Modelo biomimético de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) para emular la fisiología y fisiopatología cardíacas ex vivo

Nov 17, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 934 (2022) Citar este artículo

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Existe la necesidad de un sistema in vitro confiable que pueda replicar con precisión el entorno fisiológico cardíaco para las pruebas de drogas. La disponibilidad limitada de sistemas de cultivo de tejido cardíaco humano ha dado lugar a interpretaciones inexactas de los efectos de los fármacos relacionados con el corazón. Aquí, desarrollamos un modelo de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) que puede estimular electromecánicamente rebanadas de corazón con estiramientos fisiológicos en sístole y diástole durante el ciclo cardíaco. Después de 12 días en cultivo, este enfoque mejoró parcialmente la viabilidad de los cortes de corazón pero no mantuvo completamente su integridad estructural. Por lo tanto, tras el cribado de moléculas pequeñas, encontramos que la incorporación de triyodotironina (T3) 100 nM y dexametasona (Dex) 1 μM en nuestros medios de cultivo preservó la estructura microscópica de los cortes durante 12 días. Cuando se combinó con el tratamiento con T3/Dex, el sistema CTCM mantuvo el perfil transcripcional, la viabilidad, la actividad metabólica y la integridad estructural durante 12 días a los mismos niveles que el tejido cardíaco fresco. Además, estirar demasiado el tejido cardíaco indujo señalización hipertrófica cardíaca en cultivo, lo que proporciona una prueba de concepto de la capacidad del CTCM para emular condiciones hipertróficas inducidas por estiramiento cardíaco. En conclusión, CTCM puede emular la fisiología cardíaca y la fisiopatología en cultivo durante un tiempo prolongado, lo que permite una detección de drogas confiable.

Antes de los estudios clínicos, existe la necesidad de sistemas in vitro fiables que puedan replicar con precisión el entorno fisiológico del corazón humano. Dichos sistemas deben modelar estiramientos mecánicos alterados, frecuencia cardíaca y propiedades electrofisiológicas. Los modelos animales, la plataforma de detección de fisiología cardíaca utilizada con mayor frecuencia, tienen una confiabilidad limitada para reflejar los efectos de los medicamentos observados en los corazones humanos1,2. En última instancia, el modelo de cultivo de tejido cardíaco experimental ideal (CTCM) es el que demuestra una alta sensibilidad y especificidad para diversas intervenciones terapéuticas y farmacológicas mientras reproduce con precisión la fisiología y la fisiopatología del corazón humano3. La falta de un sistema de este tipo ha limitado el descubrimiento de fármacos para nuevos tratamientos para la insuficiencia cardíaca4,5 y ha dado lugar a que la cardiotoxicidad inducida por fármacos sea una de las principales causas de retirada del mercado6.

En la última década, ocho fármacos no cardiovasculares fueron retirados del uso clínico por inducir la prolongación del intervalo QT, resultando en arritmia ventricular y muerte súbita7. Por lo tanto, existe una necesidad creciente de estrategias de detección preclínica confiables para evaluar la eficacia y toxicidad cardiovascular. El cambio reciente hacia el uso de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS-CM) en la detección de drogas y las pruebas de toxicidad ha brindado una solución parcial a este problema; sin embargo, la naturaleza inmadura de los hiPS-CM y la falta de complejidad multicelular del tejido cardíaco son las principales limitaciones de esta tecnología8. Esfuerzos recientes han demostrado que esta limitación se puede superar parcialmente si los hiPS-CM en etapa temprana, poco después del inicio de las contracciones espontáneas, se utilizan para formar hidrogeles de tejido cardíaco y se someten a un aumento gradual de la estimulación eléctrica con el tiempo9. Sin embargo, estos microtejidos hiPS-CMs carecen de las propiedades contráctiles y electrofisiológicas maduras del miocardio humano adulto. Además, el tejido del corazón humano es estructuralmente más complicado, compuesto por una mezcla heterogénea de varios tipos de células, incluidas células endoteliales, neuronas y fibroblastos estromales unidos entre sí con una matriz particular de proteínas de matriz extracelular10. Esta heterogeneidad de la población de células no cardiomiocitos11,12,13 en el corazón de mamíferos adultos es un obstáculo importante en el modelado de tejido cardíaco utilizando tipos de células individuales. Estas importantes limitaciones resaltan la importancia de desarrollar métodos para cultivar tejido miocárdico intacto en condiciones fisiológicas y patológicas9.

Los cortes finos (300 μm) de corazón humano cultivados demuestran ser un modelo prometedor del miocardio humano intacto. Esta tecnología proporciona acceso a un sistema multicelular tridimensional completo similar al tejido del corazón humano. Sin embargo, antes de 2019, el uso de cortes de corazón en cultivo estaba limitado por el corto período de viabilidad en cultivo (24 h)14,15,16. Esto se debe a múltiples factores, incluida la falta de estiramiento mecánico fisiológico, la interfaz aire-líquido y el uso de un medio de cultivo simple que no soporta las demandas del tejido cardíaco. En 2019, varios grupos demostraron que la incorporación de factores mecánicos en los sistemas de cultivo de tejido cardíaco podría prolongar la vida útil del cultivo, mejorar la expresión cardíaca y modelar la patología cardíaca. Dos elegantes estudios17,18 han demostrado la influencia positiva de la carga mecánica uniaxial sobre el fenotipo cardíaco durante el cultivo. Sin embargo, estos estudios no utilizaron la carga mecánica fisiológica tridimensional dinámica del ciclo cardíaco, ya que los cortes cardíacos se cargaron con fuerzas de estiramiento isométricas17 o carga auxotónica lineal18. Estos métodos de estiramiento del tejido dieron como resultado la regulación a la baja de múltiples genes cardíacos o la sobreexpresión de genes relacionados con la respuesta de estiramiento patológica. En particular, Pitoulis et al.19 desarrollaron un baño dinámico de cultivo de cortes de corazón para recrear el ciclo cardíaco mediante la retroalimentación de un transductor de fuerza y ​​un actuador de camilla. Si bien este sistema permitió simular in vitro con mayor precisión el ciclo cardíaco, la complejidad del método y el bajo rendimiento limitan la aplicación del sistema. Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un sistema de cultivo simplificado que utiliza estimulación eléctrica y un medio de cultivo optimizado para mantener viables cortes de tejido cardíaco porcino y humano hasta 6 días20,21.

En el manuscrito actual, utilizando cortes de corazón porcino, describimos un modelo de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) que recapitula los tramos fisiopatológicos y fisiopatológicos cardíacos tridimensionales durante el ciclo cardíaco combinados con señales humorales. Este CTCM tiene el potencial de aumentar la precisión de la predicción preclínica de fármacos a niveles previamente inalcanzables al proporcionar un sistema cardíaco rentable y de rendimiento medio que imita los tramos fisiopatológicos/fisiopatológicos cardíacos de los mamíferos para las pruebas preclínicas de fármacos.

Las señales mecánicas hemodinámicas juegan un papel fundamental en la preservación de la funcionalidad de los cardiomiocitos in vitro22,23,24. En el manuscrito actual, desarrollamos un CTCM (Fig. 1a) que puede emular el entorno cardíaco adulto al inducir estimulación eléctrica y mecánica simultánea a la frecuencia fisiológica (1,2 Hz, 72 latidos por minuto). Para evitar estirar demasiado el tejido durante la fase diastólica, los tejidos se sobredimensionaron en un 25% utilizando un aparato impreso en tres dimensiones (Fig. 1b). La estimulación eléctrica inducida por un sistema C-PACE se sincronizó para iniciarse 100 ms antes de la fase sistólica utilizando un sistema de adquisición de datos para reproducir completamente el ciclo cardíaco. El sistema de cultivo de tejidos utiliza un controlador neumático programable (ingeniería de LB, Alemania) para distender cíclicamente una membrana de silicona flexible que induce el estiramiento de los cortes de corazón en las cámaras superiores. El sistema está conectado a una línea de aire externa con una sonda de presión que permite un ajuste fino de la presión (±1 mmHg) y la temporización (±1 ms) (Fig. 1c).

a Los cortes de tejido se unen a anillos de soporte de 7 mm de diámetro que se muestran en azul dentro de la cámara de cultivo del dispositivo. La cámara de cultivo estaba separada de la cámara de aire por una membrana de silicona delgada y flexible. Entre cada cámara se colocó una junta de estanqueidad para evitar fugas. La cubierta del dispositivo contiene electrodos de grafito que proporcionan estimulación eléctrica. b Ilustración esquemática del aparato de sobredimensionamiento de tejido, guía de anillo y anillo de soporte. Los cortes de tejido (marrón) se colocan en el dispositivo de sobredimensionamiento y la guía anular se coloca en la ranura del borde exterior del aparato. Usando la guía, el anillo de soporte recubierto con pegamento histoacryl se coloca con cuidado en la rebanada de tejido cardíaco. c Un diagrama que representa la sincronización de la estimulación eléctrica en relación con la presión dentro de la cámara de aire controlada por el controlador neumático programable (PPD). Se utilizó un dispositivo de adquisición de datos para sincronizar la estimulación eléctrica utilizando un sensor de sonda de presión. Cuando la presión dentro de la cámara de cultivo alcanza un umbral específico, se envía una señal de impulso al dispositivo C-PACE-EM para inducir la estimulación eléctrica. d Imagen de cuatro dispositivos CTCM instalados en un estante de una incubadora. Estos cuatro dispositivos están conectados a un solo PPD por las líneas aéreas, y se inserta un sensor de presión en una válvula hemostática para monitorear la presión dentro de la línea aérea. Cada dispositivo puede acomodar seis cortes de tejido.

Usando un controlador neumático, podemos operar 4 dispositivos CTCM, cada uno con capacidad para 6 cortes de tejido (Fig. 1d). Dentro del CTCM, las presiones de aire en las cámaras de aire se traducen en presiones sincronizadas en la cámara de líquido y producen un estiramiento fisiológico de las rebanadas del corazón (Fig. 2a y Película complementaria 1). La evaluación del estiramiento del tejido a 80 mmHg dio como resultado un estiramiento del 25% del corte de tejido (Fig. 2b). Se ha demostrado que este porcentaje de estiramiento se corresponde con una longitud fisiológica del sarcómero, de 2,2 a 2,3 μm, para la contractilidad normal de los cortes de corazón17,19,25. Los movimientos de los tejidos se evalúan mediante una configuración de cámara personalizada (Fig. 1 complementaria). La amplitud del movimiento del tejido y la tasa de velocidad (Fig. 2c, d) son consistentes con el estiramiento durante el ciclo cardíaco y el tiempo durante la sístole y la diástole (Fig. 2b). El estiramiento y la velocidad del tejido cardíaco durante la contracción y la relajación permanecieron constantes durante los 12 días de cultivo (Fig. 2e). Para evaluar el efecto de la estimulación eléctrica en la contractilidad durante el cultivo, desarrollamos un método para determinar la cepa viva utilizando el algoritmo Shape from Shading (Figura complementaria 2a, b) y pudimos diferenciar entre la cepa con y sin estimulación eléctrica de la mismos cortes de corazón (Fig. 2f). La tensión con estimulación eléctrica es un 20 % mayor que sin estimulación eléctrica dentro de las regiones móviles de los cortes (R6-9), lo que indica la contribución de la estimulación eléctrica a la función contráctil.

a Rastros representativos de la presión de la cámara de aire, la presión de la cámara de fluido y las mediciones de movimiento del tejido verificaron que la presión de la cámara de aire cambia la presión de la cámara de fluido, lo que induce un movimiento de corte de tejido correspondiente. b Las trazas representativas del porcentaje de estiramiento (azul) de las rebanadas de tejido se corresponden con la tasa de porcentaje de estiramiento (naranja). c El movimiento del corte del corazón medido fue consistente con la velocidad de movimiento medida. ( d ) Traza representativa de los movimientos del ciclo del corte del corazón (línea azul) y la velocidad (línea naranja punteada). e Cuantificación del tiempo de ciclo (n = 19 cortes/grupo de diferentes cerdos), tiempo de contracción (n = 19 cortes/grupo), tiempo de relajación (n = 19 cortes/grupo de diferentes cerdos), movimiento de tejido (n = 25 cortes /grupo de diferentes cerdos), velocidad máxima de contracción (n = 24 (D0), 25 (D12) rebanadas/grupo de diferentes cerdos); y velocidades máximas de relajación (n = 24 (D0), 25 (D12) rebanadas/grupo de diferentes cerdos). Las pruebas t de Student de dos colas no revelaron diferencias significativas en ninguno de los parámetros. f Traza representativa para el análisis de tensión de una rebanada de tejido con estimulación eléctrica (roja) y sin (azul) en diez áreas regionales de la rebanada de tejido de la misma rebanada. El panel inferior muestra la cuantificación de la diferencia porcentual en la tensión de cortes de tejido con y sin estimulación eléctrica en diez áreas regionales de diferentes cortes. (n = 8 cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba t de Student de dos colas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). Las barras de error son representativas de la Media ± DE.

En nuestro anterior sistema biomimético estático de cultivo de cortes de corazón20,21, mantuvimos la viabilidad, la funcionalidad y la integridad estructural de los cortes de corazón durante 6 días con la aplicación de estimulación eléctrica y la composición optimizada del medio de cultivo. Sin embargo, después de 10 días hubo una fuerte caída en estos parámetros. Nos referiremos a los cortes cultivados en nuestro sistema de cultivo biomimético estático anterior20,21 como condición de control (Ctrl), y nos referiremos a los cortes cultivados bajo estimulación mecánica y eléctrica sincronizada (CTCM) usando nuestro medio de cultivo previamente optimizado como condición MC. Primero, determinamos que la estimulación mecánica sin estimulación eléctrica es insuficiente para mantener la viabilidad del tejido durante 6 días (Figuras complementarias 3a, b). Curiosamente, al introducir estímulos fisiológicos mecánicos y eléctricos usando el CTCM, la viabilidad de los cortes de corazón de 12 días se mantuvo similar a los cortes de corazón frescos en la condición MC pero no en la condición Ctrl, como lo muestra el ensayo MTT (Fig. 3a). Esto indica que la estimulación mecánica y la simulación del ciclo cardíaco pueden mantener la viabilidad de las rebanadas de tejido durante el doble del tiempo informado en nuestro sistema de cultivo estático anterior. Sin embargo, la evaluación de la integridad estructural de los cortes de tejido mediante inmunomarcaje para troponina-T cardíaca y conexina 43 demostró que la expresión de conexina 43 del tejido MC del día 12 fue significativamente mayor que el control del mismo día. Aún así, la expresión uniforme de connexin43 y la formación del disco Z no se mantuvo por completo (Fig. 3b). Utilizamos un marco basado en inteligencia artificial (IA) para cuantificar la integridad estructural del tejido26, basado en una canalización de aprendizaje profundo basada en imágenes para la cuantificación automatizada de la integridad estructural de los cortes de corazón en función de la tinción de troponina-T y Connexin 43 en términos de localización. e intensidad fluorescente. Esta técnica utiliza una red neuronal convolucional (CNN) y el marco de aprendizaje profundo para cuantificar de manera confiable la integridad estructural del tejido cardíaco de manera automatizada e imparcial, como se describe en la ref. 26. El tejido MC mostró una similitud estructural mejorada hasta el día 0 en comparación con los cortes de control estáticos. Además, la tinción tricrómica de Masson mostró un porcentaje de área de fibrosis significativamente menor con la condición de MC en comparación con la condición de control en el día 12 de cultivo (Fig. 3c). Si bien el CTCM mejoró la viabilidad de los cortes de tejido cardíaco del día 12 a niveles similares a los del tejido cardíaco fresco, no mejoró significativamente la integridad estructural de los cortes de corazón.

un gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad de MTT de cortes de corazón fresco (D0) o cultivo de cortes de corazón durante 12 días en cultivo estático (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA de una vía; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). b Imágenes de inmunofluorescencia representativas para troponina-T (verde), conexina 43 (rojo) y DAPI (azul) para cortes de corazón recién aislados (D0) o cortes de corazón cultivados durante 12 días en condiciones estáticas (Ctrl) o condiciones CTCM (MC) (Escala desnuda = 100 µm). Cuantificación por inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo cada uno de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). c Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de cortes de corazón teñidos con tinción tricrómica de Masson (Escala desnuda = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo cada uno de un cerdo diferente, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). Las barras de error son representativas de la Media ± DE.

Presumimos que al incorporar moléculas pequeñas en los medios de cultivo, se podría mejorar la integridad de los cardiomiocitos y se podría reducir el desarrollo de fibrosis durante el cultivo de CTCM. Por lo tanto, realizamos un cribado de moléculas pequeñas utilizando nuestro cultivo de control estático20,21 debido al menor número de factores de confusión asociados con él. Para esta selección se seleccionaron dexametasona (Dex), triyodotironina (T3) y SB431542 (SB). Estas pequeñas moléculas se han utilizado previamente en cultivos de hiPSC-CM para inducir la maduración de los cardiomiocitos al mejorar la longitud del sarcómero, los túbulos T y la velocidad de conducción27,28. Además, se sabe que tanto Dex, un glucocorticoide, como SB suprimen la inflamación29,30. Por lo tanto, probamos si la incorporación de una o una combinación de estas pequeñas moléculas mejoraría la integridad estructural de las rebanadas de corazón. Para el cribado inicial, la dosis de cada compuesto se seleccionó en función de la concentración utilizada normalmente en los modelos de cultivo celular (1 μM Dex27, 100 nM T327 y 2,5 μM SB31). Después de 12 días de cultivo, la combinación de T3 y Dex dio como resultado la mejor integridad estructural de los cardiomiocitos y la menor remodelación fibrótica (Figuras complementarias 4 y 5). Además, el uso de la mitad o el doble de estas concentraciones de T3 y Dex tuvo efectos perjudiciales en comparación con las concentraciones normales (Fig. 6a, b complementarias).

Después de la selección inicial, realizamos comparaciones directas de 4 condiciones de cultivo (Fig. 4a); Ctrl: cortes de corazón cultivados en nuestro cultivo estático descrito anteriormente con nuestros medios de cultivo optimizados;20,21 TD: Ctrl con T3 y Dex agregados a los medios de cultivo; MC: cortes de corazón cultivados en CTCM utilizando nuestros medios de cultivo previamente optimizados; y MT: CTCM con T3 y Dex añadidos a los medios de cultivo. Después de 12 días en cultivo, la viabilidad de los tejidos MC y MT se mantuvo similar al tejido fresco según lo evaluado por el ensayo MTT (Fig. 4b). Curiosamente, la adición de T3 y Dex al cultivo transwell (TD) no mejoró significativamente la viabilidad en comparación con la condición Ctrl, lo que implica el papel vital de la estimulación mecánica en el mantenimiento de la viabilidad del corte del corazón.

a Representación esquemática del diseño experimental que representa las cuatro condiciones de cultivo que se usaron para evaluar el efecto de combinar la estimulación mecánica y la adición de T3/Dex a los medios de cultivo en el transcurso de 12 días. b El gráfico de barras muestra la cuantificación de la viabilidad 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón frescos (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD y D12 MT), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en comparación con D0 y **p < 0,01 en comparación con D12 Control). c El gráfico de barras muestra la cuantificación del flujo de glucosa 12 días después del cultivo en las 4 condiciones de cultivo (Ctrl, TD, MC y MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 6 cortes/grupo de diferentes cerdos, unidireccional Se realiza la prueba ANOVA; ###p < 0,001, en comparación con D0 y ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). d Gráfico de análisis de tensión para tejido fresco (azul), día 12 MC (verde) y día 12 MT (rojo) en los diez puntos regionales del corte de tejido (n = 4 cortes/grupo, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ninguna diferencia significativa entre los grupos). e Gráficos de volcán que muestran los genes expresados ​​diferencialmente en cortes de corazón frescos (D0) en comparación con cortes de corazón cultivados en condiciones estáticas (Ctrl) o condiciones MT (MT) durante 10 a 12 días. f Mapa de calor para los genes sarcoméricos para cortes de corazón cultivados en cada condición de cultivo. Las barras de error son representativas de la Media ± DE.

Un cambio en la dependencia metabólica de la oxidación de ácidos grasos a la glucólisis es un sello distintivo de la desdiferenciación de los cardiomiocitos. Los cardiomiocitos inmaduros utilizan principalmente glucosa para la producción de ATP y tienen mitocondrias subdesarrolladas con pocas crestas 5,32. El ensayo de utilización de glucosa demostró que en condiciones de MC y MT, la utilización de glucosa fue similar al tejido del día 0 (Fig. 4c). Sin embargo, las muestras de Ctrl mostraron un aumento significativo en la utilización de glucosa en comparación con el tejido fresco. Esto indica que la combinación de CTCM y T3/Dex mejora la viabilidad del tejido y conserva el fenotipo metabólico de los cortes de corazón cultivados durante 12 días. Además, el análisis de tensión mostró el mantenimiento de los niveles de tensión en las condiciones MT y MC similares al tejido cardíaco fresco durante 12 días (Fig. 4d).

Para analizar el impacto general de CTCM y T3/Dex en el panorama transcripcional global del tejido del corte del corazón, realizamos RNAseq en cortes del corazón de las cuatro condiciones de cultivo diferentes (Datos complementarios 1). Curiosamente, los cortes de MT mostraron una gran similitud transcripcional con el tejido cardíaco fresco, con solo 16 de los 13 642 genes expresados ​​diferencialmente. Sin embargo, como demostramos antes21, los cortes de Ctrl mostraron 1229 genes expresados ​​​​diferencialmente después de 10 a 12 días en cultivo (Fig. 4e). Estos datos fueron validados por qRT-PCR de genes cardíacos y de fibroblastos (Fig. 7a-c complementaria). Curiosamente, los cortes de Ctrl mostraron una regulación a la baja de los genes cardíacos y del ciclo celular y una regulación al alza de los programas de genes inflamatorios. Estos datos indican que la desdiferenciación que normalmente ocurre después de un cultivo a largo plazo se atenuó por completo en la condición MT (Fig. 8a, b complementaria). Un examen más detallado de los genes sarcoméricos reveló que solo las condiciones MT conservaron los genes que codifican los canales sarcoméricos (Fig. 4f) y iónicos (Fig. 9 complementaria) de la regulación negativa observada en las condiciones Ctrl, TD y MC. Estos datos indican que con la combinación de estimulación mecánica y humoral (T3/Dex), el transcriptoma de los cortes de corazón podría mantenerse similar al de los cortes de corazón frescos durante 12 días en cultivo.

Estos hallazgos transcripcionales se confirmaron por el hecho de que la integridad estructural de los cardiomiocitos en cortes de corazón se conservó mejor durante 12 días en la condición MT, como lo demuestra la proteína de unión comunicante intacta y localizada, conexina 43 (Fig. 5a). Además, la fibrosis en cortes de corazón en condición MT se redujo significativamente en comparación con Ctrl y fue similar a los cortes de corazón frescos (Fig. 5b). Estos datos indican que la combinación de estimulación mecánica y tratamiento con T3/Dex conservó eficazmente la estructura cardíaca del corte del corazón durante un tiempo prolongado en cultivo.

a Imágenes representativas de inmunofluorescencia para troponina-T (verde), conexina 43 (roja) y DAPI (azul) para cortes de corazón recién aislados (D0) o cortes de corazón cultivados durante 12 días en las cuatro condiciones de cultivo (barra de escala = 100 µm) . Cuantificación por inteligencia artificial de la integridad estructural del tejido cardíaco (n = 7 (D0 y D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC y D12 MT) rebanadas/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 y *p < 0,05, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Imágenes representativas y cuantificación de cortes de corazón teñidos con tinción tricrómica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD y D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza la prueba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 y ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Las barras de error son representativas de la Media ± DE.

Por último, la capacidad del CTCM para modelar la hipertrofia cardíaca se evaluó aumentando la amplitud de estiramiento del tejido cardíaco. En el CTCM, la presión máxima en la cámara de aire se incrementó de 80 mmHg (estiramiento normal) a 140 mmHg (Fig. 6a). Esto corresponde a un aumento en el estiramiento del 32 % (Fig. 6b), que se ha demostrado previamente que es el porcentaje apropiado de estiramiento necesario para que un corte de corazón alcance una longitud de sarcómero similar a la observada en la hipertrofia17,19,25. El estiramiento y la velocidad del tejido cardíaco durante la contracción y la relajación permanecieron constantes durante los seis días de cultivo (Fig. 6c). Cortes de tejido de corazón de las condiciones MT se sometieron a estiramiento normal (MT (Norma)) o condiciones de sobreestiramiento (MT (OS)) durante seis días. A los cuatro días de cultivo, el biomarcador hipertrófico, NT-ProBNP, aumentó significativamente en los medios de cultivo en condiciones MT (OS) en comparación con las condiciones MT (Norma) (Fig. 7a). Además, después de seis días de cultivo, el tamaño celular en MT (OS) (Fig. 7b) aumentó significativamente en comparación con los cortes de corazón MT (Norma). Además, la translocación nuclear de NFATC4 aumentó significativamente en tejidos demasiado estirados (Fig. 7c). Estos resultados muestran el desarrollo progresivo de la remodelación patológica después del estiramiento excesivo y proporcionan una prueba de concepto de que el dispositivo CTCM se puede utilizar como plataforma para estudiar la señalización de hipertrofia cardíaca inducida por estiramiento.

a Rastros representativos de la presión de la cámara de aire, la presión de la cámara de fluido y las mediciones de movimiento del tejido verificaron que la presión de la cámara de aire cambia la presión de la cámara de fluido, lo que induce un movimiento de corte de tejido correspondiente. b Rastros representativos del porcentaje de estiramiento y la tasa de estiramiento de cortes de tejido estirados normales (naranja) y sobre estirados (azul). c Gráficos de barras que muestran la cuantificación del tiempo del ciclo (n = 19 cortes/grupo de diferentes cerdos), tiempo de contracción (n = 18–19 cortes/grupo de diferentes cerdos), tiempo de relajación (n = 19 cortes/grupo de diferentes cerdos) , amplitud de movimiento del tejido (n = 14 cortes/grupo de diferentes cerdos), velocidad máxima de contracción (n = 14 cortes/grupo de diferentes cerdos) y velocidades máximas de relajación (n = 14 (D0), 15 (D6) cortes/grupo de diferentes cerdos), las pruebas t de Student de dos colas no revelaron diferencias significativas en ninguno de los parámetros, lo que demuestra que estos parámetros se mantuvieron constantes durante 6 días de cultivo de sobreestiramiento. Las barras de error son representativas de la Media ± DE.

a Cuantificación del gráfico de barras de la concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo de cortes de corazón cultivados en condiciones de estiramiento normal (Norma) o sobreestiramiento (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm y D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos, se realiza ANOVA de dos vías; **p < 0,01 en comparación con el estiramiento normal). b Imágenes representativas de cortes de corazón teñidos con troponina-T y WGA (izquierda) y cuantificación del tamaño celular (derecha) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes cerdos, Two- se realiza la prueba t de Student con colas; ****p < 0,0001 en comparación con el estiramiento normal). c Imágenes representativas de cortes de corazón de MTOS de los días 0 y 6 inmunomarcados para troponina-T y NFATC4 y cuantificación de la translocación de NFATC4 a los núcleos de CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes cerdos , se realiza la prueba t de Student de dos colas; *p < 0,05). Las barras de error son representativas de la Media ± DE.

La investigación cardiovascular traslacional requiere modelos celulares capaces de replicar fielmente el medio cardíaco. En este estudio, se desarrolló y caracterizó un dispositivo CTCM que puede estimular cortes cardíacos ultrafinos. El sistema CTCM abarca la estimulación electromecánica sincronizada fisiológica junto con el enriquecimiento humoral con T3 y Dex. Al someter cortes de corazón de cerdo a estos factores, la viabilidad, la integridad estructural, la actividad metabólica y la expresión transcripcional se mantuvieron de manera similar al tejido de corazón fresco durante 12 días en cultivo. Además, estirar demasiado el tejido cardíaco incita a la hipertrofia cardíaca inducida por estiramiento excesivo. En general, estos resultados confirman el papel fundamental de las condiciones de cultivo fisiológico en el mantenimiento de un fenotipo cardíaco normal y proporcionan una plataforma para la detección de fármacos.

Múltiples factores contribuyen al entorno óptimo para la función y supervivencia de los cardiomiocitos. Los más obvios de estos factores están relacionados con (1) interacciones de célula a célula, (2) estimulación electromecánica, (3) factores humorales y (4) sustratos metabólicos. La interacción fisiológica de célula a célula requiere la presencia de intrincadas redes tridimensionales de tipo multicelular soportadas por una matriz extracelular. Esta interacción compleja de células es difícil de recrear in vitro a través del cultivo conjunto de tipos de células individuales, pero se puede lograr fácilmente utilizando la naturaleza organotípica de los cortes de corazón.

El estiramiento mecánico y la estimulación eléctrica de los cardiomiocitos son esenciales para la preservación del fenotipo cardíaco33,34,35. Si bien la estimulación mecánica se ha utilizado ampliamente en el acondicionamiento y la maduración de hiPSC-CM, algunos estudios elegantes han intentado recientemente la estimulación mecánica de cortes de corazón en cultivo utilizando carga uniaxial17,18,19. Estos estudios han demostrado la influencia positiva de la carga mecánica uniaxial 2D sobre el fenotipo cardíaco durante el cultivo. En estos estudios, los cortes de corazón se cargaron con fuerzas de estiramiento isométricas17, carga auxotónica lineal18, o recrearon el ciclo cardíaco utilizando la retroalimentación del transductor de fuerza y ​​un actuador de camilla19. Sin embargo, estos métodos adoptaron el estiramiento uniaxial del tejido sin optimizar las condiciones del medio de cultivo, lo que resultó en la regulación a la baja de múltiples genes cardíacos o la sobreexpresión de genes relacionados con la respuesta de estiramiento patológica. El CTCM descrito aquí proporciona una estimulación electromecánica tridimensional que imita el ciclo cardíaco nativo en términos de duración del ciclo y estiramientos fisiológicos (25 % de estiramiento, 40 % de sístole, 60 % de diástole y 72 latidos por minuto). Si bien esta estimulación mecánica tridimensional por sí sola no fue suficiente para mantener la integridad del tejido, se requirió una combinación de estimulación humoral usando T3/Dex con estimulación mecánica para mantener completamente la viabilidad, funcionalidad e integridad del tejido.

Los factores humorales juegan un papel esencial en la regulación del fenotipo cardíaco adulto. Esto se ha enfatizado en estudios de hiPS-CM que incorporan T3 y Dex en el medio de cultivo para promover la maduración de las células. La T3 puede influir en el transporte de aminoácidos, azúcares y calcio a través de la membrana celular36. Además, T3 promueve la expresión de MHC-α y la regulación a la baja de MHC-β, promoviendo las miofibrillas de contracción rápida que se observan en los cardiomiocitos maduros frente a las miofibrillas de contracción lenta que se observan en los CM fetales37. La falta de T3 en pacientes hipotiroideos puede conducir a la pérdida de la estriación miofibrilar y a una tasa reducida de desarrollo de tensión37. Dex actúa sobre el receptor de glucocorticoides y se ha demostrado que aumenta la contractilidad cardíaca en corazones perfundidos ex vivo;38 se cree que una mejora está relacionada con los efectos sobre la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE)39,40. Además, Dex se une a su receptor; induce una amplia gama de respuestas intracelulares que suprimen la función inmunitaria y la inflamación30.

Nuestros resultados demuestran que la estimulación mecánica fisiológica (MC) mejoró el rendimiento general del cultivo en comparación con Ctrl, pero no puede mantener la viabilidad, la integridad estructural y la expresión cardíaca durante 12 días en cultivo. La incorporación del tratamiento con T3 y Dex en el cultivo CTCM (MT) dio como resultado una viabilidad mejorada en comparación con Ctrl y mantuvo el perfil transcripcional, la integridad estructural y la actividad metabólica similar al tejido cardíaco fresco durante 12 días. Además, se logró un modelo de modelado de hipertrofia cardíaca inducida por sobreestiramiento utilizando el CTCM mediante el control de la extensión del estiramiento del tejido, lo que ilustra la versatilidad del sistema CTCM. Cabe señalar que, aunque la remodelación cardíaca y la fibrosis generalmente involucran un órgano intacto con contribuciones de las células circulantes que pueden proporcionar citocinas relevantes, así como fagocitosis y otros factores de remodelación, los cortes de corazón aún pueden emular el proceso fibrótico en respuesta al estrés y la lesión. diferenciando el fibroblasto residente en miofibroblastos. Esto se evaluó previamente en este modelo de corte de corazón15. Cabe señalar que los parámetros de CTCM se pueden modular para simular muchas condiciones, como taquicardia, bradicardia y soporte circulatorio mecánico (corazón descargado mecánicamente) cambiando las frecuencias y amplitudes eléctricas/de presión. Esto permite que el sistema sea una plataforma de rendimiento medio para pruebas de drogas. La capacidad del CTCM para modelar la hipertrofia cardíaca inducida por sobreestiramiento abre la vía para que este sistema se utilice en pruebas de terapia personalizada. En conclusión, el presente estudio demuestra que los estiramientos mecánicos y la estimulación humoral son esenciales para mantener cortes de tejido cardíaco en cultivo.

Si bien los datos que se muestran aquí indican que el CTCM es una plataforma muy prometedora para modelar el miocardio intacto, existen algunas limitaciones en este método de cultivo. La principal limitación de la cultura CTCM es que aplica una carga mecánica dinámica continua a los cortes, lo que impide la capacidad de monitorear activamente la contracción del corte del corazón durante cada ciclo. Además, debido al pequeño tamaño de los cortes de corazón (7 mm), existe una capacidad limitada para realizar la evaluación de la función contráctil fuera del sistema de cultivo utilizando transductores de fuerza tradicionales. En el manuscrito actual, superamos parcialmente esta limitación mediante la evaluación de la tensión óptica como lectura de la función contráctil; sin embargo, esta limitación necesitará más trabajo y podría abordarse en el futuro mediante la implementación de métodos para monitorear ópticamente la funcionalidad de los cortes de corazón dentro de la cultura, como el mapeo óptico usando calcio y colorantes sensibles al voltaje. Otra limitación del CTCM es que el modelo de trabajo no manipula las presiones fisiológicas (precarga y poscarga). En el CTCM, se induce presión en direcciones opuestas para reproducir los estiramientos fisiológicos durante la diástole (estiramiento de longitud completa) y la sístole (longitud contraída durante la estimulación eléctrica) en un tejido sobredimensionado en un 25 %. Esta limitación debe abordarse en el futuro diseño de CTCM presurizando completamente el tejido cardíaco desde ambos lados y aplicando la relación precisa de presión-volumen que ocurre dentro de las cavidades cardíacas.

La remodelación inducida por estiramiento excesivo informada en este manuscrito se limita a emular solo la señalización hipertrófica de estiramiento excesivo. Por lo tanto, este modelo podría ayudar a estudiar la señalización hipertrófica inducida por estiramiento41,42 sin factores humorales o neuronales (que están ausentes en este sistema). Se necesitan más estudios para agregar multiplexidad al CTCM, como el cocultivo con células inmunitarias, los factores plasmáticos humorales circulantes y la inervación con el cocultivo de células neuronales mejoraría la capacidad de modelado de enfermedades del CTCM.

En el presente estudio se utilizaron trece cerdos. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Louisville. Se pinza el arco aórtico y se perfundieron los corazones con 1 L de solución de cardioplejía estéril (NaCl 110 mM, CaCl2 1,2 mM, KCl 16 mM, MgCl2 16 mM, NaHCO3 10 mM, 5 unidades/ml de heparina, pH a 7,4); los corazones se conservaron en solución cardiopléjica helada hasta que se transportaron al laboratorio en hielo, lo que suele ser <10 min.

Los dispositivos CTCM se diseñaron en el software de diseño asistido por computadora (CAD) de SolidWorks. La cámara de cultivo, la placa de separación y la cámara de aire se fabricaron usando mecanizado CNC (control numérico por computadora) de plástico acrílico transparente. Los anillos de soporte de 7 mm fueron torneados en el centro con plástico de polietileno de alta densidad (HDPE) y equipados con una ranura para juntas tóricas para acomodar juntas tóricas de silicona para sellar los medios debajo. Una fina membrana de silicona separa la cámara de cultivo de la placa de separación. La membrana de silicona se cortó con láser a partir de una lámina de silicona de 0,02'', durómetro 35 A. Las juntas de silicona inferior y superior se cortaron con láser a partir de una lámina de silicona de 1/16'', durómetro 50 A. Tornillos y tornillos de acero inoxidable 316 L Se usaron tuercas de mariposa para mantener unido el dispositivo y crear un sello hermético.

Se diseñó una placa de circuito impreso (PCB) personalizada para integrarse con el sistema C-PACE-EM. Las salidas de cabezales de máquinas suizas en la placa de circuito impreso están conectadas a un electrodo de grafito a través de cables de cobre plateados y tornillos de bronce 0-60 enroscados en los electrodos. La placa de circuito impreso encaja en una cubierta de dispositivo impresa en tres dimensiones.

El dispositivo CTCM está controlado por un controlador neumático programable (PPD) que puede inducir una presión cíclica controlada similar al ciclo cardíaco. A medida que aumenta la presión dentro de la cámara de aire, la membrana de silicona flexible se distenderá hacia arriba, desplazando el medio de cultivo debajo de los cortes de tejido. Los cortes de tejido se estirarán luego por este desplazamiento de líquido, imitando el estiramiento cardíaco fisiológico durante la diástole. En el punto máximo de esta diástole, se aplica estimulación eléctrica a través de los electrodos de grafito y se reduce la presión de la cámara de aire, lo que permite que los cortes de tejido se contraigan. Dentro de la línea de aire, hay una válvula hemostática con un sensor de presión que detecta la presión del sistema de aire. La presión detectada por el sensor de presión se alimenta a un dispositivo de adquisición de datos conectado a una computadora portátil. Esto permite el monitoreo continuo de las presiones dentro de la cámara de aire. Cuando se alcanza la presión máxima de la cámara de aire (80 mmHg para norma y 140 mmHg para OS), se indica al dispositivo de adquisición de datos que envíe una señal al sistema C-PACE-EM que induce una señal de tensión eléctrica bifásica de 2 ms establecida en 4 V .

Se obtuvieron cortes de corazón y se realizaron las condiciones de cultivo de 6 pocillos como se describe a continuación: el corazón recogido se transfiere del recipiente de transferencia a una bandeja que contiene solución de cardioplegia fría (4 °C). El ventrículo izquierdo se aísla utilizando cuchillas estériles y se corta en bloques de 1 a 2 cm3. Estos bloques de tejido se unen a soportes de tejido usando pegamento para tejido y se colocan en el baño de tejido de un micrótomo vibrante que contiene solución de Tyrode con oxigenación continua (3 g/L de 2,3-butanodiona monoxima (BDM), NaCl 140 mM (8,18 g), KCl 6 mM (0,447 g), D-glucosa 10 mM (1,86 g), HEPES 10 mM (2,38 g), MgCl2 1 mM (1 ml de solución 1 M), CaCl2 1,8 mM (1,8 ml de solución 1 M), hasta 1 L de ddH2O). El micrótomo vibrante está configurado para cortar rebanadas de 300 μm a una frecuencia de 80 Hz, una amplitud de vibración horizontal de 2 mm y una velocidad de avance de 0,03 mm/s. El baño de tejido está rodeado de hielo para mantener una solución fría y mantener la temperatura a 4 °C. Los cortes de tejido se transfieren de un baño de micrótomo a un baño de mantenimiento que contiene solución de Tyrode oxigenada continuamente en hielo hasta que se obtienen cortes suficientes para una placa de cultivo. Para condiciones de cultivo transwell, las rebanadas de tejido se adhieren a soportes de poliuretano esterilizado de 6 mm de ancho y se colocan en placas de cultivo de seis pocillos que contienen 6 mL de medio de cultivo optimizado (Medium 199, 1x suplemento ITS, 10% FBS, 5 ng/mL VEGF, 10 ng/mL FGF-básico y 2X Antibiótico-Antimicótico). Se aplicó estimulación eléctrica (10 V, estimulada a 1,2 Hz) a los cortes de tejido a través de las tapas C-Pace. Para las condiciones de TD, se agregaron T3 y Dex frescos a concentraciones de 100 nM y 1 μM en cada cambio de medio. El medio de cultivo se oxigena antes de cada cambio de medio tres veces al día. Los cortes de tejido se cultivaron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2.

Para el cultivo de CTCM, los cortes de tejido se colocaron en un aparato personalizado impreso en tres dimensiones dentro de una placa de Petri que contenía solución de Tyrode modificada. El dispositivo está diseñado para sobredimensionar el corte del corazón en un 25 % del área del anillo de soporte. Esto se hace para garantizar que la porción de corazón no se estire demasiado una vez que se haya transferido de la solución de Tyrode al medio de cultivo y durante la fase diastólica. Usando pegamento histoacryl, las rebanadas de 300 μm de espesor se fijaron a anillos de soporte de 7 mm de diámetro. Una vez que la rebanada de tejido se unió al anillo de soporte, se recortó la rebanada de tejido sobrante y la rebanada de tejido adjunta se volvió a colocar en el baño de solución de Tyrode en hielo (4 ° C) hasta que se prepararon suficientes rebanadas para un dispositivo. El tiempo de procesamiento no debe exceder las 2 h en total para todos los dispositivos. Una vez que se unieron 6 cortes de tejido a sus anillos de soporte, se ensambló el dispositivo CTCM. La cámara de cultivo CTCM se prellenó con 21 ml de medio de cultivo preoxigenado. Los cortes de tejido se transfirieron a la cámara de cultivo y todas las burbujas de aire se eliminaron cuidadosamente con una pipeta. Luego, la rebanada de tejido se guió a un pozo y se presionó suavemente en su lugar. Por último, la cubierta del electrodo se colocó en el dispositivo y el dispositivo se transfirió a una incubadora. A continuación, se conectó el CTCM a los tubos de aire y al sistema C-PACE-EM. Se encendió el controlador neumático y se abrió la válvula de flujo de aire al dispositivo CTCM. El sistema C-PACE-EM se configuró para proporcionar 4 V a 1,2 Hz con estimulación bifásica de 2 ms. El medio de cultivo se cambió dos veces al día y los electrodos se reemplazaron una vez al día para evitar la acumulación de grafito en los electrodos. Si es necesario, los cortes de tejido se pueden retirar de sus pocillos de cultivo para desplazar las burbujas de aire que puedan quedar atrapadas debajo. Para las condiciones de MT, el tratamiento con T3/Dex se añadió fresco con cada cambio de medio a 100 nM T3 y 1 μM Dex. Los dispositivos CTCM se cultivaron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2.

Se desarrolló un sistema de cámara personalizado para obtener un trazado de estiramiento de los cortes de corazón. Se utilizó una cámara DSLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japón) con una lente macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). Después de cambiar los medios con un medio de cultivo fresco, la formación de imágenes se realizó a temperatura ambiente. La cámara se colocó en un ángulo de 51° y los videos se grabaron a 30 fps. En primer lugar, se utilizó un software de código abierto (MUSCLEMOTION43) con Image-J para cuantificar el movimiento de los cortes del corazón. Se creó una máscara utilizando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) para definir la región de interés del corte del corazón que late para evitar cualquier ruido. La máscara segmentada manualmente se aplicó a todas las imágenes en la secuencia de cuadros y luego se alimentó al complemento MUSCLEMOTION. El movimiento MUSCLE utiliza la intensidad de píxel promedio dentro de cada cuadro para cuantificar su movimiento en relación con un cuadro de referencia. Los datos se registraron, filtraron y utilizaron para cuantificar el tiempo del ciclo y evaluar los estiramientos del tejido durante el ciclo cardíaco. El procesamiento posterior de los videos grabados se realizó utilizando un filtro digital de primer orden de fase cero. Para cuantificar el estiramiento del tejido (pico a pico), se realizó un análisis de picos para distinguir los picos y los valles de la señal registrada. Además, se realizó la eliminación de tendencias para eliminar la desviación de la señal utilizando un polinomio de sexto orden. El código de software se desarrolló en MATLAB para detectar el movimiento general del tejido, el tiempo de ciclo, el tiempo de relajación y el tiempo de contracción (código de software complementario 44).

Para el análisis de tensión, utilizando los mismos videos generados para la evaluación del estiramiento mecánico, primero rastreamos las dos imágenes que representan los picos de los movimientos (punto más alto de movimiento (Arriba) y punto más bajo (Abajo)) según el software MUSCLEMOTION. Luego, segmentamos las áreas de tejido y aplicamos la forma del algoritmo de sombreado45 en los tejidos segmentados (Fig. 2a complementaria). Luego, el tejido segmentado se divide en diez subsuperficies y la tensión para cada superficie se calcula utilizando la siguiente ecuación: Deformación = (Sup−Sdown)/Sdown donde Sup y Sdown son distancias de la forma desde el sombreado de los tejidos hacia arriba y hacia abajo. , respectivamente (Fig. 2b complementaria).

Las rebanadas de corazón se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 h. El tejido fijo se deshidrató en sacarosa al 10 % y luego al 20 % durante 1 h, seguido de sacarosa al 30 % durante la noche. A continuación, los cortes se incrustaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (compuesto OCT) y se congelaron gradualmente en un baño de isopentano/hielo seco. Los bloques embebidos en OCT se almacenaron a -80 °C hasta el seccionamiento. Los portaobjetos se prepararon en secciones de 8 μm de espesor.

Para retirar la OCT de los cortes de corazón, los portaobjetos se calentaron en un bloque térmico durante 5 min a 95 °C. Se añadió 1 ml de PBS a cada portaobjetos y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, las secciones se permeabilizaron dejándolas durante 15 min con Triton-X al 0,1 % en PBS a temperatura ambiente. Para evitar la unión de anticuerpos no específicos a las muestras, se añadió 1 ml de solución de BSA al 3 % a los portaobjetos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se descartó el BSA y se lavaron los portaobjetos con PBS. Con un bolígrafo de cera, se marcó cada muestra. Se agregaron a la sección de 90 min, seguido de los anticuerpos secundarios (dilución 1:200 en BSA al 1 %) anti-ratón Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; n.º A16079), anti-conejo Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; n.º T6391) durante otros 90 min separados por tres lavados con PBS.Para diferenciar la tinción diana del fondo, solo se utilizó un anticuerpo secundario como control.Finalmente, se agregó la tinción nuclear DAPI, y los portaobjetos se montaron en vectashield (Vector Laboratories) y se sellaron con esmalte de uñas. La formación de imágenes de inmunofluorescencia se realizó utilizando un generador de imágenes de alto contenido Cytation 1 (aumento de lente de 20X) y un microscopio Keyence que usa un aumento de lente de 40X.

Para la tinción WGA, se utilizó WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; n.° W32464) a 5 µg/mL en PBS y se aplicó a secciones fijas durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se lavaron con PBS y se añadió Sudan Black a cada portaobjetos y se incubaron durante 30 min. A continuación, los portaobjetos se lavaron con PBS y se añadió medio de montaje vectashield. Se tomaron imágenes de los portaobjetos en un microscopio Keyence utilizando un aumento de lente de 40X.

Se eliminó OCT de las muestras como se describe anteriormente. Una vez retirado el OCT, los portaobjetos se sumergieron en solución de Bouin durante la noche. Luego, los portaobjetos se enjuagaron con agua destilada durante 1 h, luego se colocaron en una solución de fucsina ácida escarlata de Biebrich durante 10 min. Luego, los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se colocaron en una solución de ácido fosfotúngstico al 5 % de fosfomolíbdico/5 % durante 10 min. Sin enjuagar, los portaobjetos se transfirieron directamente a una solución de azul de anilina durante 15 min. Luego, los portaobjetos se enjuagaron con agua destilada y se colocaron en una solución de ácido acético al 1% durante 2 min. Los portaobjetos se secaron en alcohol etílico de grado 200 y se transfirieron a xileno. Se tomaron imágenes de los portaobjetos teñidos usando un microscopio Keyence con un aumento de lente de 10x. El porcentaje de área de fibrosis se cuantificó usando el software Keyence Analyzer.

El ensayo de viabilidad celular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nº de catálogo V13154, se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante con algunas modificaciones. En detalles, se utilizó un punzón quirúrgico de 6 mm para garantizar un tamaño de tejido similar al realizar el ensayo MTT. Cada uno de los tejidos se colocó en un pocillo de placas de 12 pocillos que contenían sustrato MTT según el protocolo del fabricante. Los cortes se incubaron durante 3 h a 37 °C y el tejido viable metabolizó el sustrato de MTT creando un compuesto de formazán púrpura. La solución de MTT se reemplazó con 1 ml de DMSO y se incubó a 37 °C durante 15 min para extraer el formazán púrpura de las rodajas de corazón. Las muestras se diluyeron a 1:10 en DMSO dentro de una placa de 96 pocillos de fondo transparente, y la intensidad del color púrpura se midió utilizando un lector de placas Cytation (BioTek) a 570 nm. Las lecturas se normalizaron al peso de cada rebanada de corazón.

El medio de los cortes de corazón se cambió por un medio de cultivo que contenía 1 μCi/ml de [5-3H]-glucosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EE. UU.) para el ensayo de utilización de glucosa, como se describió anteriormente46,47. Después de la incubación durante 4 h, se añadieron 100 μl de medio a un tubo de microcentrífuga sin tapa que contenía 100 μl de HCl 0,2 N. Luego, el tubo se colocó en un vial de centelleo que contenía 500 μl de dH2O para permitir la difusión por evaporación de [3H]2O a 37 °C durante 72 h. Luego, los tubos de microcentrífuga se retiraron de los viales de centelleo y se añadieron 10 ml de líquido de centelleo. El recuento de centelleo se realizó utilizando un analizador de centelleo líquido Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EE. UU.). A continuación, se calculó la utilización de glucosa, teniendo en cuenta la actividad específica de [5-3H]-glucosa, el equilibrio incompleto y el fondo, la dilución de [5-3H]-en glucosa no marcada y la eficacia del contador de centelleo. Los datos se normalizaron al peso de los cortes de corazón.

El ARN se aisló de los cortes de corazón utilizando el Micro Kit Qiagen miRNeasy, n.º 210874, siguiendo el protocolo del fabricante después de homogeneizar el tejido en Trizol. La preparación de la biblioteca RNAseq, la secuenciación y el análisis de datos se realizaron como se describe a continuación:

Se usó 1 μg de ARN por muestra como material de entrada para las preparaciones de la biblioteca de ARN. Las bibliotecas de secuenciación se generaron con el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraTM para Illumina (NEB, EE. UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante y se agregaron códigos de índice para atribuir secuencias a cada muestra. Brevemente, el ARNm se purificó a partir del ARN total usando perlas magnéticas unidas a oligopoli-T. La fragmentación se llevó a cabo utilizando cationes divalentes a temperatura elevada en tampón de reacción de síntesis de primera cadena NEBNext (5X). La primera cadena de ADNc se sintetizó utilizando un cebador de hexámero aleatorio y transcriptasa inversa M-MuLV (RNasa H-). La síntesis de ADNc de la segunda cadena se realizó posteriormente utilizando ADN polimerasa I y RNasa H. Los salientes restantes se convirtieron en extremos romos mediante actividades de exonucleasa/polimerasa. Después de la adenilación de los extremos 3' de los fragmentos de ADN, se ligó el adaptador NEBNext con estructura de bucle en horquilla para preparar la hibridación. Para seleccionar fragmentos de cDNA de preferentemente 150-200 pb de longitud, los fragmentos de la biblioteca se purificaron con el sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EE. UU.). Luego se usaron 3 μl de USER Enzyme (NEB, EE. UU.) con ADNc ligado con adaptador y seleccionado por tamaño a 37 °C durante 15 min, seguido de 5 min a 95 °C antes de la PCR. Luego se realizó la PCR con la polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion, los cebadores Universal PCR y el cebador Index (X). Por último, los productos de PCR se purificaron (sistema AMPure XP) y la calidad de la biblioteca se evaluó en el sistema Agilent Bioanalyzer 2100. Luego, las bibliotecas de ADNc se secuencian utilizando el secuenciador Novaseq. El archivo de datos de imagen original de Illumina se transforma en lecturas sin procesar mediante el reconocimiento de base de CASAVA (Llamada de base). Los datos sin procesar se almacenan en archivos de formato FASTQ(fq), que contienen secuencias de lecturas y la calidad base correspondiente. HISAT2 se selecciona para asignar las lecturas secuenciadas filtradas al genoma de referencia Sscrofa11.1. En general, HISAT2 admite genomas de cualquier tamaño, incluidos aquellos con más de 4000 millones de bases, y la mayoría de los parámetros están configurados de forma predeterminada. Las lecturas empalmadas de los datos de RNA Seq se pueden alinear de forma eficaz con HISAT2, que es el sistema más rápido disponible en la actualidad, con una precisión igual o superior a la de cualquier otro método.

La abundancia de transcritos refleja directamente el nivel de expresión génica. El nivel de expresión génica se estima por la abundancia de transcritos (recuento de secuenciación) que se asignan al genoma o al exón. El recuento de lecturas es proporcional al nivel de expresión génica, la longitud del gen y la profundidad de secuenciación. Se calcularon los FPKM (Fragmentos por kilobase de secuencia de transcripción por millones de pares de bases secuenciados) y se determinaron los valores P de expresión diferencial utilizando el paquete DESeq2. Luego, calculamos las tasas de descubrimiento falso (FDR) para cada valor P con el método Benjamini-Hochberg 9 basado en la función R incorporada "p.adjust".

El ARN extraído de cortes de corazón se convirtió en ADNc a una concentración de 200 ng/μl usando la mezcla SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, Cat # 11756050). La qRT-PCR se ejecutó utilizando una placa de reacción transparente de 384 pocillos óptica de placa Endura de microamperios de Applied Biosystems (Thermo, n.º de catálogo 4483319) con una película adhesiva óptica de microamperios (Thermo, n.º de catálogo 4311971). La mezcla de reacción constaba de 5 μl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, Cat # 4444557), 0,5 μl de Taqman Primer y 3,5 μL de H2O por pocillo. Se ejecutó el ciclo de qPCR estándar y se midieron los valores de CT utilizando un instrumento de PCR en tiempo real Quantstudio 5 de Applied Biosystems (bloque de 384 pocillos; Producto n.º A28135). Los cebadores Taqman se compraron de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1).Todos los valores de CT de muestra se normalizaron al gen de limpieza GAPDH.

La liberación de NT-ProBNP en los medios de cultivo se evaluó mediante un kit de NT-ProBNP (cerdos) (n.º de catálogo MBS2086979, MyBioSource) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se agregaron 250 μL de cada muestra y estándar a cada pocillo por duplicado. Inmediatamente después de la adición de las muestras, se añadieron 50 μL de reactivo de detección A por pocillo. La placa se agitó suavemente y se selló con un Plate Sealer. A continuación, la placa se incubó durante 1 hora a 37 °C. Luego, se aspiró la solución y se lavaron los pocillos con 350 μL de solución de lavado 1X 4 veces, dejando que la solución de lavado se incube durante 1 a 2 minutos cada vez. A continuación, se agregaron 100 μL del reactivo de detección B por celda y se sellaron con un sellador de placas. La placa se agitó suavemente y se incubó a 37 °C durante 30 min. Se aspiró la solución y se lavaron los pocillos con 350 μL de solución de lavado 1X 5 veces. Se agregaron 90 μL de solución de sustrato a cada pocillo y se selló la placa. La placa se incubó durante 10-20 min a 37 °C. Se agregaron 50 μL de solución de parada por pocillo. La placa se midió inmediatamente utilizando un lector de placas Cytation (BioTek) ajustado a 450 nm.

Se realizaron análisis de potencia para elegir los tamaños de grupo que proporcionarán >80 % de potencia para detectar un cambio absoluto del 10 % en el parámetro con una tasa de error de tipo I del 5 %. Los cortes de tejido fueron elecciones aleatorias antes de los experimentos. Todos los análisis fueron cegados con respecto a las condiciones, y las muestras se descodificaron solo después de que se analizaron todos los datos. Se utilizó el software GraphPad Prism (San Diego, CA) para realizar todos los análisis estadísticos. Para todas las estadísticas, los valores de p se consideraron significativos en valores <0,05. Se realizaron pruebas t de Student de dos colas para datos con solo 2 comparaciones de grupo. Se usó ANOVA unidireccional o bidireccional para determinar la importancia entre múltiples grupos. Se aplicó la corrección de Tukey para tener en cuenta múltiples comparaciones al realizar pruebas post hoc. Los datos de RNAseq tuvieron una consideración estadística especial para calcular el FDR y el p.adjust como se resume en la sección de métodos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y sus archivos de información complementaria. Consulte el archivo de Excel de datos complementarios 1 para los datos de RNAseq y los puntos de datos para cada figura. Además, los datos sin procesar de RNAseq se depositan en el repositorio GEO con el número de acceso GSE211110.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y sus archivos de información complementaria. El archivo de código de software complementario muestra los códigos de computadora utilizados en los análisis. El código del software se depositó en Zenodo44: https://doi.org/10.5281/zenodo.7023518.

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Los autores desean agradecer a las agencias de financiación que hicieron posible este trabajo: TMAM cuenta con el apoyo de las subvenciones R01HL147921 y P30GM127607 del NIH y la subvención 16SDG29950012 de la American Heart Association. Los autores también reconocen las subvenciones del NIH F32HL149140 (RREA), P30GM127607 (BGH), R01HL130174 (BGH), R01HL147844 (BGH), R01ES028268 (BGH), P01HL78825 (RB, BGH), UM1HL113530 (RB) y 2U54HL120163. También agradecemos al Departamento de Defensa de los Estados Unidos de América por la subvención W81XWH-20-1-0419 (TMAM).

Estos autores contribuyeron igualmente: Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki.

Del Instituto de Cardiología Molecular, Departamento de Medicina, Universidad de Louisville, Louisville, EE. UU.

Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki, Qinghui Ou, Riham RE Abouleisa, Xian-Liang Tang, Abou Bakr M. Salama, Ahmad Gebreil, Cindy Lin, Roberto Bolli y Tamer MA Mohamed

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Louisville, Louisville, EE. UU.

Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki, Ahmed Elnakib, Hisham Abdeltawab, Fahmi Khalifa, Ayman S. El-Baz, Guruprasad A. Giridharan y Tamer MA Mohamed

Facultad de Medicina, Universidad de Zagazig, Zagazig, Egipto

Abu Bakr M. Salamá

Instituto Envirome, Centro de Diabetes y Obesidad, Departamento de Medicina, Universidad de Louisville, Louisville, EE. UU.

Bradford G. Hill y Tamer MA Mohamed

Corporación AnaBios, San Diego, EE. UU.

Najah Abi-Gerges

Departamento de Farmacología y Toxicología, Universidad de Louisville, Louisville, EE. UU.

Domador MA Mohamed

Instituto de Ciencias Cardiovasculares, Universidad de Manchester, Manchester, Reino Unido

Domador MA Mohamed

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JMM y MHM: diseño experimental, recolección y análisis de datos moleculares y celulares, redacción del manuscrito y aprobación final del manuscrito; AE: análisis de deformación realizado; QO: corte, tinción e imágenes del corazón; XL.T., RB: Colección de corazón de cerdo y redacción de manuscritos, RREA y BGH: Análisis metabólico; AS, CL y AG: inmunotinción y tinción y análisis tricrómico; HA, FK, NA y ASE: análisis de inteligencia artificial para la integridad del tejido del corte del corazón; GG: Diseño de ingeniería y supervisión del CTCM y estimulación mecánica; TMAM: concepción y diseño del conjunto de la obra, y aportación de financiación. Todos los autores han contribuido a la redacción del manuscrito y la aprobación final del manuscrito.

Correspondencia a Tamer MA Mohamed.

TMAM tiene acciones en Tenaya Therapeutics. GG consulta por NuPulseCV. NA es el director científico y posee acciones en Anabios. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a Aida Oliván-Viguera y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Ngan Huang y Eve Rogers. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Miller, JM, Meki, MH, Elnakib, A. et al. Modelo biomimético de cultivo de tejido cardíaco (CTCM) para emular la fisiología cardíaca y la fisiopatología ex vivo. Comun Biol 5, 934 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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Recibido: 07 febrero 2022

Aceptado: 30 de agosto de 2022

Publicado: 09 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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