Un nuevo sistema de virus inactivados (InViS) para una evaluación rápida y económica de la desintegración viral

Oct 23, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 11583 (2022) Citar este artículo

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La pandemia de COVID-19 ha despertado un interés considerable en todo el mundo por las superficies antivirales y ha habido un aumento espectacular en la investigación y el desarrollo de sistemas de materiales innovadores para reducir la transmisión del virus en los últimos años. Las normas 18.184 y 21.702 de la Organización Internacional de Normalización (ISO) son dos métodos estándar para caracterizar las propiedades antivirales de las superficies porosas y no porosas. Sin embargo, durante los últimos años de la pandemia se identificó la necesidad de una caracterización más rápida y económica del material antiviral. Por lo tanto, se desarrolló un método complementario basado en un sistema de virus inactivado (InViS) para facilitar el desarrollo en etapa temprana de tecnologías antivirales y la vigilancia de la calidad de la producción de materiales antivirales de manera segura y eficiente. El InViS está cargado con un colorante fluorescente autoapagado que produce un aumento medible de la fluorescencia cuando se desintegra la envoltura viral. En el presente trabajo, se demuestra la sensibilidad de InViS a la desintegración viral por agentes antivirales conocidos y se explora su potencial para caracterizar nuevos materiales y superficies. Finalmente, el InViS se usa para determinar el destino de las partículas virales dentro de las capas de las máscaras faciales, lo que lo convierte en una herramienta interesante para apoyar el desarrollo de sistemas de superficie antivirales para aplicaciones técnicas y médicas.

Lo que comenzó como una enfermedad pulmonar misteriosa y desconocida en Wuhan en diciembre de 2019 se ha convertido en una grave pandemia similar a la "gripe española": COVID-19. El desencadenante es el beta-coronavirus SARS-CoV-2, que es responsable de diversos síntomas como inflamación de garganta y vías respiratorias, tos, dificultad para respirar, fatiga, fiebre, mialgia, conjuntivitis, pérdida del olfato y alteración del gusto. En casos graves, puede provocar insuficiencia pulmonar aguda, insuficiencia multiorgánica y muerte1.

A junio de 2022, el número de casos confirmados de COVID-19 en todo el mundo alcanzó los 529 millones y el número de muertes aumentó a más de 6 millones2. Aunque mientras tanto se han desarrollado vacunas efectivas y mejores estrategias de tratamiento, las nuevas mutaciones altamente contagiosas y las bajas tasas de vacunación en los países pobres continúan llevando los sistemas de salud al límite. Por lo tanto, las intervenciones no farmacéuticas como la reducción de contacto, la higiene y las mascarillas siguen siendo importantes para mantener a raya la propagación del virus3.

El objetivo general de estas medidas es ralentizar la transmisión de enfermedades entre personas. El COVID-19 se propaga principalmente por gotitas respiratorias entre personas que están en contacto cercano entre sí4. Sin embargo, también son posibles otros mecanismos de transmisión de enfermedades. Por ejemplo, la transmisión por aerosol puede ocurrir en interiores, en espacios llenos de gente y mal ventilados, y también es posible contraer la COVID-19 indirectamente al tocar superficies u objetos contaminados con el virus de personas infectadas, seguido de tocarse los ojos, la nariz o la boca (fómites). transmisión) 4. Se ha demostrado que el SARS-CoV-2 es estable desde unas pocas horas hasta días, según la química de la superficie sobre la que se deposita el virus. Por ejemplo, van Doremalen et al. demostró que el SARS-CoV-2 se mantuvo estable en superficies de plástico y acero inoxidable durante varias horas. El virus viable pudo detectarse hasta 72 h después de la aplicación a estas superficies, y la vida media del SARS-CoV-2 se estimó en 5,6 h en acero inoxidable y 6,8 h en plástico5. Por el contrario, no se pudo detectar ningún virus viable en las superficies de cartón después de 24 h, y las superficies de cobre tendieron a inactivar el virus en 4 horas5. Chin et al. confirmó que el SARS-CoV-2 es más estable en superficies lisas e hidrofóbicas. Si bien no se pudo recuperar ningún virus infeccioso de los papeles de impresión y cultivo de tejidos después de 3 h, el virus viable e infeccioso aún estaba presente en superficies lisas tratadas (vidrio y billetes) después de 2 días, en acero inoxidable y plástico después de 4 días y en el exterior hidrofóbico. capa de mascarilla quirúrgica después de 7 días6.

Dado que esta alta estabilidad superficial aumenta el riesgo de infección por frotis, sería muy beneficioso si las partículas de virus que llegan a superficies vulnerables como pantallas táctiles, pomos de puertas, filtros de ventilación, textiles, asientos de trenes o pasamanos pudieran inactivarse inmediatamente sin más procesos de desinfección. Lo mismo se aplica también a las partículas de virus depositadas en las mascarillas, ya que el manejo inadecuado de las mascarillas es un problema común.

Por lo tanto, el desarrollo de materiales antivirales, revestimientos y mascarillas es de enorme importancia no solo para luchar contra el COVID-19, sino también para prevenir pandemias o brotes epidémicos similares en el futuro.

Hay varias formas de desactivar o incluso destruir virus. Los más conocidos son detergentes o soluciones de etanol que desintegran la estructura lipídica y proteica del virus7,8,9,10, radiaciones como la luz ultravioleta con longitud de onda entre 200 y 300 nm (UVC)11,12,13, tratamientos térmicos como el autoclave14 ,15, oxidación16,17 o alta carga superficial positiva18,19. Cuando se desarrollan nuevos materiales antivirales, es crucial investigar y cuantificar su potencial para atrapar, inactivar y/o matar los virus. Actualmente, hay dos normas ISO disponibles, que regulan la medición de la actividad antiviral en plásticos y otras superficies no porosas (ISO 21702) y la determinación de la actividad antiviral de productos textiles (ISO 18184). En ambas normas, el título del virus infeccioso debe determinarse mediante un ensayo de placa o el método de dosis infecciosa de cultivo tisular medio (TCID50). Ambos ensayos requieren trabajar con el virus infeccioso real y se basan en el principio de que los efectos citopáticos causados ​​por el virus pueden evaluarse visiblemente in vitro. Si bien estos ensayos brindan resultados confiables y comparables sobre la actividad antiviral de los materiales, tienen varias desventajas: trabajar con virus reales como, por ejemplo, el SARS-CoV-2 requiere una infraestructura especial (por ejemplo, laboratorios equipados con nivel de bioseguridad 3) y empleados capacitados. Esto impide el uso generalizado de estos análisis en la mayoría de los entornos industriales y de investigación y, en consecuencia, retrasa el rápido desarrollo de nuevos materiales antivirales como se observó durante la actual pandemia de COVID. En consecuencia, se necesitan urgentemente nuevos métodos de caracterización para facilitar la preselección rápida, económica y segura de una gran cantidad de materiales y superficies para detectar posibles propiedades antivirales.

En este trabajo, un sistema de virus de influenza A/Brisbane 59/2007 cargado con octadecilrodamina R18 inactivado (InViS) se explota como sustituto de un virus infeccioso para evaluar la desintegración viral mediante mediciones simples de fluorescencia. Este novedoso sistema de virus permite el estudio de los efectos antivirales de diferentes productos químicos, agentes de limpieza y materiales de una manera sencilla: la fluorescencia aumenta cuando las partículas del virus se desintegran, ya que la sonda fluorescente se apaga automáticamente dentro de la estructura lipídica intacta del virus (Fig. 1) .

InViS, un enfoque fluorescente para detectar la desintegración de la envoltura viral causada por materiales antivirales.

En este estudio, exploramos y definimos las áreas de aplicación, el poder predictivo y las limitaciones de este nuevo InViS como método alternativo de preselección mediante el análisis del efecto de los productos químicos antivirales (70 % de etanol, ácido cítrico), diferentes nanopartículas antivirales (NP) potenciales. y revestimientos superficiales. Además, aprovechamos el uso de InViS para evaluar y cuantificar el destino y la localización de las partículas de virus en las capas de las mascarillas.

La inactivación de virus y la carga con colorante fluorescente20 son procedimientos establecidos que se aplican en la investigación de vacunas. Aquí, exploramos el potencial de dicho virus inactivado en el campo de la caracterización antiviral. El sistema de virus inactivado (InViS) utilizado en este trabajo consiste en una solución de virus de influenza A/Brisbane/2007 marcada con octadecilrodamina (R18) inactivada, cuya fluorescencia aumenta con la ruptura o fusión de la membrana21.

La concentración de virus medida fue de 1,5 × 1013 (± 9,8 × 1010) partículas mL−1 y las partículas de virus exhibieron un tamaño muy homogéneo de 110,6 ± 0,8 nm. La etiqueta fluorescente dentro del virus se autoapagó y la fluorescencia del virus intacto fue solo el 23 % de la que se obtuvo después de la adición del detergente octaetilenglicol monododecil éter (OEG) (Fig. 2A). Las mediciones de dispersión dinámica de la luz (DLS) confirmaron que el detergente dañó las partículas del virus y provocó su desintegración. Mientras que el sistema InViS era monodisperso (índice de polidispersión (PdI) de 0,063 ± 0,023) antes de la administración del detergente, la adición de OEG resultó en una muestra altamente polidispersa (PdI de 0,443 ± 0,048) con picos cada vez más pequeños que probablemente correspondían a fragmentos de virus, y estructuras virales aglomeradas y micelas detergentes (Fig. 2B). Por lo tanto, el sistema InViS podría usarse para evaluar las propiedades de desintegración viral de productos químicos y materiales mediante una lectura de fluorescencia rápida y sencilla. El límite de detección (definido como la concentración de partículas en la que la desintegración viral ya no es detectable por un aumento en la fluorescencia de la respuesta inicial del instrumento) se determinó mediante diluciones en serie y fue de 108 partículas mL−1.

Efecto de OEG en InViS. (A) La intensidad de fluorescencia de InVis se controló continuamente durante 300 s. Después de 280 s, se agregó OEG a la muestra para inducir la desintegración viral y la liberación de la etiqueta fluorescente R18 de la membrana viral. (B) Distribución del tamaño de partículas medida por DLS antes y después de la administración de detergente. El InViS intacto es altamente monodisperso. Cuando entra en contacto con el detergente, el virus se desintegra, dando lugar a varias poblaciones de agregados residuales y un mayor índice de polidispersidad.

Para verificar que InViS no solo es sensible a los detergentes, sino que también puede detectar otros compuestos antivirales conocidos con diferente potencia antiviral, realizamos más experimentos con etanol al 70 % y ácido cítrico (1 M). Ambos productos químicos indujeron un aumento significativo en la intensidad de la señal de fluorescencia (Fig. 3). Sin embargo, el agente antiviral suave ácido cítrico22 (pH 2,95) solo indujo una liberación parcial de la etiqueta R18, mientras que se detectó una liberación casi completa similar al control de detergente positivo tras la adición de etanol al 70 %.

Intensidad de fluorescencia de InViS después de la incubación con ácido cítrico (1 M) y etanol al 70 %. InViS en PBS e InViS tratados con OEG sirvieron como control negativo y positivo, respectivamente. Los resultados representan la media y las desviaciones estándar correspondientes de tres experimentos independientes con dos réplicas cada uno. $p < 0,01, £p < 0,001 en comparación con los controles negativos.

Diferentes estudios han demostrado que varias NP, incluidos el óxido de cobre (CuO), el óxido de zinc (ZnO), el dióxido de titanio (TiO2), el oro (Au), la plata (Ag), el selenio (Se) y el óxido de grafeno (GO) poseen propiedades antivirales23, 24,25,26,27,28,29, sin embargo, los mecanismos de toxicidad subyacentes a menudo no se comprenden por completo. Para investigar si los mecanismos antivirales de estos tipos de NP pueden incluir la desintegración viral, incubamos el InViS con diferentes concentraciones de NP durante 2 y 24 h y medimos las intensidades de fluorescencia para detectar la liberación potencial de la etiqueta R18 fluorescente. Ninguno de los NP investigados pudo destruir la envoltura de InViS, ya que los niveles de fluorescencia no aumentaron y fueron comparables al control negativo (InViS intacto sin NP) (Fig. 4). Al aumentar las concentraciones de NP, hubo incluso una disminución en la intensidad de la fluorescencia en comparación con las muestras de control no tratadas. Aunque las NP se eliminaron por centrifugación antes de las mediciones de fluorescencia para evitar posibles respuestas de interferencia, realizamos más estudios de interferencia, que confirmaron la ausencia de señales de autofluorescencia de NP o efectos no específicos en las mediciones de fluorescencia (datos no mostrados).

Intensidad de fluorescencia después de incubar InViS con NP. Las suspensiones de NP se incubaron durante 2 y 24 h con solución InViS y luego se centrifugaron para eliminar las NP antes de las mediciones de fluorescencia. El control negativo es InViS en PBS (0,4 % v/v) y el control positivo es InViS en PBS (0,4 % v/v) y OEG (1,25 mg mL−1). Los resultados representan la media y las desviaciones estándar correspondientes de al menos tres experimentos independientes con dos réplicas técnicas por experimento. *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 y #p < 0,0001 en comparación con el control negativo.

Después de evaluar el sistema InViS para la detección de efectos antivirales de productos químicos y NP, evaluamos aún más su idoneidad para detectar el potencial antiviral de superficies y recubrimientos. Para obtener una superficie antiviral plana y no porosa, las placas de cultivo celular estériles se recubrieron con una nueva solución de recubrimiento antiviral (número de patente PCT/EP2021/06058030). El InViS se puso en contacto con la superficie recubierta o con la forma líquida de la solución de recubrimiento y se pudo detectar un aumento significativo en la intensidad de la fluorescencia en ambos casos (Fig. 5), lo que indica claramente la desintegración de la cápsula del virus.

Intensidad de fluorescencia de InViS después del contacto con un recubrimiento antiviral. Tanto la forma líquida como la recubierta de una solución de recubrimiento antiviral (número de patente PCT/EP2021/06058030) conducen a un aumento significativo de la fluorescencia, lo que indica la desintegración de la cápsula del virus. Los niveles de fluorescencia del InViS intacto en PBS e InViS incubado con OEG sirvieron como control negativo y positivo, respectivamente. Los resultados representan la mediana y las desviaciones estándar correspondientes de tres experimentos independientes con dos réplicas técnicas. $p < 0,01 y £p < 0,001 en comparación con el control negativo.

Además de detectar la desintegración del virus, planteamos la hipótesis de que el sistema InViS también puede ser adecuado para detectar el destino y la localización de partículas de virus en máscaras faciales y textiles de varias capas, lo cual es información muy valiosa para comprender qué capa(s) necesita(n) exhibir una fuerte actividad antiviral. Utilizamos un sistema de prueba de eficiencia de filtración para exponer máscaras comunitarias textiles, máscaras quirúrgicas y máscaras FFP2 (como se define en el estándar EN149, correspondiente al respirador N95 estándar de EE. UU.) a aerosoles que contienen InViS. A modo de comparación, también se realizaron pruebas de eficiencia de filtración con soluciones salinas, que representa el procedimiento estándar europeo actual (EN13274-7) para evaluar la eficiencia de filtración de los textiles. Después de la prueba de filtración, se separaron las diferentes capas de la máscara y se evaluó la localización de las partículas mediante un microscopio electrónico de barrido (SEM) (sal e InViS; solo máscaras comunitarias textiles) y mediciones de fluorescencia (solo InViS; todos los tipos de máscara).

Se muestran micrografías de la capa exterior tejida (Fig. 6A,A',B) y la capa interna de soplado en fusión (Fig. 6C,C',D,D',F–H) de una máscara comunitaria antes y después de las pruebas de eficiencia de filtración con sal o partículas InViS. Además, se incluyó SEM de InViS en una cuadrícula TEM (Fig. 6E), para facilitar la identificación de partículas virales en las capas de la máscara. Las partículas de InViS aparecieron monodispersas con un tamaño de aproximadamente 100 nm, mientras que los cristales de sal aparecieron más grandes.

Localización de partículas de NaCl e InViS en mascarillas comunitarias textiles tras ensayos de eficacia de filtración. Las micrografías después de la prueba de eficiencia de filtración con NaCl muestran: (A) la capa tejida más externa de una máscara de comunidad textil, (B) un poro de la capa tejida más externa después de la prueba de filtración con partículas de NaCl, (C) la capa interna de filtración por soplado en fusión y ( D) partículas de sal filtradas por la capa interna de filtración por soplado en fusión. (A'–D') representan ampliaciones del cuadrante blanco en (A–D) (excepto C' que es de otra área no visible en C). Las micrografías después de la prueba de eficiencia de filtración con InVIS muestran: (E) imagen SEM de InViS en el portamuestras de rejilla del microscopio electrónico de transmisión (TEM), (F) y (G) la capa interna de filtración por soplado en fusión (los cristales de sal y las partículas de InViS se resaltan con puntas de flecha y flechas, respectivamente). (H) es una fibra de referencia de la capa interior soplada en fusión que no se sometió a experimentos de filtración.

Durante los experimentos de eficiencia de filtración, el aire pasó primero a través de los poros en la capa exterior tejida de las máscaras, donde se observó una acumulación preferencial de partículas de sal cerca de los poros mientras que la mayoría de las fibras de la capa exterior estaban desprovistas de partículas (Fig. 6B). ,B'). No se observaron partículas de InViS en la capa tejida exterior. A continuación, el aire llegó a la capa interior de soplado en fusión, que mostró una acumulación considerable de partículas de sal (Fig. 6D) e InViS (Fig. 6F,G). Para corroborar aún más la localización preferencial de las partículas InViS en la capa interna de soplado en fusión de manera semicuantitativa, se llevaron a cabo mediciones de fluorescencia complementarias. Por lo tanto, las diferentes capas de máscara se trataron con etanol para liberar la rodamina del InViS adsorbido. La intensidad de fluorescencia correspondiente a cada capa para mascarilla quirúrgica, textil y FFP2 se muestra en la Fig. 7A,B. Este lavado resultó en la desintegración de InViS, pero aun así permitió la cuantificación de partículas virales en cada capa ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de partículas virales filtradas.

Intensidad de fluorescencia de las diferentes capas de una mascarilla textil, quirúrgica (A) y FFP2 (B) tras la prueba de eficacia de filtración con InViS. La corriente de aire fluyó de derecha a izquierda (de la capa exterior a la interior). El control de EtOH es solo el valor de fluorescencia de la solución de etanol. Los resultados representan la media y las desviaciones estándar correspondientes de tres experimentos independientes con dos réplicas técnicas. *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 y #p < 0,0001 en comparación con los controles.

La grave pandemia de COVID-19 ha cambiado drásticamente la vida de las personas en los últimos 2,5 años. Las cosas que solían darse por sentadas, como un trabajo regular en la oficina, reunirse con amigos, asistir a eventos culturales y viajar, de repente ya no eran posibles. Los bloqueos obligaron a personas de todo el mundo a quedarse en casa y tuvieron un impacto negativo en la economía. Los sistemas de salud alcanzaron sus límites de capacidad y muchas personas sufrieron o incluso murieron a causa de una enfermedad grave. Para luchar contra la pandemia, muchos investigadores y médicos trabajaron bajo una gran presión para comprender la enfermedad y desarrollar vacunas y opciones de tratamiento eficientes. Paralelamente, la industria textil trabajó intensamente en el desarrollo de mascarillas fáciles de usar, cómodas y eficaces para frenar la transmisión de enfermedades entre personas31.

Pronto, se reconoció que el desarrollo de materiales y superficies antivirales se reconoció como un medio eficaz para frenar la propagación del SARS-CoV-2 y prevenir infecciones por contacto directo. Sin embargo, el desarrollo de materiales antivirales es un proceso intensivo en tiempo y dinero. Uno de los principales problemas fue que las propiedades antivirales de los recubrimientos y materiales recién desarrollados solo podían evaluarse realizando pruebas con el virus real (ISO 21702 e ISO 18184). Esto requería empleados capacitados y una infraestructura especial (por ejemplo, laboratorios equipados con nivel de bioseguridad 3) a los que era difícil acceder para la mayoría de los desarrolladores de materiales y retrasó considerablemente el desarrollo de materiales antivirales innovadores.

Por lo tanto, los métodos de prueba alternativos que son económicos, fáciles y seguros de manejar son muy valiosos para facilitar la preselección rápida de nuevos diseños de materiales antivirales para avanzar en la innovación e identificar rápidamente candidatos prometedores para realizar más pruebas con el virus real. En este estudio, presentamos InViS, un novedoso sistema alternativo de detección de virus que permite una detección rápida, económica y segura de la actividad de desintegración de virus en líquidos, compuestos y materiales mediante simples mediciones de fluorescencia. Utilizamos un virus de influenza A/Brisbane 59/2007 marcado con rodamina-18 inactivado que tiene similitudes estructurales cercanas al SARS-CoV-2, es decir, constituye un virus de ARN envuelto de ~ 100 nm de tamaño con hemaglutinina en su superficie. El virus ha sido inactivado con β-propiolactona, que conserva la estructura antigénica del virus, pero hace que el virus no sea infeccioso debido a la alquilación de las bases de los ácidos nucleicos, la supresión de la replicación del genoma, la inducción de la degradación del genoma y el entrecruzamiento de las proteínas y el genoma32. La característica más interesante de InViS es que la sonda fluorescente se apaga automáticamente dentro de la membrana viral. Como consecuencia, la fluorescencia de InViS aumenta significativamente cuando las partículas del virus se desintegran y liberan el colorante fluorescente.

Se sabe que el etanol puede desintegrar partículas virales por disolución de la membrana lipídica y desnaturalización de proteínas33,34,35. De manera similar, un pH bajo puede provocar la degradación de la membrana36,37,38. Por lo tanto, expusimos InViS a etanol al 70 % y ácido cítrico para probar su sensibilidad frente a líquidos antivirales conocidos. De hecho, ambos productos químicos condujeron a un aumento significativo de la fluorescencia. Cuando las partículas de InViS estuvieron en contacto con la solución de etanol, se produjo la desintegración viral completa en 5 minutos. En el caso de la solución de ácido cítrico, la desintegración viral siguió siendo parcial, lo que indica que el sistema InViS puede proporcionar datos (semi)cuantitativos sobre la desintegración del virus.

Debido a que algunas NP pueden tener propiedades antivirales, se exploran ampliamente para el desarrollo de nuevos materiales y recubrimientos antimicrobianos16,23,39. Por lo tanto, investigamos si Ag, Au, CuO, ZnO, TiO2 y NP de óxido de grafeno pueden desintegrar InViS. Aunque se han descrito efectos antivirales para los tipos de NP investigados, ninguno de los NP probados indujo la desintegración de la envoltura viral incluso después de una exposición prolongada de hasta 24 h. Incluso observamos una ligera disminución en las señales de fluorescencia con el aumento de las concentraciones de NP, lo que podría deberse a la adsorción de partículas y/o la penetración de la superficie de la cápsula viral y la posterior eliminación de la muestra líquida durante el paso de centrifugado. Esto estaría en línea con los resultados publicados por Kim et al., donde se informó una coprecipitación de Au NP y el virus de la influenza A durante la centrifugación24.

Estos resultados para las NP son consistentes con la literatura existente, que sugiere que las actividades antivirales de la mayoría de las NP parecen depender de otros efectos además de la desintegración de la cápsula. Por ejemplo, se demostró que las Ag NP se unen o desnaturalizan la proteína de la cápside viral o inhiben la unión del virus a los receptores celulares, lo que impide la entrada del virus en las células huésped23. Las NP que contienen Cu podrían catalizar la generación de radicales a través de reacciones Fenton o similares a Fenton, oxidando las proteínas de la cápside y, en consecuencia, bloqueando la infección viral en una etapa temprana23. Se ha demostrado que las AuNP oxidan los enlaces disulfuro de la glicoproteína hemaglutinina en la superficie viral, provocando su inactivación y, por lo tanto, impidiendo la fusión de la membrana del virus con las células huésped23. Las NP de TiO2 pueden dañar los lípidos y las glicoproteínas de la envoltura viral40. Las nanoláminas de grafeno pudieron interrumpir las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína y el óxido de grafeno pudo adsorber partículas de virus, evitando así su interacción con la membrana celular.

Con este conocimiento, la mayor limitación de nuestro sistema InViS se hace evidente: la disolución de la membrana no es el único método de inactivación y, por lo tanto, no todos los materiales antivirales se pueden caracterizar con InViS. Sin embargo, muchos materiales antivirales se basan en la desintegración de la envoltura viral. El objetivo de InViS no es reemplazar las pruebas ISO existentes y aprobadas. Más bien, fue diseñado para ofrecer una alternativa simple, económica y segura para evaluar la desintegración viral (que previene el desarrollo potencial de resistencia) en una etapa temprana de investigación y desarrollo. El sistema es especialmente interesante para investigadores y fabricantes que deseen evaluar la eficacia de materiales diseñados para desintegrar la envoltura lipídica. Durante este estudio, evaluamos una solución de recubrimiento antiviral de este tipo (número de patente PCT/EP2021/06058030) con InViS. Informamos un fuerte aumento en la fluorescencia y confirmamos que la solución de recubrimiento resultó en la desintegración viral. Tales pruebas rápidas pueden ser muy beneficiosas en el desarrollo de líquidos y recubrimientos antivirales. Por ejemplo, permiten la detección de una gran cantidad de sustancias, composiciones y concentraciones diferentes para identificar la solución más prometedora para un mayor desarrollo.

Además, el InViS se puede utilizar para detectar el destino y la localización de NP en estructuras multicapa, textiles y mascarillas. Introdujimos InViS en un sistema de eficiencia de filtración, donde se evaluó el desempeño de diferentes tipos de mascarillas. Esto permitió el uso de aerosoles con partículas de virus biológicamente relevantes en lugar de sustancias prescritas por las normas, como la sal o el aceite. Debido a la presencia mixta de cristales de sal y partículas virales, no fue posible medir la eficiencia de filtración directamente del aerosol de virus utilizando el analizador de partículas. No obstante, obtuvimos información importante sobre la acumulación de partículas virales en las diferentes capas de la máscara y la relevancia de utilizar partículas de NaCl como modelo de partículas virales. Las imágenes por SEM de las diferentes capas revelaron que tanto la sal como las partículas de virus se acumularon preferentemente en la capa interna de fusión por soplado, lo que sugiere que los aerosoles de NaCl podrían ser representativos de las partículas de virus a pesar de sus diferentes características en términos de tamaño y forma. No obstante, se podría implementar una adaptación del banco de eficiencia de filtración para realizar pruebas de eficiencia de filtración con InViS. Sería interesante cuantificar la eficiencia de filtración recolectando las partículas virales residuales que pasaron a través de las mascarillas y filtros probados, por ejemplo con un burbujeador que permita recolectar las partículas virales restantes en una solución líquida. Al comparar la fluorescencia residual de las muestras de máscara con las muestras en blanco, se pueden detectar variaciones en la eficiencia de filtración. Esto permitiría una evaluación de la eficiencia de filtración de las máscaras faciales que utilizan partículas de virus y nos acercaría un paso más a la determinación de las propiedades de filtración de los sistemas de filtración médica y técnica contra virus reales en un escenario de exposición más relevante.

En conclusión, informamos el desarrollo de un método novedoso que evalúa posibles compuestos y superficies antivirales con un sistema de virus inactivado (InViS) para una evaluación rápida, económica y segura de la desintegración del virus mediante mediciones de fluorescencia simples. InViS se puede utilizar para estudiar el destino y la localización de partículas virales en materiales no porosos y porosos, como textiles técnicos y médicos, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para apoyar el desarrollo de nuevos materiales antivirales, recubrimientos y mascarillas.

La solución monovalente del virus de la influenza A/Brisbane/59/2007 (H1N1) químicamente inactivada y purificada en grado GMP se obtuvo de Seqirus (Melbourne, Australia) con hemaglutinina (HA) (1,6 mg ml-1) determinada mediante ensayo de inmunodifusión radial simple, SRID. El perclorato de éster octadecílico de rodamina B (R18) se adquirió de Merck KGaA (Países Bajos) y se disolvió en etanol anhidro de grado HLPC a una concentración final de 10 mM. Se añadió solución de R18 (40 µl) a una solución de influenza (1 ml) gota a gota a temperatura ambiente (RT) con agitación continua a 200 rpm durante 15 min. El R18 no incorporado se eliminó por separación en una columna Sephadex G50 (Merck KGaA). La fracción de volumen vacío se recogió y caracterizó adicionalmente.

El tamaño de las partículas, la distribución del tamaño y la concentración se analizaron mediante análisis de seguimiento de nanopartículas en un instrumento Malvern NanoSight LM10. La muestra se diluyó 1:10.000 en tampón HNE (HEPES (10 mM) pH 7,4, NaCl (142,5 mM), EDTA (5 mM), se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,1 µm antes de su uso) y se inyectó en la cámara de análisis del 405 módulo láser nm con un flujo constante de 70 unidades a una temperatura controlada de 25 °C y un ajuste de viscosidad de 0.975–0976 Cp. Se realizaron 5 capturas, teniendo cada captura una duración de 60 s. La configuración de la cámara era de nivel 15 con un umbral de detección de 3. Se determinaron la fluorescencia y la actividad de fusión de R18 para confirmar la extinción de la fluorescencia y la presencia de HA en la superficie del virus como se describe20,41. Para la fusión de virosomas de influenza con fantasmas de eritrocitos, el medio se acidificó a pH 4,5. La fluorescencia de R18 se midió continuamente a longitudes de onda de excitación y emisión de 560 y 590 nm, respectivamente. Para la calibración de la escala de fluorescencia en los experimentos de fusión, la fluorescencia inicial de las membranas marcadas se ajustó a cero y la fluorescencia a una dilución de sonda infinita al 100 %. Este último valor se obtuvo tras la adición de OEG (Merck KGaA, Países Bajos, concentración final 1 mM). Para confirmar que el virus permaneció intacto después del envío, se realizaron mediciones DLS para determinar el diámetro hidrodinámico de las partículas del virus y su índice de polidispersidad en PBS antes y después de la adición de OEG (Zetasizer Nanoseries, Nano-ZS90, Malvern, Worcestershire, Reino Unido). , 1,25 mg mL−1). Además, las mediciones de fluorescencia del virus diluido en serie con y sin OEG (1,25 mg mL−1, 5 min de tiempo de incubación) se realizaron con un Horiba FluoroMax SpectraFluorometer para establecer el límite de detección.

Se incubaron etanol al 70 % (CAS 64-17-5) y ácido cítrico (1 M; CAS: 77-92-9) con InVis (0,4 % v/v). Las muestras se homogeneizaron con un mezclador vortex y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. Las mediciones de fluorescencia se realizaron utilizando un espectrofluorómetro Horiba FluoroMax. La longitud de onda de excitación fue de 560 nm y los espectros de emisión se midieron entre 580 y 650 nm. Se utilizó una solución InViS en PBS (0,4 % v/v) como control negativo para proporcionar la intensidad de fluorescencia del virus intacto. Como control positivo, se añadió OEG (CAS: 3055-98-9; 2,5 % v/v) para desintegrar el virus e indicar la intensidad de fluorescencia correspondiente.

Para estudiar los posibles efectos antivirales de las NP, utilizamos partículas que se utilizaron y caracterizaron por completo en estudios anteriores. Las propiedades más relevantes de las partículas se resumen en la Tabla 1.

Las partículas disponibles como suspensiones (Ag-COONa, Au-5-COONa) se diluyeron con agua ultrapura hasta una suspensión madre de 1 mg mL-1 y se homogeneizaron con un mezclador vortex (1 min). Las partículas disponibles en forma de polvo (CuO, óxido de grafeno, TiO2 y ZnO) se suspendieron en agua ultrapura hasta obtener una suspensión madre de 1 mg mL−1 utilizando un sonicador de sonda que funcionaba a 230 V/50 Hz (Branson Sonifier 250, Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, EE. UU., diámetro de sonda de 6,5 mm, amplitud máxima de pico a pico de 247 μm) durante 5 min a 13 W.

Se incubaron diferentes concentraciones de partículas (0,1, 1, 10 y 100 µg mL−1) con una solución de InViS en PBS (0,4 % v/v; concentración stock de InVis: 1,5 * 1013 partículas mL−1) durante 2 y 24 h . La incubación se llevó a cabo a TA en la oscuridad y con agitación continua. Las suspensiones se centrifugaron durante 10 min a 4500 × g para eliminar las NP. La fluorescencia de los sobrenadantes se midió con un Horiba FluoroMax SpectraFluorometer. Para cuantificar el efecto antiviral se comparó la fluorescencia con la fluorescencia de una suspensión de virus en PBS (control negativo) y una suspensión de virus tratada con OEG (1,25 mg mL−1; control positivo donde debe liberarse toda la rodamina). Para excluir la autofluorescencia o la extinción de la fluorescencia de las NP, también se midió la fluorescencia de las suspensiones de NP puras (sin virus) y la fluorescencia de las NP incubadas con virus y detergente.

Se utilizó una solución antiviral [número de patente: PCT/EP2021/06058030] para crear un recubrimiento antiviral. En primer lugar, se caracterizaron las propiedades antivirales de la forma líquida con una incubación de 5 min con una solución InViS (0,4 % v/v) y mediciones de fluorescencia. Para caracterizar las propiedades de la forma recubierta, se distribuyó uniformemente un volumen de 0,5 ml en placas de petri desechables y se incubó a TA durante 24 h. Se utilizó como guía para la preparación de muestras la norma ISO 21.702, que cubre la caracterización antiviral de materiales no porosos. El inóculo de virus, 0,4 ml para cada muestra, estaba compuesto por una solución madre de InViS al 20 % v/v en PBS. Se utilizó como control negativo y positivo un inóculo con InViS (20% v/v) en PBS y un inóculo con InViS en PBS (20% v/v) y OEG (62,5 mg mL−1) en placas de Petri vacías, respectivamente. . Se utilizó una película de polímero inerte (polietileno de baja densidad (LDPE)) (40 mm × 40 mm) para cubrir el inóculo. La película se presionó suavemente hacia abajo para formar una estructura de sándwich y maximizar el área de la superficie de contacto entre el inóculo y la muestra antiviral, mientras se evitaba la fuga más allá de los bordes de la película inerte. Las muestras se almacenaron durante 24 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Se agregaron 20 ml de PBS a la placa de Petri y las placas se agitaron para asegurar la homogeneización del PBS recién agregado y el inóculo restante. Después de mezclar, se recogieron 2 ml del lavado y se pipetearon en cubetas transparentes. Los espectros de emisión de fluorescencia del lavado se caracterizaron utilizando el espectrofluorómetro Horiba FluoroMax. La longitud de onda de excitación se fijó en 560 nm y la intensidad de emisión se midió entre 580 y 650 nm. Para cada muestra, se analizaron dos réplicas.

Para evaluar el destino y la localización de InViS y las partículas de sal en las mascarillas, se utilizó la configuración de eficiencia de filtración que se presenta en la Fig. 8. Mediante el uso de un sistema de bomba, se generó un flujo de aire constante de 8 L min-1 a través de la muestra (basado en EN13274-7), imitando el volumen de respiración humana con un esfuerzo físico ligero mientras se mantiene una humedad relativa en el aerosol final de 30 –40% a temperatura ambiente. Se montó una pieza circular de una máscara facial en un portamuestras dentro de una pequeña cámara de contención y las partículas que se difundían a través de la muestra se cuantificaron en tiempo real mediante el uso de un analizador de partículas (Cambustion DMS500). Se alimentó al generador de aerosol (AGK 2000 Palas). Como la solución madre de virus estaba compuesta de virus en PBS, la solución de aerosol contenía 1% v/v de PBS. Por lo tanto, no solo InViS, sino también residuos de PBS estaban presentes en el aerosol.

Descripción esquemática del banco de eficiencia de filtración. La solución de virus o NaCl se colocó en el generador de aerosol. Se generó un flujo de aire constante que contenía partículas virales o de sal a través de la muestra según DIN 14683. La distribución del tamaño de las partículas se midió en el analizador de partículas.

Después de los experimentos de eficiencia de filtración, las capas de la máscara se separaron y analizaron por separado para localizar las partículas InViS. En primer lugar, las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de las capas interna y externa proporcionaron un análisis cualitativo de la presencia de partículas en las fibras de la máscara. Para ello se utilizó un SEM Hitachi S-4800 (Hitachi High-Technologies, Canadá). Antes de la toma de imágenes, las capas de la máscara se montaron en trozos de SEM con una cinta de carbono conductora de doble cara y se recubrieron con 7 nm de oro/paladio (LEICA EM ACE600) para reducir los efectos de carga de electrones. Los ajustes para la formación de imágenes SEM fueron un voltaje de aceleración de 2 kV y un flujo de corriente de 10 µA. En segundo lugar, se evaluó la cantidad de virus en cada capa mediante medidas de fluorescencia. Para esto, las diferentes capas de la máscara se colocaron en 8 mL de etanol al 70% por un período de 2 h. Posteriormente, se pipetearon 2 mL de la solución en cubetas transparentes y se realizaron mediciones de fluorescencia con un Horiba FluoroMax SpectraFluorometer (longitud de onda de excitación 560 nm, espectros de emisión entre 580 y 650 nm).

R se utilizó para cifras y cálculos estadísticos. Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante la prueba t de Student y los siguientes símbolos representan los valores de p correspondientes: *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 y #p < 0,0001.

Los datos que respaldan este estudio se proporcionan previa solicitud razonable a los autores correspondientes.

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Empa, Laboratorios Federales Suizos de Ciencia y Tecnología de Materiales, Laboratorio de Interacciones entre Partículas y Biología, 9014, St. Gallen, Suiza

Lea A. Furer, Pietro Clement, Tina Buerki-Thurnherr y Peter Wick

Empa, Laboratorios Federales Suizos de Ciencia y Tecnología de Materiales, Laboratorio de Membranas y Textiles Biomiméticos, 9014, St. Gallen, Suiza

Gordon Herwig y René M. Rossi

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Farien Bhoelan & Toon Stegmann

Mymetics SA, 1066, Epalinges, Suiza

Mario Amacker

Departamento de Medicina Pulmonar, Hospital Universitario de Berna, Universidad de Berna, 3012, Berna, Suiza

Toon Stegmann

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Correspondencia a Peter Wick.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Furer, LA, Clement, P., Herwig, G. et al. Un nuevo sistema de virus inactivados (InViS) para una evaluación rápida y económica de la desintegración viral. Informe científico 12, 11583 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15471-5

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Recibido: 25 Abril 2022

Aceptado: 24 junio 2022

Publicado: 08 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15471-5

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