramiento de animales individuales asumiendo un peso de 8 kg.

Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism versión 9.4 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Para analizar las diferencias en los perfiles de liberación de CAB in vitro al variar la carga de fármaco y el peso molecular de PLGA, se realizó una prueba ANOVA de dos vías y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey con respecto al punto de tiempo y la formulación. Para analizar las diferencias en los perfiles de liberación de CAB in vitro posteriores al almacenamiento en comparación con la línea de base, se realizó una prueba ANOVA de dos vías y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey con respecto al punto de tiempo y la condición de almacenamiento. Se realizó una prueba ANOVA de dos vías y una prueba de comparaciones múltiples de Sidak con respecto al punto de tiempo y las concentraciones de TNF-α e IL-6 en plasma para analizar las diferencias en inflamación sistémica in vivo con el grupo de control sin inyección. Para todas las pruebas estadísticas, se consideró significativo un valor de P <0,05 (nivel de confianza del 95 %).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento subyacente a las figuras 1a–c, 2a, c, 3e, 7b–d, así como a las figuras complementarias 1a–c y 2a, b. Todos los demás datos se proporcionan en el documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (números de concesión R01AI131430 a SRB y MK, R01AI162246 a SRB, R01AI140799 a JVG), Centro Nacional para el Avance de la Ciencia Traslacional (número de concesión KL2TR001109-04 a SRB), Universidad de North Carolina en el Centro de Investigación del SIDA de Chapel Hill (P30 AI050410) y el Programa de Becas de Investigación para Graduados de la Fundación Nacional de Ciencias (número de subvención DGE-1650116 para ICY). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Los hallazgos y conclusiones de este manuscrito pertenecen a los autores y no representan necesariamente los puntos de vista oficiales de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Nos gustaría agradecer al Núcleo de estudios animales de la UNC (ASC) por ayudar con las inyecciones ISFI en ratones, al Núcleo de química analítica y farmacología clínica de la UNC (CPAC), en particular a Lauren Tompkins y Brian Van Horne, y al Laboratorio analítico y de nanofabricación de Chapel Hill (CHANL). ) por ayudar con el análisis SEM EDX, particularmente Amar Kumbhar.

Estos autores contribuyeron por igual: Isabella C. Young, Ivana Massud.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Gerardo Garcίa-Lerma, S. Rahima Benhabbour.

División de Farmacoingeniería y Farmacéutica Molecular, Escuela de Farmacia Eshelman, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Isabella C. Young y S. Rahima Benhabbour

Sucursal de laboratorio, División de Prevención del VIH, Centro Nacional para la Prevención del VIH/SIDA, Hepatitis Virales, ETS y Tuberculosis, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA, EE. UU.

Ivana Massud, Andrew Wong-Sam, Chuong Dinh, Tiancheng Edwards, James Mitchell, Walid Heneine, Charles W. Dobard & J. Gerardo García-Lerma

División de Farmacoterapia y Terapéutica Experimental, Escuela de Farmacia Eshelman, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Mackenzie L. Cottrell, Amanda Schauer, Craig Sykes y Angela DM Kashuba

Departamento Conjunto de Ingeniería Biomédica, Universidad Estatal de Carolina del Norte y Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Roopali Shrivastava, Panita Maturavongsadit, Alka Prasher, Allison Thorson y S. Rahima Benhabbour

Rama de Medicina Comparada, División de Recursos Científicos, Centro Nacional para Enfermedades Infecciosas Emergentes y Zoonóticas, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA, EE. UU.

Victoria Mrotz

Subdivisión de Patología de Enfermedades Infecciosas, División de Patología y Patógenos de Alta Consecuencia, Centro Nacional para Enfermedades Infecciosas Emergentes y Zoonóticas, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA, EE. UU.

Josilene Nascimento Seixas

Departamento de Psicología y Neurociencia, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Aryani Pallerla

Núcleo de servicios de patología, Lineberger Comprehensive Cancer Center, Facultad de medicina de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Gabriela De la Cruz & Stephanie A. Montgomery

Centro Internacional para el Avance de la Ciencia Traslacional, División de Enfermedades Infecciosas, Centro para la Investigación del SIDA, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Martina Kovarova & J. Victor Garcia

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Conceptualización: SRB, JGG-L., IM, CWD, JVG, MK Metodología: JGG-L., SRB, IM, ICY, CWD, PM, AP, MLC, SAM, GDC Investigación: ICY, IM, CWD, PM, AP , RS, AW-S., CS, JM, AT, AP, AS, CD, MLC, SRB, JGG-L. Visualización: ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L,. TE, VM, JNS Adquisición de fondos: SRB, JGG-L., JVG, MK Administración del proyecto: SRB, JGG-L., JVG, MK, ADMK, WH Supervisión: SRB, JGG-L., JVG, ADMK Redacción: original borrador: ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L., MLC, CS, SAM, Redacción – revisión y edición: ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L., JVG, MK, WH

Correspondencia a J. Gerardo Garcίa-Lerma o S. Rahima Benhabbour.

SRB, ICY, RS y PM son los inventores de una patente que describe la formulación de fármacos a base de polímeros inyectables para la administración de fármacos de acción ultraprolongada. JGG-L. y WH se nombran en EE. UU. Patentes gubernamentales sobre "Inhibición de la infección por VIH a través de la quimioprofilaxis". JGG-L.,. IM y WH se nombran en EE. UU. Patente del gobierno sobre "profilaxis posterior a la exposición al VIH" y patente de los EE. Solicitud de patente gubernamental sobre "profilaxis previa a la exposición al VIH". Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Cristian Apetrei y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Young, IC, Massud, I., Cottrell, ML et al. Los implantes in situ de acción ultralarga con cabotegravir protegen a los macacos hembras contra la infección rectal por SHIV. Nat Comun 14, 708 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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Recibido: 16 Septiembre 2022

Aceptado: 24 de enero de 2023

Publicado: 09 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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