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Oct 16, 2023

Military Medical Research volumen 9, Número de artículo: 8 (2022) Citar este artículo

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El diagnóstico temprano y la clasificación de las infecciones aumentan la tasa de curación y disminuyen las complicaciones, lo que es importante para las infecciones graves, especialmente para la cirugía de guerra. Sin embargo, los métodos tradicionales se basan en operaciones laboriosas y dispositivos voluminosos. Por otro lado, los métodos de punto de atención (POC) sufren de solidez y precisión limitadas. Por lo tanto, es de urgente demanda desarrollar dispositivos POC para un diagnóstico rápido y preciso de infecciones para cumplir con los requisitos militarizados en el sitio.

Desarrollamos una plataforma de detección multiplexada asistida por chip microfluídico (WMC) en forma de onda (WMC-MDP). WMC-MDP reduce el tiempo de detección y mejora la repetibilidad mediante el premezclado de las muestras y la reacción de los reactivos. Además, combinamos la plataforma de detección con el sistema amplificado de estreptavidina-biotina (SA-B) para mejorar la sensibilidad mientras usamos la intensidad de la quimioluminiscencia (CL) como lectura de la señal. Realizamos la detección simultánea de proteína C reactiva (PCR), procalcitonina (PCT) e interleucina-6 (IL-6) en la plataforma de detección y evaluamos la sensibilidad, el rango lineal, la selectividad y la repetibilidad. Finalmente, terminamos de detectar 15 muestras de voluntarios y comparamos los resultados con los kits de ELISA comerciales.

La detección de CRP, PCT e IL-6 mostró buenas relaciones lineales entre las intensidades y concentraciones de CL en el rango de 1,25 a 40 μg/ml, 0,4 a 12,8 ng/ml y 50 a 1600 pg/ml, respectivamente. El límite de detección de PCR, PCT e IL-6 fue de 0,54 μg/ml, 0,11 ng/ml y 16,25 pg/ml, respectivamente. WMC-MDP es capaz de una buena selectividad y repetibilidad adecuadas. Todo el procedimiento de detección toma solo 22 minutos y cumple con los requisitos de un dispositivo POC. Los resultados de 15 muestras de voluntarios coincidieron con los resultados detectados por los kits ELISA comerciales.

WMC-MDP permite la detección simultánea, rápida y sensible de CRP, PCT e IL-6 con selectividad y repetibilidad satisfactorias, lo que requiere una manipulación mínima. Sin embargo, WMC-MDP aprovecha la ventaja de ser un dispositivo de microfluidos que muestra coeficientes de variación inferiores al 10 %, lo que permite que WMC-MDP sea un tipo de prueba en el punto de atención (POCT). Por lo tanto, WMC-MDP ofrece una alternativa prometedora a POCT de múltiples biomarcadores. Creemos que la aplicación práctica de WMC-MDP en campos militarizados revolucionará el diagnóstico de infecciones para los soldados.

Las infecciones pueden provocar una ligera irritación de la piel hasta una falla orgánica grave si no se tratan, especialmente en los campos de la traumatología y la cirugía de guerra. Las infecciones bacterianas y virales son los principales tipos de infección [1, 2]. Las infecciones graves pueden provocar sepsis. Retrasar una hora el tratamiento de la sepsis aumenta el riesgo de muerte entre un 6% y un 10% [3]. Por lo tanto, es necesario analizar biomarcadores para un diagnóstico y clasificación rápidos y precisos de las infecciones [4,5,6]. La detección múltiplex de proteína C reactiva (PCR) [7], procalcitonina (PCT) [8] e interleucina-6 (IL-6) [9] es un método confiable para diagnosticar con precisión infecciones y sepsis [10]. En el suero humano normal, el contenido de CRP es generalmente inferior a 8 μg/ml. La elevación de la PCR tiene una correlación positiva con la gravedad de la infección [11]. Los altos niveles de CRP están relacionados con infecciones bacterianas y algunas infecciones virales como la hemaglutinina 1, la neuraminidasa 1 (H1N1) y la enfermedad por el virus Corona 2019 (COVID-19) [12,13,14]. La enfermedad coronaria [15, 16], el cáncer [17, 18] y otras enfermedades de este tipo tienen altas concentraciones de PCR. Por esta razón, los diagnósticos de infecciones que se basan en la detección de PCR no son precisos. Normalmente, el nivel de PCT en sangre es inferior a 0,5 ng/ml en adultos sanos. PCT es un índice específico para la detección de infecciones bacterianas [19]. La concentración permanece normal cuando ocurren infecciones virales. IL-6 es un biomarcador altamente sensible y específico para el diagnóstico de infecciones. El nivel de IL-6 en suero humano normal es inferior a 75 pg/ml [20], que es extremadamente bajo. Es difícil detectar IL-6 para identificar infecciones virales y bacterianas. En sueros de pacientes con infecciones graves o sepsis, los niveles de IL-6 superan los 1000 pg/ml. CRP, PCT e IL-6 tienen diferentes tiempos y características anormales. Puede conducir a un diagnóstico erróneo de infecciones, aunque solo sea para detectar un solo biomarcador. Las detecciones multiplexadas de CRP, PCT e IL-6 pueden cubrir todo el período de infección. Evalúa de manera efectiva la clasificación y la gravedad de las infecciones [21]. Es imperativo desarrollar una técnica de detección multiplexada para biomarcadores infecciosos en los campos de pruebas militarizadas en el punto de atención (POCT) [22,23,24].

Como plataforma emergente para la detección médica [25,26,27], los chips de microfluidos tienen el potencial de desarrollar dispositivos POCT militarizados [28, 29]. Mou et al. [30] logró la detección multiplexada de CRP, PCT e IL-6 mediante el uso de microfibras electrohiladas y nanopartículas de oro para amplificar las señales. Pero los procedimientos de detección cuestan más de una hora. Además, las operaciones laboriosas y la inestabilidad dificultaron su aplicación en entornos complejos como los campos de batalla. Russel et al. [31] detectó IL-6 en 2,5 min con inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL). Sin embargo, difícilmente puede permitir un diagnóstico clasificatorio debido a su limitación de un solo biomarcador y baja sensibilidad. Zupančič et al. [32] describieron una plataforma de sensores electroquímicos de bajo costo para detectar simultáneamente múltiples biomarcadores de sepsis en sangre total. Incorporaron un recubrimiento nanocompuesto hecho de albúmina sérica bovina reticulada para evitar la bioincrustación y mantener la electroconductividad. Es una plataforma potencial para integrar la detección de los tres biomarcadores en un sistema de sensor.

Aquí, desarrollamos una plataforma de detección multiplexada asistida por chip microfluídico (WMC) en forma de onda (WMC-MDP) para PCR, PCT e IL-6 junto con un micromezclador, quimioluminiscencia (CL) y estreptavidina-biotina (SA-B ) sistema. WMC-MDP tiene una estructura tipo sándwich. WMC consta de una capa de canal arriba, una capa base debajo y una capa de detección en el medio. Premezcla de antígenos y anticuerpos de detección en micromezcladores. Premix simplifica los pasos de incubación y lavado y reduce el tiempo de detección con optimización y pretratamiento. El sistema SA-B amplifica la señal de IL-6 para superar el problema de la gran brecha de contenido entre los biomarcadores. Leemos la intensidad de CL del sistema de análisis de imágenes CL y analizamos las concentraciones de biomarcadores. Más allá de eso, WMC-MDP es capaz de realizar un análisis rápido, sólido, preciso y multiplexado de CRP, PCT e IL-6 en el entorno dinámico del campo de batalla para identificar infecciones de manera confiable.

Los polvos de anticuerpos de captura de CRP (CRP-Ab1), PCT (PCT-Ab1), IL-6 (IL-6-Ab1) se obtuvieron de Abcam (Reino Unido). CRP, PCT e IL-6 se adquirieron de Abcam (Reino Unido). Los polvos de anticuerpos de detección de CRP (CRP-Ab2), PCT (PCT-Ab2) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) se adquirieron de Abcam (Reino Unido). Los anticuerpos de detección de IL-6 conjugada con biotina (B-IL-6-Ab2) y HRP conjugada con SA (SA-HRP) se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific (EE. UU.). Los polvos de la fracción V de albúmina sérica bovina (BSA) se adquirieron de Tianjin Kangyuan Biotechnology Co., Ltd. (Tianjin, China). Los anticuerpos de detección utilizan una solución de BSA al 0,05 % para diluir. El pretratamiento de los canales WMC requiere una solución de BSA al 5 %. Se compraron tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Tween-20 de Amresco (EE. UU.) para preparar una solución de PBS 0,01 mol/l (pH 7,4) y una solución de Tween-20 salina tamponada con fosfato (PBST) al 0,5 %. Los anticuerpos y antígenos de captura se diluyen en solución de PBS. Se obtuvieron kits de reactivos de sustrato quimioluminiscente supersensible de Beijing Labgic Technology Co., Ltd. (Beijing, China). El polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente de curado (Sylgard 184) se adquirieron de Dow Corning Inc. (EE. UU.) para preparar chips de microfluidos. La película de silicona (100,0 mm × 100,0 mm × 0,1 mm) utilizada para recubrir los anticuerpos de captura se adquirió de Shanghai Shentong Rubber and Plastic Products Co., Ltd. (Shanghai, China). La resina Lasty-R de SHINING 3D Technology Co., Ltd. (Yangzhou, China) fue el material para la impresión 3D.

Los estudios con participantes humanos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yangzhou (YXYLL-2020-89). Todos los sujetos proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Las pruebas de muestras clínicas incluyeron muestras de 3 individuos sanos y 12 pacientes. Las muestras de suero se almacenaron a -80 °C antes de la detección. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices.

La fabricación de moldes utiliza una impresora 3D Lite 600HD producida por SHINING 3D Technology Co., Ltd. (Yangzhou, China) El horno de secado al vacío DZF-6020A, el secado termostático eléctrico de 202-00 T se obtuvieron de LICHEN-BX Co., Ltd. (Shanghai , Porcelana). SANHOPTT Co., Ltd. (Shenzhen, China) proporcionó el limpiador de plasma PT-10 s. La bomba de jeringa inteligente ISPLab02 fue adquirida de DK INFUSETEK Co., Ltd. (Shanghai, China). El sistema de análisis de imágenes CL se adquirió de BIO-OI Co., Ltd. (Guangzhou, China). La caracterización de microcanales utiliza microscopía metalográfica IMM 3000 de MEGA Instruments Co., Ltd. (Suzhou, China). El espectrofotómetro L5S UV/VIS de INESA Analytical Instrument Co., Ltd. (Shanghai, China) fue para probar la transmitancia.

El diseño de la estructura sándwich de WMC consta de dos partes. Capas dobles de PDMS y una capa de detección. También tiene características adicionales que contienen una válvula y dos soportes. Usamos el software SolidWorks® 2016 para diseñar el modelo tridimensional del WMC.

La capa del canal tiene 68 mm de largo, 37 mm de ancho y 4 mm de espesor en la parte superior de la estructura tipo sándwich. Contiene cuatro depósitos. Cada depósito tiene capacidad para 85 μl de reactivo. Para introducir reactivos y ecualizar la presión, cada depósito se perfora con una ventilación de 1 mm. Los antígenos, los anticuerpos de detección y las enzimas se mezclan mediante un micromezclador en forma de onda. El mezclador consta de cinco unidades semielípticas de 5,0 mm en el eje mayor y 3,0 mm en el eje menor. Cada conexión de unidad tiene un enlace de extremo a extremo. Hay un orificio de válvula entre el micromezclador y el depósito de 8,5 mm de diámetro para conectarlos. Al final del micromezclador en forma de onda, diseñamos canales de detección de tres canales lineales dispuestos en paralelo con un espacio de 3,0 mm. Los canales semicirculares conectan los tres canales lineales con una ventilación de presión negativa de 1,0 mm. Insertamos todas las ventilaciones en tubos flexibles para la inyección de reactivos y la conducción de fluidos. Por lo tanto, permite tanto la presión positiva como la negativa para una conducción fluida. Todos los canales tienen 400 μm de ancho y profundidad con un volumen total de retención de fluido de 20 μl. Una película de silicona de 10,0 mm de largo, 8,0 mm de ancho y 0,1 mm de espesor es la capa de detección recubierta con tiras de anticuerpos de captura entre capas dobles de PDMS. La capa de base inferior de WMC tiene el mismo tamaño y orificio de válvula que la capa de canal mencionada anteriormente. Hay un depósito de desechos diseñado en la capa base para recibir los reactivos de desecho.

El diseño del chip exterior tiene dos placas de soporte con un grosor de 2,0 mm conectadas por pasadores para sostener el chip. Ambas placas de soporte tienen orificios para adaptarse a la válvula mecánica de tipo de traslación (TM) para evitar el fenómeno de oscilación de la válvula TM. La placa de soporte superior consta de otro orificio para exponer el respiradero al depósito. La válvula TM conecta los depósitos necesarios al micromezclador en forma de onda mediante la creación de canales en diferentes alturas. Durante el movimiento de la válvula TM, el depósito conectado no depende de la alineación de la salida con el canal correspondiente de la válvula TM.

Para la fabricación de los moldes de doble capa de PDMS y piezas auxiliares utilizamos una impresora 3D para fabricar [33, 34] (Archivo adicional 1: Fig. S1a). Los moldes están hechos de material de resina resistente a altas temperaturas para evitar la deformación del molde que ocurre debido a la alta temperatura durante el período de curado del PDMS. Las partes auxiliares hechas de material transparente pueden observar el movimiento del fluido convenientemente. Después de imprimir todas las piezas, se lavan en un limpiador ultrasónico con etanol al 99,7 % durante 5 min y se curan en una cámara de curado UV durante 15 min. Rectificamos el molde para obtener una rugosidad superficial de Ra = 1,6 μm. Es propicio para una mayor precisión dimensional y transmitancia. Se rocía aceite brillante sobre la superficie de los moldes para mejorar las formas de los canales. El PDMS y los agentes de curado se mezclan uniformemente en una proporción de peso de 10:1. Se utiliza un horno de secado al vacío para eliminar las burbujas de la mezcla. Luego se vierte en los moldes. El PDMS se cura en el horno de secado termostático eléctrico a 70 °C durante 90 min. Después de desmoldar el PDMS, se completa el logro de la capa de canal y la capa base. El limpiador de plasma rompe el enlace silicio-oxígeno en la superficie y une la capa del canal y la capa base.

Intercalamos la capa de detección entre dos capas de PDMS, tomando las precauciones necesarias para garantizar que las capas dobles de PDMS cubrieran toda la región del canal de detección. Las tiras de anticuerpos de captura en la capa de detección deben estar perpendiculares al canal de detección. Se garantiza una unión segura aplicando la presión adecuada a las capas duales de PDMS. Para acomodar las capas de PDMS unidas, se construyen dos placas de sujeción con pasadores. Para facilitar la adición de muestras y la conducción de fluidos en el WMC, se utiliza una válvula TM en los orificios de las válvulas. Se utilizan tubos flexibles de longitud adecuada en todas las ventilaciones para conectar con la bomba. Finalmente, se logra el montaje de WMC-MDP (Archivo adicional 1: Fig. S1b).

Los tres canales de nuestro diseño de chip microfluídico son capaces de recubrir la lámina de silicona con anticuerpos de captura. Los canales tienen 400 μm de ancho y profundidad, también son paralelos y están espaciados a intervalos de 3 mm. La película de silicona se corta a las dimensiones del diseño y se coloca a lo largo (Archivo adicional 1: Fig. S2a). CRP-Ab1, PCT-Ab1, IL-6-Ab1 se inyectan en los canales respectivamente, seguido de un período de reposo de 20 minutos (Archivo adicional 1: Fig. S2b). Después de eso, el búfer PBST se inyecta tres veces en cada canal para eliminar los anticuerpos de captura sin recubrimiento (Archivo adicional 1: Fig. S2c). Finalmente, se retira el chip y la capa de detección se recubre con anticuerpos capturados (Archivo adicional 1: Fig. S2d).

Luego agregamos 50 μl de solución de BSA al 5 % a cualquier depósito presionando la válvula TM a la altura adecuada en el WMC-MDP completo. La presión positiva se utiliza para forzar los reactivos a través de las ventilaciones del depósito, mientras que la presión negativa se utiliza para impulsarlos a través de la ventilación de presión negativa. Después de llenar completamente todos los canales con solución BSA, WMC-MDP se deja inactivo durante 30 minutos para minimizar la adsorción de proteínas no específicas. Además, la adición de la solución BSA sirve como medida de control de calidad. Si se derrama líquido durante el procedimiento de adición, la calidad del chip se ve comprometida (Archivo adicional 1: Fig. S3).

Los pasos básicos de WMC-MDP para detectar CRP, PCT e IL-6 incluyen preprocesamiento, premezclado y lectura de señales. El pretratamiento implica recubrir la capa de detección con tiras de anticuerpos capturados y modificar la superficie de los canales. El propósito de la mezcla previa es mezclar los antígenos con anticuerpos para la detección antes de realizar una reacción inmunitaria. La mezcla previa de antígenos y anticuerpos en un micromezclador puede eliminar la necesidad de incubación y lavado, ahorrando la mitad del tiempo de detección. La reacción de HRP con sustrato de Luminol-H2O2 deconstruye H2O2 en un radical libre de oxígeno, que es catalizado por HRP y oxida el luminol para producir señales CL. Las concentraciones de CRP y PCT son altas en el suero y pueden detectarse directamente mediante anticuerpos conjugados con HRP. Sin embargo, debido a la baja concentración de IL-6 en el suero, necesitamos introducir un sistema de amplificación de señal. Utilizamos el sistema SA-B para detectar IL-6 mediante la conjugación de biotina con anticuerpos y estreptavidina con HRP. Las preparaciones de los dos conjugados son procesos maduros y comerciales. Un sistema automático lee las señales CL y analiza la imagen CL.

El micromezclador es una estructura confiable integrada con un chip microfluídico [35,36,37]. La eficacia del micromezclador se basa en la mezcla uniforme de proteínas en las muestras. Es un requisito previo esencial para que WMC-MDP reduzca el tiempo de detección mediante premezclado. Utilizamos el software COMSOL Multiphysics 5.6 para simular la condición de mezcla en el modelo tridimensional del micromezclador en forma de onda y explorar el efecto de mezclar reactivos en el micromezclador en forma de onda. El juicio no se basa en los cambios de movimiento de una proteína individual, por lo que no es necesario considerar aspectos biomecánicos. Impulsado por la bomba, el fluido en WMC-MDP se mueve en números de Reynolds (Re) de 0,4 (Fig. 1a), 4 (Fig. 1b) y 40 (Fig. 1c). Para investigar si dos tipos de líquido podrían transformarse en un líquido homogéneo, mezclamos líquido con una concentración de 0 mol/l y 1 mol/l en el micromezclador en forma de onda. Para cuantificar el impacto de la mezcla, evaluamos la eficiencia de la mezcla utilizando la siguiente fórmula.

Simulación del efecto de mezcla de un micromezclador en forma de onda bajo diferentes Re utilizando el software COMSOL. a Cuando el Re era 0,4, la eficiencia de mezcla en la salida era 0,99606. b Nuevamente con el Re de 4 la eficiencia de mezcla en la salida fue 0.99874. c Bajo el Re de 40 la eficiencia de mezclado en la salida observada fue 0.99999. Número de Re Reynolds

donde \(c\) es la concentración del líquido, \(\overline{c}\) es la concentración promedio, \(\Gamma\) es la concentración que medimos desde el plano de salida, \(A\) es la área del plano de salida.

Cuando Re es 0,4, 4, 40, la eficiencia de mezcla resultante es 0,99606, 0,99874 y 0,99999, respectivamente. WMC-MDP es capaz de premezclas efectivas en una amplia gama de Re, y puede satisfacer los requisitos desde operaciones manuales hasta automatización instrumental.

El tamaño exacto es la base para garantizar el funcionamiento normal del micromezclador, el movimiento suave del fluido y la sensibilidad de detección. El molde impreso en 3D es una tecnología emergente en la fabricación de chips microfluídicos [38]. Para verificar la confiabilidad de la fabricación de moldes WMC cuando se usa tecnología de impresión 3D, usamos microscopía para medir las dimensiones de los canales en el WMC. La desviación dimensional de los canales rectos y curvos en la capa del canal (Fig. 2a–c), el canal en la válvula TM (Fig. 2d) está dentro del 2%. Demuestra que el WMC fabricado con impresión 3D tiene una precisión de fabricación extremadamente alta y puede cumplir con los requisitos de la producción en masa.

Dimensiones de canales en componentes WMC. Se investiga una parte longitudinal de microcanales WMC con el ancho de diseño de 400 μm y se caracteriza, y el ancho real es de 395.37 μm con una desviación dimensional de 1.16%. b El canal curvo de WMC también se mide de acuerdo con el diseño de ancho de 400 μm. Pero el ancho real es 405,41 μm y la desviación dimensional es 1,35%. c La profundidad del canal en WMC tiene una altura de diseño de 400 μm. Pero en realidad, la altura es de 407,25 μm con una desviación dimensional del 1,81%. d En comparación con el ancho de diseño de 400 μm de los canales en la válvula TM, tiene 402,73 μm y 403,35 μm. Aquí la desviación dimensional media es 0,61%. Chip de microfluidos en forma de onda WMC, válvula mecánica de tipo traductor de válvula TM

Además de la precisión dimensional, la transmitancia es otro criterio para evaluar la fabricación de chips. Para observar el movimiento del fluido en el chip y detectar la intensidad de CL, examinamos la transmitancia de WMC en la región visible (380–720 nm) (Archivo adicional 1: Fig. S4). Los resultados mostraron que la transmitancia promedio de WMC en la región visible es 85.97%. En la condición óptima para detectar la intensidad CL (425 nm) [39], la transmitancia de WMC es 86,04%. En comparación con el 95 % de transmisión de PDMS, la transmisión de luz de WMC no disminuye significativamente y cumple con los requisitos de observación y detección.

Recubrimos anticuerpos con diferentes concentraciones para optimizar las concentraciones de anticuerpos para capturar CRP, PCT e IL-6 en la capa de detección. Investigamos CRP-Ab1 y PCT-Ab1 de 10, 20, 40, 60, 80 μg/ml (Archivo adicional 1: Fig. S5a yb), IL-6-Ab1 de 20, 40, 60, 80, 120 μg /ml para recubrimiento (Archivo adicional 1: Fig. S5c). Las concentraciones de CRP-Ab2, PCT-Ab2 y B-IL-6-Ab2 fueron todas de 75 μg/ml. La concentración de SA-HRP fue de 4 µg/ml. Las otras condiciones experimentales son consistentes. Inicialmente, la intensidad de CL se correlaciona positivamente con la concentración de anticuerpos de captura. Cuando las concentraciones de anticuerpos de captura aumentan hasta cierto punto, el aumento de la intensidad de CL se vuelve discreto. La intensidad de CL incluso disminuye cuando las concentraciones de anticuerpos de captura están en niveles elevados. Las condiciones óptimas para capturar CRP-Ab1, PCT-Ab1, IL-6-Ab1 son 40, 60 y 80 μg/ml. Utilizamos las concentraciones óptimas para el recubrimiento.

Los anticuerpos de detección con concentraciones de 6,25, 12,5, 25, 50 y 75 μg/ml se utilizan para investigar las condiciones óptimas para detectar PCR (archivo adicional 1: Fig. S6a), mientras que los anticuerpos de detección con concentraciones de 12,5, 25, Se utilizan 50, 75, 100 μg/ml para detectar PCT y B-IL-6 (Archivo adicional 1: Fig. S6b y c). La intensidad de CL se mejora al aumentar la concentración de anticuerpos de detección hasta que alcanza una meseta. Por lo tanto, elegimos 25 μg/ml de CRP-Ab2, 50 μg/ml de PCT-Ab2 y B-IL-6-Ab2 como la concentración óptima.

Utilizamos una bomba peristáltica de presión negativa para impulsar el fluido. Primero, conectamos la bomba al respiradero de presión negativa. Luego se agregan 30 μl de la muestra, 40 μl de la solución mixta (anticuerpo de detección y SA-HRP), 70 μl de PBST y 35 μl del sustrato en los cuatro reservorios, respectivamente (Fig. 3a). Los pasos para la detección incluyen: (1) Presionar la válvula TM a la altura adecuada para garantizar que la muestra y los anticuerpos de detección con la solución SA-HRP puedan ingresar al micromezclador en forma de onda, (2) Bombear la solución mezclada al canal de reacción, (3 ) Colocar la válvula TM presionándola a la siguiente altura para bombear soluciones PBST en el canal de detección para eliminar los reactivos que no reaccionaron (Fig. 3d), (4) Bombear sustrato CL en el canal de detección para reaccionar con HRP después de presionar la válvula TM en el última altura. En el micromezclador, los reactivos pueden mezclarse uniformemente y reaccionar inicialmente (Fig. 3b). En el segundo paso, las soluciones se incuban durante 20 min para generar una inmunorreacción, formando una estructura sándwich de anticuerpos dobles. (Figura 3c). Finalmente, las tiras de anticuerpos de captura y los canales de detección se cruzan para formar puntos de detección de 3 × 3. Obtuvimos la intensidad de CL mediante el sistema de análisis de imágenes CL y utilizamos el software GEL-PRO Analyzer para el análisis posterior (Fig. 3e). Todo el proceso dura 22 min.

Diagrama esquemático para la detección múltiplex de CRP, PCT e IL-6 usando WMC-MDP. a Antes de la detección, el pretratamiento incluye el recubrimiento de tiras de anticuerpos de captura, la preparación de la superficie de los canales y la adición de reactivos. b Premezclado de muestras con anticuerpos de detección en un micromezclador en forma de onda. c El inmunoensayo tipo sándwich se produce en los canales detectados y forma estructuras de Ab1-CRP-Ab2-HRP, Ab1-PCT-Ab2-HRP y Ab1-IL-6-Ab2-B-SA-HRP. d Eliminación de reactivos que no reaccionaron mediante canales de lavado. e Adición de sustrato CL en los canales para producir intensidad CL. Proteína reactiva CRP, PCT procalcitonina, IL-6 interleucina-6, plataforma de detección multiplexada asistida por chip de microfluidos en forma de onda WMC-MDP, solución salina tamponada con fosfato PBST tween-20, quimioluminiscencia CL, albúmina sérica bovina BSA, anticuerpos de captura CRP-Ab1 de proteína c reactiva, PCT-Ab1 capturan anticuerpos de procalcitonina, IL-6-Ab1 capturan anticuerpos de interleucina-6, CRP-Ab2 detectan anticuerpos de proteína c reactiva, PCT-Ab2 detectan anticuerpos de procalcitonina, B-IL-6 -Anticuerpos de detección Ab2 de interleucina-6 conjugada con biotina, peroxidasa de rábano picante HRP, peroxidasa de rábano picante SA-HRP conjugada con estreptavidina

El rango lineal, el límite de detección (LOD) y la selectividad pueden evaluar el rendimiento de detección de WMC-MDP. En condiciones óptimas, detectamos PCR con un rango de 0,16 a 80 μg/ml, PCT con un rango de 0,1 a 51,2 ng/ml e IL-6 con un rango de 12,5 a 6400 pg/ml (Fig. 4a, b). Los rangos lineales son 1,25–40 μg/ml para PCR (\(Y = - 105726,34 + 18258,99X\); \(R^{2} = 0,99\)), 0,4–12,8 ng/ml para PCT (\(Y = - 57834,93 + 24184,26X\); \(R^{2} = 0,99\)). 50-1600 pg/ml para IL-6 (\(Y = - 30857,38 + 19426,37X\); \(R^{2} = 0,97\)) (Fig. 4c). Los rangos lineales cubren los valores de corte de los tres biomarcadores. \(LOD = 3S/M\), mientras que S es la desviación estándar de las muestras en blanco y M es la pendiente de la curva lineal. Los LOD de CRP, PCT e IL-6 son 0,54 μg/ml, 0,11 ng/ml y 16,25 pg/ml, respectivamente. Dado que los LOD son mucho más bajos que los valores de corte, la sensibilidad de los tres biomarcadores puede satisfacer las necesidades de POCT.

La intensidad de CL se obtiene a partir de la detección múltiplex de CRP, PCT e IL-6 usando WMC-MDP para construir el rango de detección, el rango lineal y la selectividad. Imágenes CL de CRP, PCT e IL-6 en el rango lineal en varias concentraciones. El escaneo muestra CRP en la esquina superior izquierda, PCT en el medio e IL-6 en la esquina inferior. b Rango de detección de PCR, PCT e IL-6. c Rango de revestimiento de CRP, PCT e IL-6. d Imágenes CL de PCR, PCT e IL-6 en diferentes combinaciones. Quimioluminiscencia CL, proteína C reactiva CRP, PCT procalcitonina, IL-6 interleucina-6, plataforma de detección multiplexada asistida por chip microfluídico en forma de onda WMC-MDP

La ausencia de reacciones cruzadas es la premisa para realizar la detección multiplexada de los tres biomarcadores. Detectamos todas las combinaciones de CRP, PCT e IL-6 para observar si marcarían una diferencia (Fig. 4d). El proceso de detección es consistente excepto por las diferentes combinaciones de muestras en el reservorio. Las concentraciones de PCR, PCT e IL-6 son de 10 μg/ml, 0,8 ng/ml y 100 pg/ml. Los resultados muestran que las señales CL solo pueden aparecer cuando los anticuerpos capturados correspondientes están recubiertos. Las diferentes combinaciones de biomarcadores no afectan la intensidad de CL de los puntos de detección. Indica que no se generaron reacciones cruzadas y que WMC-MDP es capaz de detección multiplexada de biomarcadores infecciosos.

La reproducibilidad también es un índice importante para evaluar la capacidad de detección del WMC-MDP. Usamos diez piezas de WMC producidas del mismo lote para detectar la misma muestra. Las concentraciones de PCR, PCT e IL-6 en las muestras son de 10 μg/ml, 0,8 ng/ml y 100 pg/ml. Los resultados muestran que los coeficientes de variación (CV) para CRP, PCT e IL-6 son 5,24 % (archivo adicional 1: Fig. S7a), 5,02 % y 6,12 %, respectivamente (archivo adicional 1: Fig. S7b y c). Todos los CV son inferiores al 10%, lo que indica que la reproducibilidad de WMC-MDP es compatible para la aplicación POCT. La fabricación precisa del WMC y la optimización de las condiciones experimentales aseguran una reproducibilidad óptima.

Para satisfacer las demandas de POCT y comercialización, WMC-MDP debe tener una excelente estabilidad de almacenamiento. Investigamos la capacidad de detección de WMC-MDP después de almacenar durante 1 a 7 días a una temperatura de 4 °C y una presión de 101 kPa. Las concentraciones de CRP, PCT e IL-6 a detectar son 10 μg/ml, 0,8 ng/ml y 100 pg/ml respectivamente. Las señales no muestran una disminución clara en el WMC-MDP para detectar las mismas concentraciones de muestras. Los CV de PCR, PCT e IL-6 son 6,33 %, 5,77 % y 6,64 %, respectivamente, menos del 15 % (Archivo adicional 1: Fig. S8). Indica que WMC-MDP puede almacenar los reactivos de forma estable.

Detectamos 15 muestras de suero para verificar la capacidad de WMC-MDP en el diagnóstico clínico y comparamos los resultados con kits ELISA comerciales. La justificación destaca el potencial de WMC-MDP en aplicaciones prácticas. Los resultados de WMC-MDP son muy consistentes con los kits ELISA comercializados (CRP, \(R^{2} = 0.93\); PCT, \(R^{2} = 0.94\); IL-6, \(R^ {2} = 0.98\)) (Fig. 5a–f). Los resultados de las muestras de 3 voluntarios sanos y 12 voluntarios enfermos son consistentes con los resultados del diagnóstico clínico.

Comparación y análisis de datos de detección de CRP, PCT e IL-6 en muestras clínicas entre WMC-MDP y kits ELISA comerciales. ayb Comparación de los kits WMC-MDP y ELISA para la detección de PCR. c y d Comparación de los kits WMC y ELISA para la detección de PCT. e y f Comparación de los kits WMC-MDP y ELISA para la detección de IL-6. g Análisis de PCR, PCT, IL-6 en muestras clínicas detectadas por WMC-MDP, sin transformación logarítmica a 0. h Diagrama de caja y bigotes de PCR, PCT e IL-6 en 12 pacientes con infección. Proteína C reactiva CRP, PCT procalcitonina, IL-6 interleucina-6, chip microfluídico en forma de onda WMC, plataforma de detección multiplexada asistida por chip microfluídico en forma de onda WMC-MDP, chip microfluídico en forma de onda WMC-CL que utiliza quimioluminiscencia, sin transformación logarítmica en 0

Los valores de corte preestablecidos y uniformes razonables facilitan el análisis de muestras clínicas. Utilizamos valores de corte de 8 μg/ml, 0,5 ng/ml y 75 pg/ml para PCR, PCT e IL-6, respectivamente. Para visualizar los cambios de los biomarcadores, utilizamos el aumento de veces de ellos en comparación con el valor de corte para mostrar el contenido de los biomarcadores (Fig. 5g). Desde la perspectiva de los pacientes No. 9 y No. 15, solo el nivel de IL-6 en la sangre de los pacientes es superior al valor de corte. Puede deberse a la etapa temprana de la infección. Los niveles de CRP en la sangre comienzan a aumentar después de 6 a 8 h de la infección y alcanzan su punto máximo después de 24 a 48 h. Los niveles de PCT aumentan en 2 a 4 h y alcanzan una meseta en 12 a 48 h, mientras que los niveles de IL-6 aumentan rápidamente, pero con una vida media de solo 1 h. Indica que las muestras deben recolectarse poco después de que el paciente se haya infectado para la detección de IL-6. Las bacterias, los virus y otros patógenos pueden causar infecciones. PCT solo es sensible a la infección bacteriana, mientras que CRP no es sensible a este patógeno. Los niveles de IL-6 son altos en el paciente No. 3, mientras que los niveles de PCR están ligeramente elevados y los niveles de PCT son normales. Puede ser causado por otros patógenos, en lugar de una bacteria. El uso de medicamentos también puede provocar una disminución rápida de la PCT, que requiere un diagnóstico adicional de acuerdo con el historial médico del paciente. El paciente número 8 despertó nuestro interés por los niveles elevados de PCR y PCT en sangre y los niveles normales de IL-6. Puede deberse a que la infección del paciente no fue grave y los niveles de IL-6 han disminuido debido a su corta vida media, mientras que PCT y CRP no lo han hecho. El gráfico de caja y patillas muestra que los pacientes infectados también pueden tener un aumento de veces en los niveles de biomarcadores inferior a uno (Fig. 5h). Significa que incluso si una persona está infectada, las concentraciones de ciertos biomarcadores pueden estar dentro del rango normal. De acuerdo con el análisis del caso anterior, es difícil diagnosticar con precisión la infección con un biomarcador individual. Las detecciones multiplexadas de CRP, PCT e IL-6 pueden llenar el área ciega del análisis de un solo biomarcador y diagnosticar con precisión la infección.

El rendimiento general de WMC-MDP es satisfactorio en comparación con las tecnologías maduras existentes. Esto se debe al diseño avanzado y la fabricación precisa de los módulos, incluidos los canales de procesamiento, los micromezcladores, los materiales de la capa de reacción y el almacenamiento de reactivos.

La combinación de la impresión 3D con tecnologías de microfluidos abre una nueva vía para la producción en masa de chips. El ancho de los canales en el WMC-MDP es de 400 μm, lo que muestra una mejor precisión de fabricación que el moldeo por inyección. Sin embargo, el error de fabricación aumenta significativamente cuando el ancho del canal es inferior a 50 μm. Además, el PDMS es difícil de curar en moldes producidos con tecnología de impresión 3D de fotocurado. El aislamiento físico o la modificación de la superficie pueden resolver el problema, pero complican el proceso de fabricación. Los nuevos materiales y las mejoras tecnológicas pueden proporcionar alternativas prometedoras para la fabricación de chips microfluídicos basados ​​en la impresión 3D. Los micromezcladores se han utilizado ampliamente en chips microfluídicos. Se están desarrollando micromezcladores basados ​​en topología para mezclar fluidos en canales más cortos. Sin embargo, la estructura compleja hace que sea difícil de fabricar. Además, difícilmente puede cumplir con los requisitos de mezcla de fluidos en un amplio rango de Re. El diseño razonable de WMC-MDP hace que el micromezclador en forma de onda ocupe un espacio mínimo. Permite que el WMC-MDP sea portátil mientras se adapta a entornos de campo de batalla complejos.

Aunque acortamos el tiempo de incubación, la sensibilidad no se ve afectada, debido a la buena capacidad de adsorción de la capa de reacción. En lugar de la película de aluminio comúnmente utilizada, elegimos una película de silicona como material de la capa de reacción. En comparación con la película de aluminio, la capacidad de adsorción de la película de silicio sobre la proteína mejora considerablemente. Con fuerte adsorción y buena plasticidad, la película de silicona es capaz de amplificar las señales de detección. Para los chips de microfluidos, el almacenamiento de reactivos ha sido uno de los problemas más desafiantes. Aunque WMC-MDP puede mantener el reactivo a 4 °C durante más de 7 días, aún queda un largo camino para que el método sea adecuado para el uso en el mercado. Puede aliviarse utilizando nuevas técnicas de liofilización o mejorando la estructura de los reservorios. .

Comparamos la capacidad de detección multiplexada, así como la operación, el tiempo, el costo y el LOD de detección basados ​​en WMC-MDP con métodos de detección convencionales (Tabla 1). En comparación con los kits ELISA, el inmunoensayo de fluorescencia y el inmunoensayo ECL, WMC-MDP demuestra un mejor rendimiento en cuanto a operación, tiempo y costo. Aunque el LOD de IL-6 es más alto que el inmunoensayo de fluorescencia y el inmunoensayo ECL, aún cumple con los requisitos para diagnosticar enfermedades infecciosas. Además, WMC-MDP puede realizar la detección múltiplex de tres biomarcadores. Tiene importancia práctica en la aplicación clínica. El rendimiento de WMC-MDP en el análisis de muestras clínicas también validó su valor de aplicación en el diagnóstico rápido y la clasificación de infecciones. La rapidez, el bajo costo, la mínima intervención manual y la capacidad de detección multiplexada hacen de WMC-MDP un fuerte candidato para POCT de orientación militar.

En conclusión, para investigar la infección en un escenario militar, desarrollamos un WMC-MDP para detecciones multiplexadas de PCR, PCT e IL-6. La mezcla previa de antígenos y anticuerpos para la detección simplifica los pasos de la reacción y acorta el tiempo de detección. Un proceso fiable de fabricación y la optimización de las condiciones de reacción mejoran la sensibilidad y la especificidad, a la vez que reducen el coste. El pretratamiento simplifica el proceso de operaciones. Las ventajas de rapidez, rentabilidad y facilidad de uso hacen de WMC-MDP una alternativa competitiva a los métodos tradicionales. WMC-MDP proporciona un método factible para la detección de otros patógenos. WMC-MDP es una herramienta prospectiva para la identificación rápida de infecciones y muestra el potencial para desarrollarse en dispositivos POCT militarizados.

Los datos y los materiales utilizados en el estudio actual están todos disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Detección de anticuerpos de IL-6 conjugada con biotina

Albúmina de suero bovino

quimioluminiscencia

Enfermedad del coronavirus 2019

Proteína C-reactiva

Captura anticuerpos de CRP

Detección de anticuerpos de PCR

Coeficientes de variación

Electro-quimioluminiscencia

Hemaglutinina 1 Neuraminidasa 1

Peroxidasa de rábano picante

interleucina-6

Captura anticuerpos de IL-6

Límite de detección

Solución salina tamponada con fosfato

Solución salina tamponada con fosfato tween-20

procalcitonina

Captura anticuerpos de PCT

Anticuerpos de detección de PCT

polidimetilsiloxano

punto de atención

Pruebas en el punto de atención

número de Reynolds

Estreptavidina-biotina

HRP conjugado con SA

Válvula mecánica tipo traslación

Chip de microfluidos en forma de onda

Plataforma de detección multiplexada asistida por chip microfluídico en forma de onda

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Los autores agradecen a SHINING 3D Technology Co., Ltd. (Yangzhou y Hangzhou, China) por brindar soporte técnico en impresión 3D.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81902167, 52075138) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (BK20190872).

Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Yangzhou, Yangzhou, 225127, Jiangsu, China

Bin-Feng Yin, Xin-Hua Wan, Chang-Cheng Qian y ASM Muhtasim Fuad Sohan

Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Pekín, 100005, China

Ming-Zhu Yang

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BFY diseñó el estudio, realizó los experimentos y proporcionó financiación. XHW ejecutó simulaciones, analizó los datos experimentales y redactó el manuscrito. MZY corrigió el método y proporcionó financiación. CCQ editó gráficos y corrigió datos experimentales. ASMMFS revisó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Bin-Feng Yin.

Los estudios con participantes humanos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yangzhou (YXYLL-2020-89). Todos los sujetos proporcionaron su consentimiento informado por escrito.

No aplica.

Los autores declaran que no existen intereses contrapuestos.

Una plataforma de detección multiplexada asistida por chip microfluídico (WMC) en forma de onda real (WMC-MDP). Figura S2. Proceso de recubrimiento de tiras de anticuerpos de captura sobre la capa de detección. Figura S3. La tinta roja fluye en el canal. Ninguna fuga de líquido indica que el chip está calificado. Figura S4. La transmitancia de WMC está en el rango de 380-720 nm. Figura S5. Optimización de anticuerpos de captura en WMC-MDP. Figura S6. Optimización de la detección de anticuerpos en WMC-MDP. Figura S7. Reproducibilidad de PCR, PCT e IL-6. Figura S8. Estabilidad de almacenamiento de PCR, PCT e IL-6.

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Reimpresiones y permisos

Yin, BF., Wan, XH., Yang, MZ. et al. Pruebas en el punto de atención asistidas por chip de microfluidos en forma de onda para un diagnóstico preciso y rápido de infecciones. Militar Med Res 9, 8 (2022). https://doi.org/10.1186/s40779-022-00368-1

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Recibido: 19 Agosto 2021

Aceptado: 26 de enero de 2022

Publicado: 11 febrero 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-022-00368-1

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