Bioimpresión de materiales vivos funcionales microporosos a partir de proteínas

Oct 11, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 322 (2023) Citar este artículo

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Los materiales vivos reúnen la ciencia de los materiales y la biología para permitir la ingeniería y el aumento de los sistemas vivos con funcionalidades novedosas. La bioimpresión promete un control preciso sobre la formación de materiales tan complejos mediante la deposición programable de células en materiales blandos, pero los enfoques actuales han tenido un éxito limitado en el ajuste fino de los microentornos celulares mientras se generan morfologías macroscópicas sólidas. Aquí, abordamos este desafío mediante el uso de tinta de microgel core-shell para desacoplar los microentornos celulares de la capa estructural para su posterior procesamiento. Las células se inmovilizan de forma microfluídica en el núcleo viscoso que puede promover la formación de poblaciones microbianas y esferoides celulares de mamíferos, seguido de hibridación entre partículas para dar andamios funcionales estabilizados covalentemente con microporosidad controlada. Los resultados muestran que la estrategia core-shell mitiga la fuga celular al tiempo que proporciona un entorno favorable para el cultivo celular. Además, demostramos que se pueden imprimir diferentes consorcios microbianos en andamios para una variedad de aplicaciones. Al compartimentar los consorcios microbianos en microgeles separados, la capacidad de bioprocesamiento colectivo del andamio se mejora significativamente, arrojando luz sobre las estrategias para aumentar los materiales vivos con capacidades de bioprocesamiento.

Los materiales vivos son materiales complejos que incorporan células vivas en componentes no vivos1,2. Según la naturaleza de las interacciones con las células componentes, estos materiales pueden variar desde medios bioinertes que ofrecen funciones de andamiaje3,4,5,6,7, hasta biomateriales instructivos celulares que pueden dirigir los comportamientos celulares8,9,10 y, recientemente, incluso a matrices genéticamente programables producidas por células que imitan la formación natural de biopelículas11,12,13,14,15. La funcionalidad de dichos materiales compuestos proviene principalmente de células incrustadas; como tal, el material siempre debe permitir que las células crezcan y funcionen correctamente. Sin embargo, también suele haber fuertes limitaciones en las propiedades macroscópicas del material debido al requisito funcional de que una estructura final presente una forma física que pueda manipularse, entregarse, conservarse, reutilizarse y proteger las células. La sinergia entre los materiales y la biología no solo ha transformado drásticamente nuestra comprensión de los procesos celulares16, sino que también nos ha brindado la capacidad de diseñar sistemas vivos para una miríada de aplicaciones, desde la administración terapéutica de células para la medicina regenerativa17,18,19, hasta a pedido. producción de productos químicos de alto valor a través del bioprocesamiento microbiano6,7.

La manipulación de la distribución espacial de las células es una de las capacidades más buscadas en el campo de los materiales vivos. Podría decirse que la bioimpresión ha captado la mayor atención20,21 debido a su versatilidad y compatibilidad con muchos materiales blandos aptos para células. Por ejemplo, la bioimpresión permite la deposición programable de células de mamíferos en hidrogeles bioactivos para crear construcciones biológicas en 3D que recapitulan mejor la complejidad y la heterogeneidad de los tejidos nativos22,23,24,25, lo que tiene enormes valores de traducción en biomedicina. La bioimpresión de microbios también ha visto un aumento de aplicaciones en los últimos años, ya que mejora nuestra comprensión de las comunidades bacterianas dinámicas26 y brinda información para la mejora del bioprocesamiento3,4,5,6. Sin embargo, las rutinas actuales de bioimpresión a menudo sacrifican la idoneidad de las células para mejorar la capacidad de fabricación del material, ya que las propiedades mecánicas y reológicas inherentes de la biotinta no pueden desacoplarse adecuadamente de los microentornos celulares27,28. Además, sigue siendo un desafío construir morfologías de materiales macroscópicos arbitrarios con nichos celulares bien definidos para establecer interacciones sólidas entre diferentes comunidades celulares20,21,29.

Aquí, proponemos un método para abordar este desafío. En este trabajo, exploramos la aplicabilidad de los microgeles core-shell cargados de células en la interfaz de la bioimpresión y los materiales vivos funcionales. Basados ​​en un sistema acuoso de dos fases entre gelatina/gelatina metacriloilo (gelMA) y carboximetilcelulosa (CMC)30, los microgeles de núcleo-cubierta se fabrican con células encapsuladas en la fase de núcleo viscoso, mientras que la cubierta de hidrogel ofrece una estrategia de red dual para ser unidos covalentemente entre sí en un andamio microporoso PAM (microgel recocido a base de proteínas). Además, conectamos bloques de construcción ajustables microfluídicamente con funcionalidades de materiales vivos macroscópicos a través de bioimpresión por extrusión29,31 hacia el bioprocesamiento. Mostramos que los microgeles core-shell apoyan el crecimiento de poblaciones microbianas y esferoides celulares de mamíferos; lo que es más importante, en comparación con sus homólogos sin núcleo-envoltura, los microgeles con núcleo-envoltura pueden reducir la fuga de células al medio al tiempo que aumentan la capacidad de bioprocesamiento de dichos materiales. Por último, demostramos que al fabricar andamios con propiedades que varían localmente, es decir, poblaciones de células segregadas espacialmente y distribuidas heterogéneamente en microgeles discretos, se observan bioactividades significativamente mejoradas en dos modelos de consorcios microbianos típicos. Creemos que nuestro método ha proporcionado una estrategia generalizable para construir la próxima generación de materiales vivos, con promesas no solo en el bioprocesamiento microbiano, sino también en la biofabricación avanzada.

Comenzamos con la gelatina, un material derivado del colágeno que se ha utilizado durante mucho tiempo en una variedad de aplicaciones biológicas debido a su origen animal y su amplia disponibilidad32, para construir materiales vivos (Fig. 1). Para lograr una red dual, la gelatina se mezcló primero con su derivado fotorreticulable, gelMA, para generar una solución precursora de hidrogel homogénea al 15 % enriquecida con fotoiniciadores de luz azul al 0,5 %, fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP). GelMA se sintetizó de acuerdo con un protocolo bien establecido 33, con un grado estimado de funcionalización del 50 % por RMN (Fig. 1 complementaria). La fase dispersa se emulsificó en un dispositivo de enfoque de flujo de microfluidos, donde una solución de carboximetilcelulosa (CMC) al 1 % enriquecida con 10 U/ml de transglutaminasas estaba flanqueada por soluciones formadoras de hidrogel en la unión del dispositivo, y juntas, la fase dispersa se cruzaba con el aceite portador (Novec 7500 con tensioactivo Pico-surf al 0,1 %) para generar gotitas (Fig. 2 complementaria). Los caudales para el precursor de hidrogel, la CMC y el aceite fueron respectivamente de 8, 2 y 40 µl/min, lo que resultó en gotitas de núcleo-envoltura altamente monodispersivas de ~165 µm de diámetro (coeficiente de variación, CV = 2,2 %) y núcleo de CMC de ~90 µm (CV = 7,4%). Mediante microfluidos, se podría controlar el grosor de la cubierta (Fig. 1b). Las gotas se curaron a temperatura ambiente durante la noche para permitir la difusión de transglutaminasas desde el núcleo de CMC a la fase de cubierta que, posteriormente, catalizó la formación de enlaces isopeptídicos entre glutamina y lisina y, por lo tanto, la primera red covalente. Los microgeles se desemulsionaron, seguido de una mezcla directa con una solución tamponada de fosfato (PBS) que contenía LAP al 0,5 % en una proporción de volumen de 4:1 para producir una capacidad de impresión satisfactoria. Usando una impresora 3D de extrusión, los microgeles atascados podrían modelarse en andamios macroscópicos. Finalmente, una luz azul de 405 nm inició un segundo entrecruzamiento entre los microgeles para generar andamios de PAM estabilizados covalentemente mecánicamente lo suficientemente rígidos para ser manipulados fácilmente con un par de pinzas (Fig. 1c) y pueden mantener su integridad estructural después de 3 días de incubación en PBS ( Vídeo complementario 1). Notablemente, la estrategia covalente dual es reversible, es decir, las gotitas pueden curarse primero mediante radiación de luz azul y luego recocerse enzimáticamente.

un esquema de la formación de andamios PAM. En primer lugar, la mezcla de polímeros de gelatina/gelMA que contiene LAP, junto con la solución de CMC que contiene células enriquecidas con transglutaminasas, se emulsiona con aceite portador en gotitas dentro de un dispositivo de microfluidos de enfoque de flujo. Luego, las gotas se convierten en microgeles mediante reacciones enzimáticas, después de lo cual se extruyen y modelan en andamios. Finalmente, la luz azul inicia un segundo entrecruzamiento covalente entre microgeles atascados, dando lugar a andamios PAM. b Mediante microfluídica, se puede controlar la relación núcleo-carcasa. Los caudales de la solución precursora de hidrogel (fase de cubierta) y el aceite portador se controlan a 8 y 40 µL/min, respectivamente, y los caudales de CMC (fase central) son de 1, 2 y 3 µL/min, para pequeños , tamaño de núcleo mediano y grande, respectivamente, n = 50 microgeles analizados en un experimento. c Estructuras PAM impresas y la micrografía muestra aumento local de dos filamentos cruzados. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar y los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las imágenes de SEM (microscopio electrónico de barrido) muestran la morfología del núcleo y la cubierta de los bloques de construcción (Fig. 3b complementaria) y que los andamios PAM de red dual tenían porosidad multiescala (Fig. 3a-c complementaria). En la superficie del microgel había nanoporos (Fig. 3a complementaria) que son característicos de los hidrogeles como material con alto contenido de agua. El empaque de microgel dio lugar a microporos34, como lo demuestra la morfología de malla estirada de los andamios de PAM liofilizados (Fig. 3c complementaria). Para investigar más a fondo cómo el tamaño del microgel afecta las propiedades físicas de los andamios a macroescala, estudiamos la cinética de degradación de los andamios de PAM ensamblados a partir de microgeles de diferentes tamaños al filtrar la solución de tripsina en la estructura (Fig. 4a complementaria), junto con hidrogeles a granel de doble reticulación y microgeles no recocidos. Los perfiles cinéticos (Fig. 4b complementaria) demuestran que la degradación de todos los andamios de PAM, independientemente del tamaño de los microgeles, mostró tasas más altas que los hidrogeles a granel debido a la presencia de microporos que facilitaron la percolación de la solución de tripsina en los andamios. Además, la degradación tendió a ser más lenta con tamaños de microgel más pequeños, posiblemente debido a la disminución del tamaño de los poros 19 y, por lo tanto, a la percolación más lenta (Fig. 4b complementaria).

Los microgeles han surgido recientemente como un tipo de tinta para fabricar estructuras 3D mediante impresión por extrusión29,31,34,35,36,37. En estado de atascamiento, pueden formar estructuras de reposo que se comportan como sólidos elásticos a través de interacciones físicas como fricciones; cuando se corta, las fricciones entre partículas se disipan para permitir que fluya la tinta. Como tal, los materiales que pueden transformarse en microgeles son teóricamente imprimibles mediante extrusión independientemente de su química polimérica29,31. Para evaluar cuantitativamente la capacidad de impresión de esta tinta de microgel core-shell, primero se llevó a cabo la caracterización reológica. Los microgeles atascados exhibieron un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento (Fig. 2a) y podrían recuperarse rápidamente de la tensión al retirarlos (Fig. 2b). Colectivamente, este comportamiento reológico particular se puede traducir en la capacidad de la tinta para transformarse rápidamente de un líquido que fluye cuando se corta a un sólido elástico al salir de la boquilla. El experimento de barrido de deformación demuestra que la tinta de microgel produjo una deformación de alrededor del 30 % (Fig. 5a complementaria); después del recocido entre partículas, tanto el módulo de almacenamiento como el de pérdida aumentaron significativamente (Fig. 2c) y el límite elástico fue testigo de un aumento de aproximadamente seis veces (Fig. 5b complementaria), lo que dio lugar a andamios PAM con mayor resistencia mecánica. Además, la tinta con una estrategia de red dual invertida compartió un conjunto de propiedades reológicas similares (Figura complementaria 5c-f).

a–c Caracterización reológica de la tinta de microgel. Los microgeles se curan enzimáticamente. un experimento de barrido de velocidad de corte. Tasa de corte de 0 a 10 1/s. Colar 1%. b Barrido de tensión escalonada donde la tensión baja (1%) y la tensión alta (90%) se ciclan cada 100 s. Frecuencia 1 Hz. c Módulos de almacenamiento y pérdida antes y después del recocido fotoiniciado, n = 3 caracterizaciones reológicas independientes. ***p = 0,00022, ** p = 0,0031, prueba t de Student de dos colas para datos no apareados. d Imágenes fluorescentes de filamentos extruidos impresos desde boquillas de diferentes tamaños. El recuadro muestra una esquina curva de un filamento. e Análisis de los diámetros de los filamentos. Las barras de colores representan los diámetros internos de las boquillas de impresión y las en blanco son los diámetros medidos de los filamentos impresos, n = 3 filamentos impresos de forma independiente en un experimento. f Imágenes fluorescentes de andamios, es decir, (i) andamios homogéneos verdes y (ii) rojos, (iii) un andamio macroscópicamente heterogéneo y (iv) un andamio microscópicamente heterogéneo. d, f Los microgeles fluorescentes se generan a partir de una mezcla de gelatina con gelMA marcado con fluoróforo. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar y los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego probamos la fidelidad de la impresión. Se emplearon boquillas de diferentes diámetros internos para modelar andamios, y todos los filamentos mostraron un grosor uniforme sin un aplanamiento perceptible (Fig. 2d), que de otro modo se vería afectado por la tensión superficial al entrar en contacto con la superficie sólida. En consecuencia, los diámetros de los filamentos eran fieles a los de las boquillas de impresión e incluso un poco más pequeños con las boquillas de 20 G, 21 G y 22 G (Fig. 2e) debido al aumento de la irregularidad de los bordes. Luego probamos la compatibilidad de la tinta de microgel con una impresora 3D de extrusión comercial (Fig. 6a complementaria y Video complementario 2). Se cargó tinta de microgel con capacidad de impresión optimizada en un cartucho de dispersión acoplado con un brazo robótico mecánico de tres ejes. La extrusión y la velocidad de escritura de la tinta de microgel fueron controladas neumáticamente y por el brazo robótico, respectivamente. A diferencia de la impresión por extrusión continua basada en material, en la que el grosor del filamento se puede controlar tanto por la extrusión como por la velocidad de escritura debido a la fusión del filamento38, descubrimos que el grosor de la tinta de microgel impresa apenas no depende de la velocidad sino del tamaño de la boquilla debido a su comportamiento más elástico. Por lo tanto, las velocidades no coincidentes darán lugar a la rotura del filamento (extrusión escritura, figura complementaria 6b). Como resultado, al igualar la velocidad de extrusión de tinta y escritura, pudimos modelar la tinta de microgel en varias formas predefinidas (Fig. 6a complementaria) y estructuras multicapa. Además de las estructuras homogéneas (Fig. 2fi y ii), también se podrían fabricar estructuras heterogéneas (Fig. 2f, iii y iv) simplemente mezclando poblaciones de microgeles con diferentes propiedades.

Uno de los principales desafíos en la bioimpresión por extrusión es cómo lograr un equilibrio entre las propiedades mecánicas del material, la capacidad de fabricación del material y la idoneidad para el cultivo celular21,27,28, como las características mecánicas inherentes del material, es decir, el perfil reológico y el final. la rigidez del material no solo determinará su rendimiento de impresión20,39, sino que también, lo que es más importante, podría afectar negativamente a los comportamientos celulares40,41. Para hacer frente a este desafío, utilizamos la estrategia núcleo-cubierta para desacoplar el procesamiento de materiales (la fase de cubierta) del cultivo celular (la fase central) a través de su separación de fases30. El material central, CMC, se ha utilizado para cultivos celulares y como andamios de ingeniería de tejidos42,43. La caracterización reológica del material del núcleo muestra que la solución de CMC se inclina hacia la viscosidad (Figura complementaria 5g, i). A continuación, investigamos la proliferación de microorganismos en un entorno tan viscoso en comparación con los bloques de construcción que no son de núcleo y cubierta (Fig. 3). Se permitió que E. coli creciera en microgeles curados durante 24 horas. En los microgeles de núcleo y cubierta, en gran medida, el crecimiento celular se limitó físicamente, lo que condujo a una población bacteriana concentrada en el núcleo (Fig. 3a). En marcado contraste, las bacterias en microgeles sin núcleo proliferaron localmente y formaron microcolonias redondeadas y esporádicas (Fig. 3b) que fueron similares a las reportadas recientemente44. Además, también descubrimos visualmente que dicho confinamiento espacial podría evitar que las bacterias escapen al medio ambiente de manera más efectiva (Figura complementaria 7a). Además, confirmamos el resultado a través de un experimento de placas de dilución (Fig. 7b complementaria), que muestra que la unidad formadora de colonias (UFC) del sobrenadante de los microgeles sin núcleo-cáscara era dos órdenes de magnitud más alta que la de los microgeles con núcleo-cáscara. microgeles durante 24 horas (Fig. 7c complementaria). Dado que la fuga de células constituye un desafío sin abordar en el campo de los materiales vivos para el bioprocesamiento6,7,45, especialmente cuando se trata de microorganismos modificados genéticamente que no pueden correr el riesgo de escapar, el uso de microgeles de núcleo-envoltura podría ofrecer estrategias para solucionar este problema46. Además, los microbios podrían proliferar en los andamios de PAM de manera similar sin una contaminación cruzada notable entre los microgeles adyacentes (Fig. 8 complementaria).

Panel izquierdo: GFP Escherichia Coli (E. coli.) en microgeles con y sin núcleo. Panel derecho: formación y caracterización de esferoides celulares HEK 293 T en microgeles core-shell. a Proliferación de GFP E. coli. en los microgeles core-shell. El crecimiento celular está confinado dentro de los núcleos de microgel viscoso. b Proliferación de E. coli. en los microgeles sin núcleo-cáscara. E. coli prolifera localmente para formar microcolonias visibles. Las líneas discontinuas azules y blancas delinean los microgeles y los núcleos de CMC, respectivamente. c Representación esquemática de la formación de esferoides multicelulares. Debido al confinamiento espacial, las células pueden interactuar en las tres dimensiones para formar esferoides multicelulares con una estructura jerárquica. d Crecimiento de esferoides HEK 293 T desde el día 3 hasta el día 6, cuantificado por la circularidad y el área del esferoide. Los datos se representan como valores medios con mínimos/máximos, n = 107 esferoides (día 3), n = 248 esferoides (día 6) en el mismo experimento. **p = 0,0019, ****p < 1E-15, prueba t de Student de dos colas para datos no apareados. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. e Tinción viva/muerta de microgeles cargados de células en los días 0, 3 y 6. Las células vivas (verde) y las células muertas (roja) se tiñen con calceína acetoximetilo (calceína AM) y etidio homodímero-1 (EthD-1 ), respectivamente. f Estructura citoesquelética de esferoides HEK 293 T. (i) Imagen de campo claro de un esferoide HEK 293 T y (ii) su imagen microscópica confocal. (iii) Estructura del citoesqueleto de HEK 293 T de cultivo en monocapa. La actina F y los núcleos se tiñen con faloidina y 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), respectivamente. La micrografía fluorescente confocal se representa a partir de imágenes transversales en diferentes posiciones verticales (Fig. 10 complementaria).

También se caracterizó la aplicabilidad de los microgeles de núcleo y cubierta para el cultivo de células de mamíferos (Fig. 3c-f). La entrega de células en los microgeles siguió la distribución de Poisson (Fig. 9 complementaria). Del mismo modo, las células se confinaron espacialmente y se les permitió proliferar e interactuar en todas las dimensiones dentro de los núcleos de microgel para autoensamblarse en esferoides de alta densidad celular (Fig. 3c). Las células T 293 de riñón embrionario humano (HEK) se convirtieron en esferoides celulares después de tres días en microgeles de núcleo y cubierta (Fig. 3e), la mayoría de los cuales mostraron una alta circularidad (superior a 0.8, Fig. 3d). Del día 3 al día 6, el tamaño de los esferoides aumentó un 80% (Fig. 3d) y mantuvo una alta viabilidad, como lo demuestra la tinción Live/Dead (Fig. 3e). Además, el citoesqueleto de los esferoides HEK 293 T estaba compuesto por núcleos densamente empaquetados rodeados por una red de actina cortical (Fig. 3f, ii y Fig. 10 complementaria), que personifica el predominio de las interacciones célula-célula, en contraste con las basadas en monocapa. cultivo celular, donde la actina se organizó en fibras citoplasmáticas47 (Fig. 3f, iii). Para concluir, HEK 293 T es capaz de formar esferoides celulares bien estructurados dentro de microgeles de núcleo y cubierta con alta viabilidad celular, lo que indica su potencial para futuras aplicaciones como componentes básicos para biofabricar estructuras de alta densidad celular20.

La impresión de microbios es la frontera emergente en la bioimpresión48, ya que ofrece una herramienta versátil para crear materiales vivos funcionales con formas y propiedades bien definidas que han encontrado una amplia gama de aplicaciones que incluyen detección49, biofabricación6 y biorremediación3,7. Luego, los microgeles de núcleo y cubierta se usaron como biotinta para imprimir andamios vivos funcionales para el bioprocesamiento (Fig. 4a). Comenzamos con un sistema de fermentación natural de Saccharomyces cerevisiae para convertir anaeróbicamente la glucosa en etanol3,4,5. Los microgeles de núcleo y cubierta cargados de levadura se imprimieron (Fig. 4b) en andamios recocidos de PAM y se sumergieron en medios de extracto de levadura peptona dextrosa (YPD) en un ambiente libre de oxígeno para la fermentación. Para todos los andamios de microgel de núcleo y cubierta cargados de levadura utilizados en este trabajo, la producción de etanol comenzó a despegar 2 horas después de la inmersión en medios YPD y creció exponencialmente en 12 horas (Fig. 4e). Primero, investigamos cómo las propiedades físicas del bloque de construcción influyen en la capacidad de bioprocesamiento de los andamios impresos. Al ajustar únicamente la velocidad de flujo de la fase central, se generaron microgeles de núcleo-capa del mismo tamaño general (núcleo-capa A y B: 156 ± 3,2 µm y 154 ± 2,0 µm, respectivamente) con tamaños de núcleo variados (84 ± 8,2 µm y 56 ± 2,1 µm, respectivamente, Fig. 4c, d) y, por lo tanto, una discrepancia en las cargas de las celdas. Probamos la cinética de la producción de etanol en los medios (Fig. 4e) y descubrimos que los núcleos más grandes (núcleo-carcasa A) condujeron a una generación más rápida de etanol debido a cargas celulares más altas. A continuación, examinamos si el tamaño de los microgeles de núcleo y cubierta causaría diferencias en la fermentación. Para disociar el factor de carga celular del rendimiento del bioprocesamiento, los perfiles de flujo de la fase dispersa (tanto el núcleo como la cubierta) utilizados para fabricar el microgel B de núcleo-cubierta se mantuvieron constantes, pero con un aumento de la tasa de flujo del aceite portador en un tamaño más pequeño. dispositivo de microfluidos de gotas (Fig. 11a complementaria), que da lugar a microgeles de núcleo y cubierta más pequeños (núcleo-cubierta C, 95 ± 3,2 µm en total, 34 ± 1,7 µm de núcleo) con una relación de volumen inalterada entre el núcleo y el material de la cubierta (Fig. .4d). Por lo tanto, al imprimir andamios de pesos iguales, sus cargas celulares iniciales eran similares, independientemente del tamaño de los bloques de construcción. Descubrimos que con una cantidad equivalente de células de levadura inmovilizadas en el andamio, el tamaño de los microgeles de núcleo y cubierta no influyó significativamente en el proceso de fermentación (Fig. 4e), que atribuimos a la presencia de los microporos en el andamio, junto con con una longitud de difusión relativamente más corta34, que no obstaculizó notablemente el suministro de moléculas pequeñas hacia/desde las células. Por último, también se generaron microgeles sin núcleo-envoltura (150 ± 3,0 µm) a modo de comparación y se observó un retraso considerable en la producción de etanol por los andamios impresos a partir de ellos (Fig. 4e), probablemente debido al crecimiento restringido de la levadura en un red de hidrogel altamente entrecruzada químicamente que había ralentizado la proliferación celular44. Sin embargo, también encontramos que la producción de etanol de punto final (20 horas) de los andamios de PAM de núcleo y cubierta fue ligeramente menor (Fig. 11b complementaria), lo que atribuimos a una fuga celular más pronunciada para los andamios de PAM sin núcleo y cubierta. (Fig. 11c complementaria) que impulsó la producción de etanol.

un esquema de la fabricación de andamios vivos funcionales. Los microgeles core-shell cargados de microbios se generan a través de microfluidos de gotas y se imprimen en andamios recocidos que se utilizan para el bioprocesamiento, donde los microbios actúan como biocatalizador de células enteras para convertir el sustrato en producto en el medio. b Micrografías de los microgeles de núcleo-envoltura con tamaños variados y microgeles sin núcleo-envoltura. c La distribución de tamaño de los microgeles con núcleo y cubierta y los microgeles sin núcleo y cubierta en b, n = 20 microgeles en un experimento. d La relación de volumen entre el núcleo y la fase de cubierta para microgeles de núcleo-cubierta. Los microgeles A de núcleo-envoltura tienen un tamaño general similar al B pero tienen núcleos más grandes. Los microgeles B y C de núcleo-envoltura son diferentes en tamaño total pero tienen la misma relación núcleo/envoltura para mantener cargas celulares equivalentes para la bioimpresión, n = 20 microgeles en un experimento, ****p < 1E-10, ns (no significativo) = 0,74, prueba t de Student de dos colas para datos no apareados. e La producción de etanol a partir de levadura durante 12 horas en un ambiente libre de oxígeno, que se normaliza mediante los pesos del andamio, n = 3 experimentos biológicos independientes. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar y los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, ampliamos la aplicación al bioprocesamiento6 basado en consorcios microbianos. A través de microgeles de núcleo y cubierta interconectados, los andamios PAM poseen no solo una porosidad controlable, sino también la capacidad de segregar comunidades de múltiples especies en microgeles separados (Fig. 5a), lo que en conjunto produce una transferencia más eficiente de nutrientes y metabolitos entre el andamio y el medio ambiente como así como especies que interactúan al tiempo que impiden su crecimiento competitivo. Luego examinamos si este método podría mejorar las bioactividades de los consorcios microbianos inmovilizados a través de una división espacial del trabajo (Fig. 5b) en comparación con la mezcla directa de consorcios. En primer lugar, estudiamos un sistema microalga-bacteria formado por Chlorella vulgaris fotoautotrófica y Bacillus subtilis aeróbico (Fig. 5c) por su capacidad para biorremediar naranja de metilo3,50 y amoxicilina51. En este consorcio microbiano, las microalgas fijan el dióxido de carbono emitido por las bacterias en fuentes de carbono mientras producen oxígeno a través de la fotosíntesis para que las bacterias respiren (Fig. 5c), lo que mejora su capacidad de biorremediación al beneficiar recíprocamente el crecimiento de ambos microbios52,53. Primero, para demostrar el proceso de biorremediación, se fabricaron andamios heterogéneos de PAM que inmovilizaban el consorcio en microgeles separados y se sumergieron en aguas residuales sintéticas que contenían naranja de metilo o amoxicilina (Figura complementaria 12a). Más del 90% de la amoxicilina (300 mg/L) se eliminó en 24 horas y alrededor del 15% del naranja de metilo (100 mg/L). Para examinar si dicha estrategia de separación espacial aumenta la biorremediación, se probaron andamios homogéneos, en los que el consorcio estaba encapsulado en los mismos microgeles, junto con andamios que inmovilizan monocultivos de microalgas y bacterias, respectivamente. El resultado (Fig. 5d) demuestra que ambas poblaciones microbianas individuales inmovilizadas podrían eliminar el naranja de metilo con una eficacia similar durante 24 horas, pero los andamios homogéneos fueron más eficientes en la biorremediación a pesar de una carga celular reducida a la mitad para ambos microbios, lo que sugiere el efecto sinérgico de el consorcio Más importante aún, los andamios heterogéneos remediaron significativamente más naranja de metilo (Fig. 5d), lo que indica una capacidad de bioprocesamiento mejorada. Sin embargo, también observamos que después de 48 horas, todos los andamios heterogéneos se degradaron y licuaron (Fig. 13a complementaria), lo que fue causado por la hidrólisis de los andamios por proteasas microbianas cuya concentración aumentó con el tiempo en 48 horas (Fig. 12b). Intentamos utilizar este fenómeno como una medida cualitativa adicional de la bioactividad microbiana del consorcio (Fig. 5e). Se fabricaron cuatro andamios PAM de la disposición exacta que la anterior y se sumergieron en medios BG11 (Fig. 5e y Fig. 13b complementaria). Nuevamente observamos un patrón similar: mientras que el andamio que inmovilizaba las microalgas comenzó a descomponerse después de 24 horas, durante 72 horas, el andamio con bacterias retuvo en gran medida su estructura, ya que el medio deficiente en nutrientes es desfavorable para el crecimiento de Bacillus subtilis. Dentro de las 24 horas, el andamio heterogéneo comenzó a desintegrarse en fragmentos más pequeños, mientras que el andamio homogéneo mantuvo la integridad estructural hasta el día 3 (Fig. 13c complementaria).

Los andamios de PAM inmovilizan y segregan consorcios microbianos en el espacio microscópico, lo que evita el crecimiento competitivo al tiempo que permite una transferencia masiva más eficiente de metabolitos entre especies. Los círculos y triángulos representan metabolitos secretados por microbios. b Los microgeles core-shell cargados de células se atascan y se imprimen en andamios. Los andamios heterogéneos y homogéneos se definen como: una población mixta de microgeles que contienen dos especies de microorganismos diferentes, respectivamente, y una población homogénea de microgeles que contienen una mezcla de dos microorganismos. c–e Un modelo de mutualismo de consorcios microbianos. c Representación esquemática de la relación entre Chlorella vulgaris y Bacillus subtilis. d Biorremediación de naranja de metilo mediante andamios heterogéneos, andamios homogéneos y andamios que inmovilizan monocultivos de microalgas y bacterias, respectivamente, n = 3 experimentos biológicos independientes. e Caracterización de la desintegración del andamio en 72 horas. El símbolo cerrado marca un andamio intacto mientras que el símbolo abierto es un andamio que se está desintegrando notablemente. Para todos los experimentos, los andamios se someten a condiciones cíclicas de luz/oscuridad de 12:12 horas y se incuban a 25 °C. f – h Un modelo de crecimiento competitivo de consorcios microbianos. f El consorcio microbiano sintético de Escherichia Coli y Meyerozyma guilliermondii modificados genéticamente para producir 2-PE a partir de glucosa60. Los genes sobreexpresados ​​están marcados en rojo. El gen cruzado tyrA está eliminado. g La producción de 2-PE a partir de andamios heterogéneos durante 6 días, que se normaliza mediante los respectivos pesos de los andamios, n = 3 experimentos biológicos independientes. h Comparación de bioprocesamiento en términos de producción normalizada de 2-PE durante 3 días, n = 3 experimentos biológicos independientes. *p = 0,021, ns = 0,069, prueba t de Student de dos colas para datos no apareados. Para ambos andamios, la producción está normalizada por los pesos de andamio correspondientes; para el cultivo líquido, los consorcios que contienen CMC se inoculan directamente en los medios, cuya carga celular es la misma que la de los andamios, y la producción de 2-PE se normaliza al peso medio de los andamios de heterogéneos y homogéneos combinados. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar y los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Finalmente, probamos un consorcio de bacterias y hongos sintéticos para fermentar la glucosa en 2-feniletanol (2-PE) (Fig. 5f). En esta cascada enzimática (Fig. 5f y Fig. 14 complementaria), Escherichia Coli convierte primero la fuente de carbono en la l-fenilalanina intermedia que Meyerozyma guilliermondii metaboliza en 2-PE, una especie de levadura que se informa que producir y tolerar una alta concentración de 2-PE5460. Como ambos microorganismos utilizan glucosa como fuente de carbono, forman una relación competitiva. En un cultivo líquido donde dos microbios simplemente se mezclan, M. guilliermondii siempre se convertiría en la especie dominante durante 96 horas, independientemente de la proporción de inoculación inicial (Fig. 15 complementaria). Para caracterizar el proceso de biofabricación de 2-PE a partir de andamios que contienen consorcios, primero medimos la cinética de producción de 2-PE con los andamios heterogéneos en medios sintéticos. Una población mixta de microgeles de E. coli o M. guilliermondii encapsulados respectivamente se fabricaron en andamios y se incubaron en los medios de cultivo para fermentar la glucosa en 2-PE (Fig. 16 complementaria). El resultado muestra (Fig. 5g) una cinética sigmoidal que alcanzó su punto máximo alrededor del día 2 y se estabilizó gradualmente después de 3 días de fermentación. A continuación, comparamos el rendimiento de 2-PE entre dos conjuntos diferentes de andamios (Fig. 5h). Sorprendentemente, se detectó una concentración de 2-PE más de seis veces mayor en el caldo de fermentación que contenía andamios heterogéneos que sus homólogos homogéneos en 3 días. También encontramos que había más 2-PE de los andamios homogéneos en comparación con el cultivo líquido (Fig. 5h), lo que posiblemente se atribuyó al contacto físico más cercano de dos microorganismos provocado por el confinamiento del crecimiento en microgeles. Por último, examinamos la reutilización de los andamios para la producción por lotes de 2-PE (Figura complementaria 16). Los andamios pudieron mantener la integridad durante el primer lote (3 días); a pesar del colapso estructural gradual a partir de entonces, los andamios no se vieron completamente comprometidos después de 4 procesos por lotes seguidos (12 días en total). Sin embargo, la producción de 2-PE se redujo significativamente (Fig. 16g complementaria), especialmente para andamios heterogéneos, que disminuyó en un 70 % en el segundo lote mientras que en un 20 % para andamios homogéneos. La producción de 2-PE para ambos andamios se deterioró lote por lote y se detuvo casi por completo después del tercer lote; sin embargo, los andamios heterogéneos aún produjeron más 2-PE (Fig. 16g complementaria). La disminución del rendimiento de los andamios podría deberse a que las células se escapan y se vuelven a unir a la superficie interna del andamio, lo que altera el equilibrio de crecimiento de dos especies microbianas, ya que no pueden eliminarse por completo con medios frescos entre lotes.

En conjunto, el trabajo presentado aquí describe un enfoque para construir materiales vivos a través de una rutina de bioimpresión de extrusión común. A través de un método de red dual de microgel, los materiales vivos funcionales macroscópicos estabilizados covalentemente pueden imprimirse y desplegarse fácilmente para la biorremediación y la biofabricación. Utilizamos microgeles con núcleo y cubierta como bloques de construcción y, a pesar de la inevitable fuga de células6,7, descubrimos que esta estrategia puede mitigar este problema en comparación con los microgeles sin núcleo y cubierta. Además, utilizando un modelo de monocultivo de levadura, se observó una producción de etanol severamente detenida en andamios de microgel sin núcleo-envoltura, lo que sugiere una mejor idoneidad de los microgeles con núcleo-envoltura para el cultivo celular. Además, se utilizaron microgeles cargados de microbios para organizar espacialmente las comunidades celulares, a partir de las cuales se puede establecer una distribución heterogénea de células para promover las comunicaciones entre especies de consorcios microbianos en medio de la generación de morfologías programables mediante impresión por extrusión. Nuestros resultados demuestran bioactividades notablemente mejoradas de dos consorcios microbianos diferentes. Aunque el material basado en proteínas podría no ser la opción más ideal para aplicaciones microbianas debido a su susceptibilidad a la hidrólisis de proteasas, prevemos futuros esfuerzos para utilizar materiales mecánicamente más robustos para tales aplicaciones. También mostramos que los microgeles core-shell pueden cultivar esferoides celulares de mamíferos61; combinados con la microfluídica de gotas y la estrategia de red dual de microgeles, prometen ser utilizados como componentes básicos para construir estructuras de alta densidad celular. En conclusión, creemos que nuestro método propuesto representa un paradigma valioso para construir materiales vivos funcionales para el bioprocesamiento microbiano y también tiene potencial para la biofabricación avanzada55.

El metacriloilo de gelatina (gelMA) se sintetizó de acuerdo con un protocolo publicado33. Se disolvió gelatina de piel porcina (Shanghai Aladdin Biochemical Technology) en agua desionizada a 50 °C hasta una concentración final del 10 % (p/v, todas las concentraciones se indican como p/v o se indica de otro modo). Se añadieron gota a gota 0,6 g de anhídrido metacrílico (Shanghai Macklin Biochemical) a la solución de gelatina homogénea por 1 g de gelatina. La reacción se llevó a cabo a 50 °C durante 1 h y se terminó agregando dos volúmenes de agua desionizada precalentada, después de lo cual la mezcla se centrifugó durante 3 min a 3500 × g. Los sobrenadantes se decantaron y dializaron frente a agua desionizada a 30 °C utilizando un tubo de diálisis con un peso molecular de corte de 12 kDa durante 7 días. Después de la diálisis, la solución ácida de gelMA se ajustó a pH = 7,4, se congeló instantáneamente con nitrógeno líquido y se liofilizó hasta la hidratación total hasta obtener una espuma blanca porosa. La modificación de la gelatina se verificó por resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H. La gelatina y el gelMA se disolvieron en óxido de deuterio, de manera receptiva, y los espectros (Fig. 1 complementaria) se recolectaron a una frecuencia de 400 MHz utilizando un espectrómetro Bruker Avance III HD con una sonda inversa de gradiente de un solo eje. Para estimar el grado de funcionalización (DoF), las señales integradas de protones de lisina metileno se normalizaron mediante la respectiva señal de protones aromáticos en los espectros (Fig. 1 complementaria), y el DoF de gelMA se calculó como:

Los dispositivos microfluídicos se fabricaron mediante un protocolo estándar de litografía blanda56. Brevemente, la fotorresistencia negativa SU-8 (materiales avanzados de Kayaku) se revistió por rotación sobre una oblea de silicio y se horneó suavemente en una placa caliente a 95 °C. A continuación, se colocó una fotomáscara con una geometría de dispositivo definida sobre la oblea y se expuso a una luz ultravioleta colimada (URE-2000/35 L, Instituto de Óptica y Electrónica, Academia de Ciencias de China) para curar el área del canal representada, seguido de un horneado posterior. a 95 °C y revelado SU-8 (revelador SU-8, materiales avanzados Kayaku). Los dispositivos microfluídicos basados ​​en polidimetilsiloxano (PDMS) se fabricaron mediante litografía blanda. Los elastómeros de PDMS (kit DOWSILTM Sylgard 184) se mezclaron con agentes de curado en una proporción de 10:1 (p/p) antes de verterlos sobre el maestro desarrollado en una placa de Petri. Luego, el PDMS sin curar se desgasificó y se incubó a 65 ° C para solidificar. Después de eso, se cortó el PDMS con el canal del dispositivo, del cual se perforaron las entradas y salidas con orificios de 0,75 mm. A continuación, los dispositivos y los portaobjetos de vidrio se trataron con plasma (PDC-002-HP, Harrick Plasma) durante 1 min, se unieron entre sí y se hornearon a 65 °C durante 10 min. Para la modificación hidrófoba de los canales, los canales del dispositivo se trataron con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilano (Sigma-Aldrich) durante 2 min.

En este trabajo se emplearon dos métodos de preparación de muestras. Para obtener imágenes de la morfología de la superficie de los microgeles, se utilizó el secado de punto crítico (CPD): primero, se eliminó el aceite portador y las muestras fotocuradas se resuspendieron directamente en etanol al 50 %. Los microgeles se deshidrataron gradualmente de forma consecutiva con etanol al 75 % y al 100 % durante dos días en total antes de la CPD. Los microgeles se transfirieron a cápsulas de muestras microporosas (78 µm, Agar Scientific) que se colocaron en un recipiente para muestras lleno con etanol al 100 %. El bote de muestras se insertó en un secador de punto crítico (E3100, Quorum Technologies) y se enjuagó un mínimo de cuatro veces con CO2 líquido. Después del lavado, la muestra se calentó a 37 °C a una presión de 80 bares para secar. Para obtener imágenes de la morfología de la superficie de los andamios de PAM, la muestra se liofilizó: brevemente, el andamio de PAM se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se deshidrató directamente en un liofilizador durante la noche. Para las imágenes de SEM, las muestras se montaron en trozos de SEM de aluminio usando almohadillas adhesivas de carbón conductor y se recubrieron con iridio de 15 nm usando un recubridor de pulverización catódica K575X (Quorum Technologies). Se utilizó un microscopio electrónico de barrido FEI Verios 460 para obtener imágenes.

La caracterización reológica de la tinta de microgel atascada y los andamios PAM se realizó utilizando geometría de placas paralelas (20 mm de diámetro, 1 mm de separación) montadas en reómetros controlados por deformación (Thermo Scientific HAAKE MARS 40/60 Rheometer). Los microgeles atascados se prepararon de la misma manera y se moldearon con una geometría idéntica a las placas. Los andamios PAM se formaron con una radiación de luz azul de 300 s. Para la estrategia de reticulación inversa, los microgeles atascados resuspendidos con enzimas se dejaron recocer durante 30 minutos en una placa de Petr sellada antes de las mediciones. Las curvas de adelgazamiento por cizallamiento se obtuvieron en mediciones controladas por velocidad de deformación con una deformación del 1 % y velocidades de cizallamiento de 0,01 a 10 s−1. El comportamiento de recuperación de la tinta se llevó a cabo mediante un barrido de deformación escalonada donde la deformación baja (1%) y la deformación alta (90%) se ciclaron cada 100 s con una frecuencia de 1 Hz. Las pruebas de barrido de deformación se realizaron con una frecuencia de 1 Hz y deformación de 0 a 1000%. Los módulos se calcularon a partir de la región viscoelástica lineal de los diagramas de barrido de deformación. Las pruebas de barrido de deformación antes y después del recocido no se emparejaron. La caracterización reológica de la solución de polímero CMC al 1% se realizó utilizando la misma máquina con una geometría de placa diferente (35 mm de diámetro, 1 mm de separación). Las curvas de adelgazamiento por cizallamiento se obtuvieron en mediciones controladas por velocidad de deformación con una deformación del 1 % y velocidades de cizallamiento de 0,01 a 100 s−1. El barrido de frecuencias se realizó con un 1% de tensión y una frecuencia de 0 a 10 Hz. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente.

La gelatina y el gelMA se disolvieron en PBS hasta una concentración final del 15 %, respectivamente, y se mantuvieron a 37 °C para evitar la gelificación inducida por calor. La solución madre de carboximetilcelulosa al 1% (CMC, Shanghai Aladdin Biochemical Technology) enriquecida con 10 U/ml de transglutaminasas (200 U/g, Shanghai Yuanye Biotechnology) se mantuvo a 4ºC. Para los experimentos biológicos, todos los polímeros se disolvieron en su medio de cultivo correspondiente. A continuación, las soluciones de gelatina y gelMA se mezclaron en una proporción de 1:2 (v/v) para dar una mezcla de polímeros que contenía 5 % de gelatina y 10 % de gelMA (denominada solución de hidrogel), que luego se enriqueció con 0,5 % de LAP. fotoiniciadores (Shanghai Bide Pharmatech). Independientemente de la participación de las células, todas las soluciones de polímero se filtraron con jeringa (0,22 µm, filtros de jeringa Millex) antes de los experimentos de microfluidos. Todas las soluciones se cargaron en jeringas de plástico estériles de 1 ml. La solución de hidrogel se colocó a 37 °C y CMC a 4 °C.

Las gotas de núcleo-capa se generaron en un chip microfluídico de enfoque de flujo que se caracterizó con una altura de canal de 100 µm y una dimensión de unión de 150 × 150 µm (Fig. 2a complementaria). La solución de hidrogel y la CMC se desplazaron hacia el dispositivo mediante bombas de jeringa (TYD01-02, Lead Fluid) a través de los canales laterales y el canal central, respectivamente. En la unión del dispositivo, la CMC fue absorbida por la solución de hidrogel y juntos fueron cortados por el fluorocarbono Novec 7500 (3 M) que contenía tensioactivos Pico-surf al 0,1 % (v/v) (Sphere Fluidics) que actuaban como fase continua. Los caudales se controlaron mediante bombas de jeringa a 40, 8, 2 µL/min para aceite, solución de hidrogel y CMC, respectivamente. Como la concentración relativamente alta de la solución de hidrogel provocaba fácilmente la gelificación inducida térmicamente, se colocó una bolsa de agua caliente encima de las jeringas y el tubo se envolvió con una almohadilla térmica hecha a medida.

La formación de la primera red covalente fue catalizada por transglutaminasas independientes del calcio, donde la lisina y la glutamina se entrecruzaron mediante un nuevo enlace isopeptídico. Para reticular completamente las gotitas, se incubaron a temperatura ambiente durante la noche. Las gotitas curadas se desemulsionaron añadiendo 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol (PFO, Shanghai Bide Pharmatech) al 20 % (v/v) en Novec 7500 a la suspensión de microgel. Los microgeles se aglomeraron rápidamente, lo que facilitó la eliminación de la mayor parte de la fase oleosa, después de lo cual se centrifugaron a 2000 rpm (~280 × g) durante 10 min y se aspiró el aceite residual del fondo del tubo. A continuación, los microgeles se semiempaparon, es decir, los microgeles generados a partir de 1 h de funcionamiento con microfluidos (600 µl de fase dispersa) se resuspendieron directamente con 150 µl de PBS que contenía 0,5 % de LAP en tubos centrífugos mediante vórtice para producir una capacidad de impresión satisfactoria sin pérdida de microgeles. Para imprimir por extrusión andamios microscópicamente heterogéneos, microgeles de diferentes composiciones, por ejemplo, funcionalizados con diferentes fluoróforos o que contenían diferentes microbios, se mezclaron a fondo antes de la demulsificación.

Para imprimir microgeles por extrusión con una impresora 3D comercial (EFL-BP-6601, Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, China), los agregados de microgel se cargaron en un cartucho de impresión de 5 ml y se desgasificaron manualmente. La tinta de microgel atascada se depositó neumáticamente con una presión de impresión de ~50 kPa y una boquilla de impresión de 18 G (diámetro interior: 840 µm, sin ahusar, Nordson EFD). La velocidad de escritura fue manipulada por un brazo robótico y ajustada ad hoc para estar en sintonía con la velocidad de extrusión. Las formas de impresión se predefinieron en la interfaz de usuario proporcionada por el fabricante de la impresora 3D. Los andamios se imprimieron en un portaobjetos de vidrio limpio y se irradiaron durante 300 s con una luz azul de longitud de onda de 405 nm (intensidad de luz de 25 mW/cm2, Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, China), lo que dio como resultado andamios de microgel interconectados y estabilizados covalentemente . Para los andamios con la estrategia de entrecruzamiento inverso, las gotas primero se curaron con la radiación de luz azul durante 300 s, se desemulsionaron con PFO y se resuspendieron con una cantidad equivalente de PBS enriquecido con 10 U/g de transglutaminasas, antes de extruirse y moldearse en andamios y permitirse recocido entre microgeles durante 30 min en una placa de Petri sellada. Se generaron microgeles fluorescentes a partir de una mezcla de gelatina con gelMA marcado con fluoróforo (verde: ELF-GM-GF-60, rojo: ELF-GM-RF-60; Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, China).

Primero se generaron gotas de diferentes tamaños (Fig. 4a complementaria), donde la velocidad de flujo general de la fase dispersa se mantuvo constante, 10 µL/min, mientras que la de la fase continua se varió. Las gotas se recogieron en lotes cada 30 minutos y luego se incubaron a temperatura ambiente durante la noche, después de lo cual se demulsificaron con PFO y se resuspendieron con 75 µl de PBS que contenía LAP. Luego, los microgeles se centrifugaron a 10 000 rpm (~ 6900 × g) durante 5 min y se sedimentaron uniformemente en el fondo del tubo. La segunda red se formó por radiación de luz azul durante 300 s. Para digerir los andamios de PAM, se colocaron en capas 100 µl de tripsina (Beyotime Biotechnology) en la parte superior del andamio y se incubaron a 37 °C. Cada 15 min, el andamio restante se centrifugó a 10000 rpm (~6900 × g) durante 1 min y se aspiró el sobrenadante, seguido de la adición de 100 µl de tripsina fresca y la incubación. Para el hidrogel a granel, se mezclaron vigorosamente 240 µL de solución de hidrogel que contenía LAP al 0,5 % y 60 µL de CMC al 1 % enriquecidos con 10 U/ml de transglutaminasas y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche. Antes de la digestión proteolítica, el hidrogel a granel también se sometió a una radiación de luz azul de 300 s. Para los microgeles no recocidos, se generaron microgeles de tamaño mediano y se incubaron de la misma manera; antes de la desemulsión, la suspensión de microgeles se irradió con luz azul durante 300 s y, por lo tanto, los microgeles no se interconectaron para formar un andamio. Los pesos de los hidrogeles se calcularon restando el peso de los tubos vacíos y se normalizaron por el peso inicial de los hidrogeles:

La Escherichia coli DH5α utilizada en este trabajo portaba un plásmido de detección de quórum (pTetR-LasR-pLuxR-eGFp) que detecta la presencia de la molécula señal de N-(3-oxodecanoil)-L-homoserina lactona (3-Oxo-C12- HSL) e informes a través de la expresión de eGFP, que fue utilizada previamente en otro trabajo nuestro45. Medio Luria-Bertani (LB) (1 L): 10 g de triptona, 10 g de NaCl y 5 g de extracto de levadura. El pH de la solución se ajustó a 7,0 y se sometió a autoclave antes de su uso. Se subcultivaron E. coli en el medio LB antes de los experimentos de encapsulación.

Todos los polímeros se disolvieron en medio LB. Las células de E. coli transfectadas con eGFP se suspendieron en la solución de CMC al 1 % hasta una concentración celular final de OD = 0,1 para el cultivo celular (Fig. 3). Se generaron gotitas y se curaron inmediatamente mediante radiación de luz azul durante 300 s. Luego, los microgeles cargados de células se desemulsionaron y se resuspendieron con una cantidad excesiva de medio LB enriquecido con 10-6 mol/L de 3-Oxo-C12-HSL (Sigma-Aldrich) antes de la incubación a 37 °CE coli. el cultivo en microgeles sin núcleo-envoltura se llevó a cabo exactamente de la misma manera excepto que la fase que contenía células carecía de CMC. Se tomaron alícuotas de suspensiones de microgeles de 50 µl a las 0, 12 y 24 h y se tomaron imágenes con un microscopio de fluorescencia invertido (Olympus IX73).

La cantidad de células que se filtraron de los microgeles a su medio se determinó mediante experimentos de placas. Después de 24 horas de cultivo celular, se tomaron alícuotas de 100 µL de medio y se diluyeron 105, 106 y 107 veces, respectivamente, y luego se sembraron en placas de agar LB. La CFU se calculó después de 24 horas de inculcación a 37 °C cortando las colonias formadas en las placas. Los experimentos se realizaron por triplicado.

A549 y HEK 293 T eran del grupo Narita de la Universidad de Cambridge que se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, GibcoTM 31053044), complementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (FBS, GibcoTM A3160801), l-glutamina 2 mM (GibcoTM 25030024), piruvato de sodio 1 mM (GibcoTM 11360070 ) y penicilina-estreptomicina al 0,5% (v/v) (GibcoTM 15070063).

Todos los polímeros se disolvieron en el medio de cultivo celular. Se suspendieron células T HEK 293 (10 millones/ml) en la solución de CMC al 1 % antes de la encapsulación. Para la verificación del proceso de Poisson (Fig. 9 complementaria), las células A549 también se encapsularon como comparación. Las gotitas fueron generadas por el protocolo antes mencionado. Las gotas cargadas de células se curaron tras la recolección mediante radiación de luz azul de 300 s, se demulsificaron y se resuspendieron en DMEM, seguido de incubación a 37 °C y 5 % de CO2.

Los microgeles cargados de células se dividieron en alícuotas y se tomaron imágenes después de la encapsulación celular. El número de células en cada microgel se contó manualmente y se representó gráficamente la frecuencia. Para ajustar el modelo de estocasticidad de Poisson, se calculó el número promedio de células dentro de los microgeles y, por lo tanto, se pudo trazar el modelo teórico de Poisson:

Donde k representa el número observado de células encapsuladas en los microgeles core-shell y λ el número promedio de células encapsuladas en microgeles.

La viabilidad celular de HEK 293 T se evaluó utilizando el kit de tinción Live/Dead (Invitrogen). En los días 0, 3 y 6, se dividieron en alícuotas de 30 µL de suspensión de microgeles y se incubaron a 37 °C durante 30 min en un medio que contenía 4 µM de acetoximetilo de calceína (calceína AM) y 2 µM de homodímero-1 de etidio (EthD-1), antes de obtener imágenes por un microscopio de epifluorescencia Leica DMI6000B.

El crecimiento de esferoides se cuantificó por su área y circularidad, todo por el software FIJI. Específicamente, las imágenes de fluorescencia de dos canales, Live y Dead, se fusionaron y se umbralizaron en imágenes binarias, después de lo cual FIJI pudo medir directamente el área (A) y el perímetro (P) de los esferoides. La circularidad de los esferoides se calculó como:

Se tomaron alícuotas de suspensiones de microgel de 500 µl y se centrifugaron a 3500 rpm (~850 x g) durante 5 min y se aspiró el sobrenadante. Luego, los microgeles se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min con 100 µl de paraformaldehído al 4 % y se lavaron intensamente con PBS después de la incubación. A continuación, los microgeles se resuspendieron en 100 µL de PBS con Triton X-100 al 0,1 % (Fisher Bioreagents BP151-500, Thermo Fisher). Se agregaron soluciones madre de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich) y faloidina Alexa FluorTM 647 (Invitrogen) y se diluyeron por el factor de 1000 y 40, respectivamente, seguido de una incubación de 30 min a temperatura ambiente. temperatura. Finalmente, los microgeles se lavaron al menos dos veces y se resuspendieron en PBS. La visualización de la cultura basada en monocapa siguió el mismo protocolo. Se tomaron imágenes de la organización espacial de los núcleos y la actina f utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP8. Se recogieron canales Z cada 10 µm para la construcción de estructuras 3D de esferoides. La formación de imágenes de células monocapa se realizó mediante un microscopio de fluorescencia (Olympus IX73).

La levadura Saccharomyces cerevisiae se adquirió de Rapid Rise de Fleischmann y se activó en el medio YPD durante 12 horas antes de los experimentos de encapsulación celular. Medio YPD (1 L): extracto de levadura 10 g, peptona 20 g y dextrosa 20 g. Los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave antes de su uso.

Todas las soluciones de polímero se disolvieron en medio YPD. Se generaron gotitas de núcleo-envoltura cargadas de células con una levadura OD = 0,8 y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche para curarlas. Los andamios de celosía de 3 × 3 de dos capas (dimensión: aproximadamente 20 × 20 × 2 mm) se extruyeron a mano en un gabinete de seguridad biológica y se irradiaron con luz azul durante 300 s antes de la inmersión en 1,5 ml de medio YPD para la fermentación de etanol. Los medios se burbujearon con gas nitrógeno durante 5 min para eliminar el oxígeno y los viales de vidrio se sellaron durante la fermentación. Para generar microgeles con tamaños variados, se emplearon dos dispositivos de microfluidos y diferentes caudales. Los microgeles A y B de núcleo-capa se generaron con un dispositivo de enfoque de flujo con una dimensión de unión de 150 × 150 µm y una altura de canal de 100 µm. Los microgeles C de núcleo-capa se generaron con un dispositivo del mismo diseño pero con una dimensión de unión de 100 × 100 µm y una altura de canal de 75 µm. La relación de volumen entre la capa y la fase central se calculó como:

Donde R1 es el diámetro del microgel core-shell y R2 el núcleo, medido por el software FIJI.

Se tomaron alícuotas de 50 µL de medio cada 2 horas durante 12 horas y se centrifugaron a 10 000 rpm (~6900 × g) durante 5 min. El sobrenadante se filtró (0,22 µm) y se analizó por cromatografía de gases (GC, Agilent gc 6890n) utilizando una columna DB-1701 (Agilent, 30 m × 0,25 mm). La concentración de etanol se derivó de una curva estándar de etanol.

La microalga Chlorella vulgaris se adquirió de Shanghai Guangyu Biotechnology Co., Ltd y se subcultivó directamente. La bacteria Bacillus subtilis fue un regalo del laboratorio del Prof. Su Chen en la Universidad Tecnológica de Nanjing3. Antes de los experimentos de encapsulación, se cultivó Bacillus subtilis en medio LB a 37 °C y Chlorella vulgaris en medio BG11 (Qingdao Haibo Biotechnology) y se incubaron a 25 °C con una intensidad lumínica de ~10000 lux y ciclos de luz/oscuridad condiciones cada 12 h (MQT-60G, Shanghai Minquan Instrument). Recetas de medios para biorremediación: amoxicilina biorremediación: 300 mg/L de amoxicilina (Shanghai Yuanye Biotechnology) en el medio BG11. Biorremediación de naranja de metilo3: 100 mg/L de naranja de metilo (Shanghai Aladdin Biochemical Technology), 22,16 mg/L de NH4Cl, 6,57 mg/L de KNO3, 1,08 mg/L de NaNO2, 5,09 mg/mL de KH2PO4. Se disolvió amoxicilina/naranja de metilo en el resto de los medios respectivos después de la esterilización en autoclave, y los medios completos se filtraron con jeringa (0,22 µm) antes de los experimentos de microfluidos.

Todos los polímeros se disolvieron en los medios correspondientes sin amoxicilina/naranja de metilo. Se generaron gotas de núcleo-cáscara cargadas de células con OD = 0.4 para ambos microbios, respectivamente, y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche para curarlas. Los andamios de celosía de 3 × 3 de tres capas (dimensión: aproximadamente 20 × 20 × 3 mm) se extruyeron a mano en un gabinete de seguridad biológica y se irradiaron con luz azul durante 300 s antes de la inmersión en 6 ml de medio para la biorremediación (que contiene amoxicilina/naranja de metilo). para biorremediación, medio BG11 para experimento de biodegradación de andamios). Para imprimir andamios heterogéneos, los microgeles de núcleo y cubierta que encapsulan el monocultivo de bacterias o microalgas se mezclaron uniformemente antes de la demulsificación y se imprimieron juntos en andamios. Para andamios homogéneos, las suspensiones celulares se mezclaron a razón de 1:1 (v/v) antes de la encapsulación microfluídica. Los andamios se incubaron a 25 °C con una intensidad de luz de ~10 000 lux y ciclos de condiciones de luz/oscuridad cada 12 h para la biorremediación. La desintegración de andamios fue monitoreada cada 24 horas.

Se tomaron alícuotas de 150 µL de medio a las 6, 12, 18 y 24 h después de la incubación y se centrifugaron a 10 000 rpm (~6900 × g) durante 5 min. El sobrenadante se filtró con jeringa antes del análisis. La concentración de naranja de metilo se midió mediante un espectrofotómetro UV-Vis (UV-3600, Shimadzu) y se comparó con una curva estándar en los medios correspondientes. La concentración de amoxicilina se midió mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, LC-20AD, Shimadzu) equipada con una columna C18 (columna Waters SunFire C18, 5 µm, 4,6 × 250 mm) y se comparó con una curva estándar de amoxicilina en los medios correspondientes. La concentración de proteasas en los medios heterogéneos se midió usando un kit comercialmente disponible (D799673-0050, Sangon Biotech) y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Todas las cepas se obtuvieron del profesor Wenming Zhang de la Universidad Tecnológica de Nanjing60. Cepas: Hongo M. guilliermondii MG57: mgpdc-mgadh-scaro10-scgap-scaro80-mggdh. Los genes sobreexpresados ​​mgpdc, mgadh y mggdh eran de M. guilliermondii57, y scaro10, scgap y scaro80 eran de Saccharomyces cerevisiae58,59. Bacteria Escherichia coli YLC20: Escherichia coli W1485 que contiene plásmidos para la sobreexpresión del gen aroF y pheA y para la inactivación CRISPR/Cas9 del gen tyrA.

Solución salina 100× (en 1 L): 100 g NaCl, 50 g MgCl2·6H2O, 20 g KH2PO4, 30 g NH4Cl, 30 g KCl y 1,5 CaCl2·2H2O. La solución se sometió a autoclave antes de su uso. Solución de elementos traza (TES, en 1 L): 2 g Al2(SO4)3·18H2O, 0,75 g CoSO4·7H2O, 2,5 g CuSO4·5H2O, 0,5 g H3BO3, 24 g MnSO4·7H2O, 2,5 g NiSO4·6H2O, 15 g ZnSO4·7H2O y 3 g Na2MoO4·2H2O. Medio sintético (en 1 L): 3 g MgSO4, 3 g KH2PO4, 1 g NaCl, 5 g (NH4)2SO4, 0,015 CaCl2·2H2O, 0,1125 FeSO4·7H2O, 1 g citrato trisódico, 10 g extracto de levadura, 0,3 g l -tirosina, 0,5 g de base nitrogenada de levadura y 2,3 g de ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico. La solución se esterilizó en autoclave y luego se añadió con 45 g de glucosa esterilizada en autoclave por separado y 0,075 g de vitamina B1 y 0,04 g de sulfato de kanamicina filtrados con una jeringa de 0,22 µm. Después de eso, la solución salina 100X esterilizada en autoclave se añadió a la mezcla en una porción de 10 mL por 1 L de medio, junto con el TES esterilizado en autoclave 1,5 mL/L y el volumen de la mezcla se ajustó a 1 L para dar la mezcla sintética completa. medio.

Todos los polímeros se disolvieron en el medio sintético. Se generaron gotitas de núcleo y cubierta cargadas de células con OD = 0.5 para ambos microbios, respectivamente, y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche para curarlas. Los andamios de celosía de 3 × 3 de cinco capas (dimensión: ~ 0 × 20 × 5 mm) se extruyeron a mano en un gabinete de seguridad biológica y se irradiaron con luz azul durante 300 s antes de la inmersión en medios de 8 ml para la fermentación de 2-PE. Para la fermentación de 2-PE basada en cultivo líquido, para garantizar una carga celular equivalente, se dividieron en alícuotas la misma cantidad de CMC al 1 % que contenía ambos microbios (OD = 0,5 cada uno antes de mezclar uniformemente) y se incubaron junto con grupos de gotitas a temperatura ambiente durante la noche y se inocularon en 8 ml de medios sintéticos al mismo tiempo cuando se sumergieron los andamios. Los andamios homogéneos y heterogéneos se fabricaron de la misma manera que el anterior. Todos los andamios se incubaron a 37 °C durante las primeras 24 horas y se movieron a 30 °C desde el día 2 en adelante. Los andamios después de una fermentación por lotes, por ejemplo, los primeros 3 días, se sacaron con cuidado y se lavaron tres veces con medios frescos, antes de sumergirlos en medios frescos de 8 ml para su reutilización, lo que se repitió cada tres días durante tres rondas de reutilización en total. La concentración de 2-PE se midió después de cada lote. Se reutilizaron andamios heterogéneos y homogéneos.

La curva cinética de andamios heterogéneos se obtuvo a partir de 6 días de seguimiento de la concentración de 2-PE a intervalos de 24 horas. La comparación entre andamios heterogéneos, andamios homogéneos y cultivo líquido se realizó al final del día 3. Se dividieron en alícuotas de 150 µl de medio y se centrifugaron a 10 000 rpm (~6900 × g) durante 5 min. Los sobrenadantes se filtraron con jeringa (0,22 µm) antes del análisis. La concentración de 2-PE se midió por GC (Agilent gc 6890n) equipado con una columna DB-1701 (Agilent, 30 m × 0,25 mm) y se comparó con una curva estándar.

Todo el manejo de datos y el análisis estadístico se realizaron con Microsoft Excel 2019 y se trazaron con scripts de Python (v. 3.8.12) usando las bibliotecas NumPy (v.1.22.1) y Matplotlib (v.3.5.1). Los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres réplicas biológicas o se indica de otra manera en el manuscrito. Todas las imágenes fueron procesadas por FIJI-ImageJ (v 2.0.0-rc-69/1.52i) y se utilizó Adobe Illustrator 2019 para diseñar ilustraciones y seleccionar figuras.

Fotografías, es decir, Fig. 1c, Figs suplementarias. 6a, 16a son imágenes de presentación de andamios impresos. Micrografías de gotitas y microgeles, Figs. 1b, 3a, b, 2e, 4b y Suplementario 2b, 3a, b, 7a, 9a, 9c, son imágenes representativas de muestras en alícuotas aleatorias durante uno de los experimentos repetidos de forma independiente. Micrografías de andamios impresos, es decir, Figs. 1c, 2d, f y Figs. complementarias. 3c, 8a–c, son imágenes representativas de una estructura local de andamios que tenían una morfología similar. Toda la caracterización reológica se realizó por triplicado y la figura 2a, b y la figura complementaria 5a-e, g-i son gráficos de presentación de resultados similares. Los datos de esferoides celulares se generaron a partir de muestras de microgel en alícuotas aleatorias en un experimento y la Fig. 3f y la Fig. 10 complementaria son imágenes microscópicas confocales representativas de esferoides con estructuras celulares similares. Todos los experimentos de bioprocesamiento microbiano se realizaron por triplicado y la Fig. 13 complementaria es un conjunto representativo de imágenes del experimento de degradación del andamio realizado por el consorcio de microalgas y bacterias.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados en este estudio se proporcionan en el archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Rodrigo-Navarro, A., Sankaran, S., Dalby, MJ, Campo, A. & Salmeron-Sanchez, M. Engineered living biomateriales. Nato. Rev. Mater. 6, 1175–1190 (2021).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Shang, L., Shao, C., Chi, J. y Zhao, Y. Materiales vivos para la atención médica de por vida. Cuenta Mate. Res. 2, 59–70 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Él, F. et al. Materiales vivos biocatalíticos impresos en 3D con biotintas reforzadas de doble red. Pequeño 18, 1–9 (2022).

Artículo Google Académico

Qian, F. et al. Escritura directa de tintas vivas sintonizables para la intensificación de bioprocesos. Nano Lett. 19, 5829–5835 (2019).

Artículo ADS CAS Google Académico

Saha, A. et al. Fabricación aditiva de materiales vivos catalíticamente activos. Aplicación ACS. Mate. Interfaces 10, 13373–13380 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Johnston, TG et al. Microbios compartimentados y cocultivos en hidrogeles para bioproducción y conservación bajo demanda. Nat. común 11, 1–11 (2020).

Artículo Google Académico

Schaffner, M., Rühs, PA, Coulter, F., Kilcher, S. & Studart, AR Impresión 3D de bacterias en materiales complejos funcionales. ciencia Adv. 3, eaao6804 (2017).

Lutolf, MP & Hubbell, JA Biomateriales sintéticos como microambientes extracelulares instructivos para la morfogénesis en la ingeniería de tejidos. Nat. Biotecnología. 23, 47–55 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Chrisnandy, A., Blondel, D., Rezakhani, S., Broguiere, N. & Lutolf, MP Los hidrogeles dinámicos sintéticos promueven la organogénesis in vitro independiente de la degradación. Nat. Mate. 21, 479–487 (2022).

Artículo ADS CAS Google Académico

Gjorevski, N. et al. La geometría del tejido impulsa el patrón organoide determinista. Ciencia. 375, eaaw9021 (2022).

Duraj-Thatte, AM et al. Tinta microbiana programable para la impresión 3D de materiales vivos producidos a partir de nanofibras de proteínas modificadas genéticamente. Nat. común 12, 6600 (2021).

Huang, J. et al. Biopelículas de Bacillus subtilis programables e imprimibles como materiales vivos diseñados. Nat. química Biol. 15, 34–41 (2019).

Artículo ADS CAS Google Académico

Wang, Y. et al. Materiales vivos fabricados mediante mineralización en gradiente de biopelículas inducibles por la luz. Nat. química Biol. 17, 351–359 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Li, Y. et al. Materiales amiloides estampados que integran robustez y funcionalidad genéticamente programable. Nano Lett. 19, 8399–8408 (2019).

Artículo ADS CAS Google Académico

Tang, TC et al. Diseño de materiales por biología sintética. Nat. Rev.Mater. 6, 332–350 (2021).

Artículo ADS CAS Google Académico

Baker, BM & Chen, CS Deconstruyendo la tercera dimensión: cómo los microambientes de cultivo 3D alteran las señales celulares. J. ciencia celular. 125, 3015–3024 (2012).

CAS Google Académico

Mao, AS et al. Encapsulación determinista de células individuales en microgeles sintonizables delgados para el modelado de nicho y la administración terapéutica. Nat. Mate. 16, 236–243 (2017).

Artículo ADS CAS Google Académico

Zhao, X. et al. Microesferas inyectables fotorreticulables cargadas de células madre fabricadas con microfluidos para la generación rápida de construcciones de tejido osteogénico. Adv. Función Mate. 26, 2809–2819 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Griffin, DR, Weaver, WM, Scumpia, PO, Di Carlo, D. y Segura, T. Curación acelerada de heridas mediante andamios de gel microporoso inyectable ensamblados a partir de bloques de construcción recocidos. Nat. Mate. 14, 737–744 (2015).

Artículo ADS CAS Google Académico

Daly, AC, Prendergast, ME, Hughes, AJ y Burdick, JA Bioimpresión para el biólogo. Celda 184, 18–32 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Zhang, YS et al. Bioimpresión por extrusión 3D. Nat. Rev. Métodos Prim. 1, 75 (2021).

Daly, AC, Davidson, MD & Burdick, JA Bioimpresión 3D de modelos de tejidos heterogéneos de alta densidad celular a través de la fusión de esferoides dentro de hidrogeles autorregenerables. Nat. común 12, 1–13 (2021).

Artículo Google Académico

Skylar-Scott, MA et al. Biofabricación de tejidos específicos de órganos con alta densidad celular y canales vasculares incrustados. ciencia Adv. 5, eaaw2459 (2019).

Brassard, JA, Nikolaev, M., Hübscher, T., Hofer, M. y Lutolf, MP Recapitulación de la autoorganización tisular a macroescala mediante la bioimpresión de organoides. Nat. Mate. 20, 22–29 (2021).

Artículo ADS CAS Google Académico

Liu, Y. et al. Bioensamblaje de tubos de vía aérea lumenizados a macroescala de forma definida a través de patrones y fusión multiorganoide. Adv. ciencia 8, 1–11 (2021).

ANUNCIOS Google Académico

Krishna Kumar, R. et al. La impresión de gotas revela la importancia de la estructura a escala micrométrica para la ecología bacteriana. Nat. común 12, 1–12 (2021).

Artículo Google Académico

Ouyang, L. et al. Ampliación y optimización de las capacidades de bioimpresión 3D utilizando biotintas de red complementarias. ciencia Adv. 6, 1–14 (2020).

Artículo Google Académico

Wang, M. et al. Los biotintas molecularmente escindibles facilitan la bioimpresión basada en el procesamiento de luz digital de alto rendimiento de tejidos blandos volumétricos funcionales. Nat. común 13, 1–18 (2022).

ANUNCIOS Google Académico

Highley, CB, Song, KH, Daly, AC & Burdick, JA Tintas de microgel atascadas para aplicaciones de impresión 3D. Adv. ciencia 6, 1801076 (2019).

Duhoranimana, E. et al. Efecto de la carboximetilcelulosa de sodio en la formación de coacervatos complejos con gelatina: caracterización, estabilización y mecanismo de formación de coacervatos. Hidrocoll alimentario. 69, 111–120 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Xin, S. et al. Generalización de micropartículas de hidrogel en una nueva clase de biotintas para bioimpresión por extrusión. ciencia Adv. 7, 1–12 (2021).

Artículo Google Académico

Xu, Y. et al. Plantillas microfluídicas de microgeles de proteínas espacialmente no homogéneos. Pequeño 16, 1–9 (2020).

Artículo Google Académico

Loessner, D. et al. Funcionalización, preparación y uso de hidrogeles a base de metacriloilo de gelatina cargada de células como plataformas modulares de cultivo de tejidos. Nat. Protocolo 11, 727–746 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Daly, AC, Riley, L., Segura, T. & Burdick, JA Micropartículas de hidrogel para aplicaciones biomédicas. Nat. Rev.Mater. 5, 20–43 (2020).

Artículo ADS CAS Google Académico

Xu, Y. et al. Avances recientes en microgeles: de las biomoléculas a la funcionalidad. Pequeño 18, 2200180 (2022).

Zhang, J. et al. Hidrogeles granulares inyectables como microrreactores de ensamblaje coloidal para objetos coloreados estructurales personalizados. Angew. química En t. ed. 210046, 1–7 (2022).

Google Académico

Chai, N. et al. Construcción de construcciones impresas en 3D basadas en microgel microfluídico para la regeneración ósea. compos. Parte B Ing. 223, 109100 (2021).

Él, Y. et al. Investigación sobre la imprimibilidad de hidrogeles en bioimpresión 3D. ciencia Rep. 6, 1–13 (2016).

Google Académico

Levato, R. et al. De la forma a la función: el siguiente paso en bioimpresión. Adv. Mate. 32, e1906423 (2020).

Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, PA, Mooney, DJ y Shenoy, VB Efectos de la viscoelasticidad de la matriz extracelular en el comportamiento celular. Naturaleza 584, 535–546 (2020).

Artículo ADS CAS Google Académico

Liu, X., Inda, ME, Lai, Y., Lu, TK y Zhao, X. Hidrogeles vivos diseñados. Adv. Mate. (2022) https://doi.org/10.1002/adma.202201326.

Priya, G., Madhan, B., Narendrakumar, U., Suresh Kumar, RV y Manjubala, I. Evaluación in vitro e in vivo de andamios de carboximetilcelulosa para aplicaciones de ingeniería de tejido óseo. ACS Omega 6, 1246–1253 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Wang, H. et al. Generación en un solo paso de microgeles de metacrilato de gelatina de núcleo-cubierta (GelMA) utilizando un sistema microfluídico de gotas. Adv. Mate. Tecnología 4, 1–10 (2019).

Artículo Google Académico

Bhusari, S., Sankaran, S. & del Campo, A. Regulación del comportamiento bacteriano dentro de hidrogeles de viscoelasticidad sintonizable. Adv. ciencia 9, 1–10 (2022).

Artículo Google Académico

Zhao, S. et al. Un nuevo diseño para biosensores basados ​​en células vivas: microgeles con una cubierta selectivamente permeable que puede albergar especies bacterianas. Sens. Acutat. B. Química. 334, 129648 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Tang, TC et al. Biocontención de bacterias basada en hidrogel para detección y computación continuas. Nat. química Biol. 17, 724–731 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Sart, S., Tomasi, RFX, Amselem, G. & Baroud, CN Citometría multiescala y regulación de cultivos celulares 3D en un chip. Nat. común 8, 469 (2017).

Kyle, S. Impresión 3D de bacterias: la próxima frontera en biofabricación. Tendencias Biotecnología. 36, 340–341 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Liu, X. et al. Impresión 3D de materiales y dispositivos vivos y sensibles. Adv. Mate. 30, 1–9 (2018).

ANUNCIOS Google Académico

Pinheiro , LRS , Gradíssimo , DG , Xavier , LP & Santos , AV Degradación de colorantes azoicos: potencial bacteriano para la biorremediación . Sustain 14, 1–23 (2022).

Google Académico

Chandel, N. et al. Avances en los sistemas de biorremediación mediados por microalgas para la eliminación de antibióticos y productos farmacéuticos de las aguas residuales. ciencia Entorno Total. 825, 153895 (2022).

Artículo ADS CAS Google Académico

Kouzuma, A. & Watanabe, K. Explorando el potencial de las interacciones algas/bacterias. actual Opinión Biotecnología. 33, 125–129 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Chan, SS, Khoo, KS, Chew, KW, Ling, TC & Show, PL Avances recientes en biodegradación y biosorción de compuestos orgánicos de aguas residuales: consorcio de microalgas y bacterias: una revisión. Biorrecursos. Tecnología 344, 126159 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Yan, W. et al. El borrador de la secuencia del genoma de la cepa YLG18 de Meyerozyma guilliermondii, una levadura capaz de producir y tolerar altas concentraciones de 2-feniletanol. 3 Biotecnología 9, 1–5 (2019).

Artículo Google Académico

Kim, S., Kim, EM, Yamamoto, M., Park, H. & Shin, H. Ingeniería de esferoides multicelulares para ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Adv. Saludc. Mate. 9, 1–18 (2020).

Artículo Google Académico

Mazutis, L. et al. Análisis y clasificación de células individuales mediante microfluidos basados ​​en gotas. Nat. Protocolo 8, 870–891 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Yan, W. et al. Investigaciones exhaustivas de la producción de 2-feniletanol por Meyerozyma sp. cepa YLG18. enzima Microbio. Tecnología 140, 109629 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Wang, Z., Bai, X., Guo, X. & He, X. Regulación de enzimas cruciales y factores de transcripción en la biosíntesis de 2-feniletanol a través de la vía de Ehrlich en Saccharomyces cerevisiae. J. Ind. Microbiol. Biotecnología. 44, 129–139 (2017).

Artículo Google Académico

Hassing, EJ, de Groot, PA, Marquenie, VR, Pronk, JT & Daran, JMG Conexión del metabolismo del carbono central y de los aminoácidos aromáticos para mejorar la producción de novo de 2-feniletanol en Saccharomyces cerevisiae. metab. Ing. 56, 165–180 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Yan, W. et al. La síntesis de novo de 2-feniletanol a partir de glucosa por el consorcio microbiano sintético compuesto por ingeniería genética de Escherichia coli y Meyerozyma guilliermondii. Sintetizador ACS. Biol. 11, 4018–4030 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Zhu, H. et al. Microgeles cargados de esferoides con núcleo y cubierta reticulados en condiciones biocompatibles para sondear la comunicación entre el cáncer y el estroma. Adv. Res. NanoBiomed. 2, 2200138 (2022).

Artículo Google Académico

Descargar referencias

Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFC2104300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21901117, 32111530117) y el Laboratorio Estatal Clave de Ingeniería Química Orientada a Materiales (KL20-02) para ZY The Newman Foundation, Wellcome Trust, el Consejo Europeo de Investigación bajo el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) a través de ERC Grant PhysProt (Acuerdo No. 337969) a TPJK Cancer Research UK (CRUK) Cambridge Institute Core Grant (C9545/A29590) a MN; Premios CRUK Early Detection Pump Cebado (C20/A20976) a TK y MN Chinese Scholarship Council (YO y HZ).

chengzhi guo

Dirección actual: Departamento de Ingeniería Química, University College London, Torrington Place, Londres, WC1E 7JE, Reino Unido

Laboratorio Estatal Clave de Ingeniería Química orientada a Materiales, Facultad de Ingeniería Química, Universidad Tecnológica de Nanjing, 30 Puzhu South Road, Nanjing, 211816, PR China

Yangteng Ou, Yang Zhang, Chengzhi Guo y Ziyi Yu

Yusuf Hamied Departamento de Química, Universidad de Cambridge, Lensfield Road, Cambridge, CB2 1EW, Reino Unido

Yangteng Ou, Hongjia Zhu, Yanli Zhang y Tuomas PJ Knowles

Centro de Tecnología e Innovación de la Universidad de Cambridge-Nanjing, 126 Dingshan Street, Nanjing, 210046, PR China

Yangteng Ou

Laboratorio Estatal Clave de Ingeniería Química orientada a Materiales, Facultad de Biotecnología e Ingeniería Farmacéutica, Universidad Tecnológica de Nanjing, 30 Puzhu South Road, Nanjing, 211816, PR China

Shixiang Cao, Wei Yan, Fengxue Xin y Weiliang Dong

Cancer Research UK Cambridge Institute, Universidad de Cambridge, Cambridge, Centro Li Ka Shing, Robinson Way, Cambridge, CB2 0RE, Reino Unido

masashi narita

Laboratorio Cavendish, Universidad de Cambridge, JJ Thomson Avenue, Cambridge, CB3 0HE, Reino Unido

Tuomas PJ Knowles

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YO, TPJK y ZY concibieron y diseñaron los experimentos. YO realizó experimentos, seleccionó datos y escribió el manuscrito. SC, Yang Z., HZ y CG realizaron experimentos. WY y FX proporcionaron la información y las instrucciones sobre los experimentos con microorganismos modificados metabólicamente. MN proporcionó líneas de células de mamíferos e instalaciones de cultivo de tejidos. WD y Yanli Z. ayudaron con la revisión del documento. TK y ZY supervisó el proyecto y revisó el manuscrito. Todos los autores revisaron y aceptaron la versión final del artículo.

Correspondencia a PJ Knowles.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Jianhua Qin y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Ou, Y., Cao, S., Zhang, Y. et al. Bioimpresión de materiales vivos funcionales microporosos a partir de microgeles core-shell a base de proteínas. Nat Comun 14, 322 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35140-5

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Recibido: 10 junio 2022

Aceptado: 21 de noviembre de 2022

Publicado: 19 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35140-5

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