Estructura del fotosistema de cianobacterias I complejado con ferredoxina a una resolución de 1,97 Å

Oct 15, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 951 (2022) Citar este artículo

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El fotosistema I (PSI) es una bomba de electrones impulsada por la luz que transfiere electrones del citocromo c6 (Cyt c6) a la ferredoxina (Fd). La comprensión de este proceso de transferencia de electrones se ve obstaculizada por la escasez de detalles estructurales relacionados con la interfaz PSI:Fd y los posibles sitios de unión de Cyt c6. Aquí describimos la estructura crio-EM de alta resolución de Thermosynechococcus elongatus BP-1 PSI en complejo con Fd y un Cyt c6 débilmente unido. Las interacciones de la cadena lateral en la interfaz PSI:Fd, incluidas las moléculas de agua puente, se visualizan en detalle. La estructura explica las propiedades de los mutantes de PsaE y PsaC que afectan la cinética de la unión de Fd y sugiere un cambio molecular para la disociación de Fd tras la reducción. Los análisis termodinámicos basados ​​en calorimetría confirman un único sitio de unión para Fd y demuestran que la formación de complejos PSI:Fd está impulsada únicamente por la entropía. Se propone un posible ciclo de reacción para la transferencia eficiente de electrones desde Cyt c6 a Fd vía PSI.

La fotosíntesis oxigénica consiste en reacciones de luz y oscuridad, la primera de las cuales comienza con la absorción de fotones y conduce la cadena de transporte de electrones fotosintéticos que se origina en el agua hasta la proteína transportadora de electrones final, ferredoxina1 (Fd). Cuatro grandes complejos de proteínas de membrana, el fotosistema II2, el citocromo (Cyt) b6f3, el fotosistema I4 (PSI) y el complejo similar a NADH I5 (NDH-1) operan en la cadena de transporte de electrones dentro de la membrana tilacoide. La plastoquinona, la plastocianina (Pc), Cyt c6 y la ferredoxina (Fd) actúan como transportadores de electrones móviles para transportar electrones entre estos complejos de membrana. Estos transportadores de electrones forman complejos transitorios con sus socios redox. Los eventos de transferencia de electrones deben ser secuenciales, ocurrir con un alto grado de especificidad y de manera cinéticamente eficiente. En resumen, la tasa de transferencia de electrones es clave para el máximo rendimiento de la reacción electroquímica completa. La interacción intermolecular de moléculas orgánicas lipofílicas, plastoquinona o análogos de quinona, entre Photosystem II y Cyt b6f ha sido bien caracterizada por cinética6 y cristalografía de rayos X7. Sin embargo, las interacciones proteína-proteína de los transportadores de electrones solubles en agua Pc y Fd con Cyt b6f, PSI y NDH-1 son difíciles de estudiar debido al gran tamaño molecular de las estructuras dependientes de redox.

PSI ejecuta una separación de carga rápida impulsada por la luz para la transferencia de electrones a través de la membrana tilacoide8. Con una eficiencia cuántica cercana al 100%, PSI es el convertidor de energía más eficiente que se encuentra en la naturaleza9. Usando la energía de excitación canalizada hacia él por los pigmentos de antena circundantes en el centro de reacción PSI, la separación de carga se lleva a cabo en un par de moléculas de clorofila a/clorofila a' denominadas P7004. Luego, el electrón activado se transfiere a través de la cadena de transferencia de electrones (ETC) y se retransmite a través de los grupos [4Fe-4S] FA y FB al aceptor de electrones soluble en agua aguas abajo Fd en el lado del estroma10. El reductor fuerte Fd proporciona electrones a una variedad de reacciones posteriores, como la producción de NADPH, la asimilación de nitrógeno y azufre o la desaturación de ácidos grasos11. El P700 oxidado se reduce posteriormente por una proteína donadora de electrones luminal, Cyt c6 o Pc, iniciando la siguiente ronda de transferencia de electrones12. El PSI cianobacteriano es principalmente un homotrímero, aunque están presentes formas monoméricas13 o tetraméricas14. Cada protómero PSI comprende hasta 12 subunidades que albergan más de 100 grupos protésicos, que constituyen un tercio de la masa total del complejo15. La estructura de rayos X del PSI cianobacteriano trimérico de Thermosynechococcus elongatus (anteriormente Synechococcus elongatus) se determinó en 2001 con una resolución de 2,5 Å (PDB ID: 1JB04), y en 2018 la de Synechocystis sp. PCC 6803 también con una resolución de 2,5 Å (PDB ID: 5OY016). Más tarde, varias otras estructuras de PSI, incluido el PSI de tipo planta verde complejado con proteínas de clorofila captadoras de luz I (LHCI), se revelaron a una resolución más alta mediante cristalografía de rayos X y también mediante microscopía electrónica criogénica (crio-EM); a saber, PSI-LHCI de guisante a 2,4 Å (PDB ID: 7DKZ17), PSI-LHCI-LHCII (PDB ID: 7D0J18) de algas verdes y dos complejos PSI-LHCI de una diatomea a 2,38 y 2,4 Å de resolución (PDB ID : 6LY519, 6L4U20). Después de la revolución de la resolución21 en crio-EM, se publicaron dos estructuras crio-EM más de PSI de cianobacterias con una resolución ligeramente mayor; a saber, PSI trimérico de Halomicronema hongdechloris C2206 a 2,35 Å (ID de PDB: 6KMW22), y PSI tetramérico de una Anabaena sp que forma heterocistos. PCC7120 a 2,37 Å (ID de PDB: 6K6114).

Para comprender mejor el mecanismo de transferencia de electrones transmembrana relacionado con PSI, se aplicaron varios métodos, como la cocristalización o la reticulación química, a PSI con su(s) socio(s) de transferencia de electrones. Fd:PSI se cristalizó en 2002, a pesar de ser un complejo de transferencia de electrones no covalente23. En 2018, nuestro grupo informó de la primera estructura de rayos X de un complejo Fd:PSI con una resolución de 4,2 Å24. La estructura confirmó los sitios de unión a Fd en el lado del estroma de PSI, que se sugirieron previamente mediante mutagénesis dirigida al sitio25 y análisis cinético26. En esta estructura de rayos X Fd:PSI, se utilizó ferredoxina sustituida con galio (Ga-Fd), cuya estructura proteica es idéntica a la del Fd27 nativo, para fijar el estado redox del Fd unido a la forma oxidada incluso cuando se ilumina con luz. . Recientemente, se han informado varias estructuras complejas de transferencia de electrones no covalentes de PSI determinadas por crio-EM, como PSI:Fd (ID de PDB: 7S3D28), complejo PSI-IsiA con flavodoxina unida (ID de PDB: 6KIF29) y el triple complejo de Pc:PSI-LHCI:Fd (PDB ID: 6YEZ30). Sin embargo, la baja resolución local de las proteínas transportadoras móviles unidas impidió un análisis detallado a nivel de residuos, excepto para el supercomplejo Pc:PSI-LHCI a 2,74 Å (PDB ID: 6ZOO31) para el modo de unión del donante de electrones luminal Pc. A pesar de los extensos esfuerzos32 para visualizar el complejo de transferencia de electrones de PSI:Cyt c6, hasta el momento no se ha informado de la estructura de rayos X ni crio-EM del complejo PSI:Cyt c6.

Se requieren estructuras de mayor resolución de PSI junto con sus donantes y aceptores de electrones bajo un estado redox controlado para comprender mejor las interacciones proteína-proteína involucradas en el sistema de retransmisión de electrones. Aquí, junto con las mediciones termodinámicas de la unión de Fd a PSI, describimos la estructura de la cianobacteria PSI de Thermosynechococcus elongatus BP-1 unida con sus socios de transferencia de electrones Fd y Cyt c6 analizada por crio-EM de una sola partícula a una resolución general de 1,97 A.

La muestra de trímero PSI purificada se optimizó para crio-EM de una sola partícula mediante el intercambio de detergente a GDN33 y la eliminación del exceso de detergente libre mediante GraDeR34, lo que produjo una preparación altamente homogénea a alta concentración (Fig. 1a, b complementarias). En el primer paso, se optimizaron los parámetros para la preparación de la crio-red para obtener imágenes de alta resolución del trímero PSI solo. Se observaron un espesor de hielo y una distribución de partículas óptimos a una concentración de proteína trímera PSI de 30 mg/ml, mientras que la calidad de la criorrejilla se deterioró a valores por debajo o por encima de esta concentración. En un segundo paso, se añadió Ga-Fd al pH ligeramente básico de 8,0 y una relación molar de 1,0:1,1 (PSI:Fd)27 previamente optimizado para el crecimiento de cristales, mientras que el rendimiento insuficiente para la purificación de Cyt c6 limitó su relación molar a 1,0:0,4 (PSI:Cyt c6), lo que da como resultado una relación molar de 1,0:1,1:0,4 (PSI:Fd:Cyt c6) para la mezcla triple utilizada para la preparación final de la criorrejilla. Todo el cribado de la crio-red se realizó utilizando un crio-TEM de 200 kV (Talos Arctica, TFS). Las crio-redes que exhibían grandes áreas de espesor de hielo vítreo adecuado con alta densidad de partículas (Fig. 2b complementaria) se transfirieron luego a un crio-TEM de 300 kV equipado con un FEG frío, un filtro de energía en columna Ω y un detector de electrones directos K3 (CRYO BRAZO 300, JEOL; Gatán). El procesamiento de imágenes en Relion 3.135 (Fig. 2 complementaria) arrojó un mapa de densidad 3D final calculado a partir de 207 142 partículas con una resolución general de 1,97 Å, que tenía la calidad suficiente para visualizar las densidades de la cadena lateral y las moléculas de agua en la interfaz de unión PSI:Fd . La Tabla complementaria 1 describe las estadísticas de recopilación, refinamiento y validación de datos crio-EM. Ambos mapas posprocesados ​​con simetría C3 y C1 se depositaron en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB36, número de acceso: EMD-31605). Las imágenes sin procesar se cargaron en el Archivo de imágenes públicas de microscopía electrónica (EMPIAR37, número de acceso: EMPIAR-10928).

Visto a lo largo del plano de la membrana, el trímero PSI unido a Fd se asemeja a la forma de una hoja de trébol con un diámetro de ~200 Å y una masa total de 1110 kDa (Fig. 1). Debido a que no se identificaron diferencias significativas entre el mapa de densidad no simetrizado (C1) a 2,07 Å y el mapa simetrizado (C3) a 1,97 Å de resolución, se utilizó este último mapa para la construcción del modelo atómico. La estructura cristalina de PSI resuelta a una resolución de 2,5 Å (PDB ID 1JB04) y la de Fd resuelta a una resolución de 1,5 Å (PDB ID 5AUI27) de T. elongates se utilizaron como modelos de referencia. Nuestro modelo (ID de PDB: 7FIX) del complejo PSI:Fd se refinó contra el mapa de densidad final determinado a 1,97 Å con simetría triple estricta (C3) (Fig. 3 complementaria). En nuestro modelo, se incluyeron las 12 subunidades de cada protómero PSI de T. elongatus (PsaA, PsaB, PsaC, PsaD, PsaE, PsaF, PsaI, PsaJ, PsaK, PsaL, PsaM y PsaX), además de tres Fd igualmente unidas en el lado estromal del trímero PSI a PsaA, PsaC y PsaE. Una vista de primer plano (Fig. 1a) muestra el modelo atómico de Fd unido a PSI, que se ajusta bien al mapa de densidad correspondiente. El grupo [2Ga-2S] de Fd y el grupo [4Fe-4S] de FB en la subunidad PsaC, dibujados en estilo bola y palo, se colocaron a una distancia de borde a borde de 8,9 Å.

El modelo complejo de trímero PSI unido a Fd en simetría C3 se muestra con cada uno de los tres protómeros en una superficie gris o una superficie coloreada por las cadenas de subunidades (PsaA-azul, PsaB-rojo, PsaC-púrpura, PsaD-azul claro, PsaE (verde, PsaF-amarillo, PsaI-púrpura oscuro, PsaJ-verde oscuro, PsaK-rojo rosado, PsaL-blanco, PsaM-naranja, PsaX-rosa, Fd-cian) o coloreados en un estilo de dibujos animados. Los ligandos se presentan en forma de esfera y palo por separado, coloreados según el elemento. una vista de primer plano de la interfaz de unión de ferredoxina (Fd) y el mapa de densidad correspondiente para Fd. b Cadenas de acilo de lípidos modeladas entre protómeros PSI y su mapa de densidad correspondiente.

La figura complementaria 4a muestra la resolución local del mapa de densidad tanto en vista superior como lateral. Para cada protómero de PSI en el lado luminal del trímero de PSI en el lado de PsaB que mira hacia la membrana y en las proximidades de la región N-terminal de PsaF se observó una densidad globular en un umbral de mapa similar al del cinturón de detergente circundante de PSI. Las posiciones y características de las tres densidades son idénticas, ya estaban presentes en el modelo de novo inicial (Fig. 2e complementaria), y lo más probable es que provengan de Cyt c6 débilmente unido. Estas tres densidades no mejoraron en resolución o definición local cuando se sometieron a clasificación y refinamiento 3D enmascarado. El modelado de cuerpo rígido de la estructura cianobacteriana Cyt c6 utilizando Phenix38 mostró que la densidad era de un tamaño suficiente para Cyt c6 (Fig. 4b, c complementarias). No obstante, la ambigüedad de su orientación nos llevó a no modelar el complejo ternario de Fd:PSI:Cyt c6 en nuestras coordenadas atómicas finales (7FIX) que se muestran en la Fig. 1.

El modelo completo contiene un total de 39 cadenas polipeptídicas, 285 clorofila a, tres clorofila a′, 72 β-carotenos, seis filoquinonas, nueve grupos de hierro-azufre [4Fe-4S], tres iones Ca2+, nueve fosfatidilgliceroles, tres digalactosildiacilgliceroles, 348 moléculas de agua y 51 lípidos construidos sin un grupo principal para PSI, y tres polipéptidos y tres grupos [2Ga-2S] para Fd. Las diferencias notables con nuestros modelos de referencia incluyeron la identificación del lípido II previamente modelado con monogalactosildiacilglicerol como digalactosildiacilglicerol, la extensión de las cadenas de acilo del lípido IV y un cambio del residuo 143 de PsaL de una leucina a una serina, que ahora coincide con la entrada del banco de datos de secuencia primaria para PsaL (UniProtKB - Q8DGB4). Nuestro mapa nos permitió ampliar las regiones terminales en 39 residuos de aminoácidos, a saber, Lys11–Val12, Gly263–Ile265 en PsaA, Gly740 en PsaB, Thr5–Val19, Ala33, Pro44–Phe54, Gln78–Leu83 en PsaK y Glu3 en PsaL . No observamos ninguna densidad para una clorofila unida a PsaM (CLA 1601 en 1JB0), que no estaba incluida en nuestro modelo. Además, dos densidades en PsaK y PsaA se modelaron parcialmente como los β-carotenos BCR102 de PsaK y BCR855 de PsaA recientemente identificados. Sin embargo, dado que ambas densidades no muestran protuberancias de metilo de cadena de polieno claras, no podemos descartar que estas densidades se originen en otras especies moleculares similares, como los lípidos. Además, se identificó una nueva clorofila en PsaJ y se incluyó en nuestro modelo como PsaJ CLA1307. Finalmente, se podría incorporar un total de 17 nuevas cadenas de acilo de lípidos para cada interfaz monómero-monómero en nuestro modelo (Fig. 1b). Todas las adiciones y modificaciones se presentan en la Fig. 5 complementaria junto con mapas y modelos representativos (Fig. 6 complementaria).

Todos los componentes del ETC, incluido [2Ga-2S] de Fd, así como sus mapas de densidad excluyendo el hemo de Cyt c6, se presentan en la Fig. 2 con sus distancias intermoleculares calculadas como centro a centro (P700 a filoquinona) o borde a borde (filoquinona a Fd [2Ga-2S]). Las ramas A y B del ETC están compuestas por dos moléculas de clorofila a y una de filoquinona estrechamente apiladas ubicadas equidistantes (8,9 Å) del grupo FX [4Fe-4S], que está coordinado tanto por PsaA como por PsaB. PsaC alberga los grupos [4Fe-4S] FA y FB, los dos últimos componentes del ETC, de los cuales FB es el aceptor de electrones final y el punto de transferencia de electrones a los aceptores de electrones solubles acoplados, Fd o Flavodoxin (Fld). La alta resolución local de nuestro mapa de densidad PSI:Fd nos permitió medir distancias de cofactores en el ETC con un buen grado de confianza. Las distancias de borde a borde observadas entre las filoquinonas y los tres grupos [4Fe-4S] concuerdan bien con las determinadas previamente en la estructura cristalina de rayos X de 2,5 Å (PDB ID: 1JB0). La distancia de 8,9 Å entre FB y [2Ga-2S] de Fd es lo suficientemente corta para hacer un túnel de electrones eficiente y coincide con las distancias que se encontraron en el supercomplejo PSI-IsiA-Fld29. Además, esta distancia también es equivalente a la media de las tres distancias diferentes observadas en nuestra estructura cristalina de rayos X PSI:Fd anterior24.

Las distancias entre los cofactores se midieron 'de centro a centro' desde los átomos de magnesio de las clorofilas vecinas hasta el centro de los anillos de carbonilo de filoquinona para la rama A y la rama B (líneas discontinuas) o 'de borde a borde' entre las filoquinonas. y grupos de hierro-azufre (líneas sólidas).

En nuestra estructura, tres moléculas de Fd están fuertemente unidas al lado del estroma del trímero PSI. Incluso en el mapa contorneado a un nivel de densidad cercano al ruido, no se puede discernir ninguna densidad adicional indicativa de moléculas de Fd adicionales unidas a otros sitios estromales de PSI. Cada molécula de Fd se une a un protómero PSI de forma idéntica haciendo un estrecho contacto con las subunidades PsaA, PsaC y PsaE, mientras que no se pudo encontrar interacción directa con PsaD o PsaF. La resolución local de ~2,5 Å y las características de mapa bien definidas en la interfaz PSI:Fd nos permitieron modelar cadenas laterales de aminoácidos y varias moléculas de agua con confianza. Los residuos de aminoácidos y las moléculas de agua involucradas en la interacción directa en la interfaz PSI:Fd se definieron usando el programa DIMPLOT de la suite LigPlot+39, 40. Según el análisis DIMPLOT, un total de 18 residuos dentro de las subunidades PSI (Arg36, Arg40, Thr60 de PsaA; Ile11, Gly12, Gln15, Arg18, Lys34, Ala35, Ala56, Pro58 de PsaC; Arg3, Ile37, Arg39, Ser53, Asn56 , Thr57, Asn59 de PsaE) y 20 residuos dentro de Fd (Ser60, Asp61, Asp67, Ile70 de PsaA; Phe38, Ser39, Cys40, Ala44, Cys45, Thr47, Phe64, Tyr97 de PsaC; Glu23, Tyr24, Asp27, Glu31, Cys40 , Arg41, Ala42, Ser63 de PsaE) se identificaron como involucrados en las interacciones de unión (Fig. 3 y Fig. 7 complementaria). Cuatro residuos (Glu23, Asp27, Phe38, Thr47) en Fd se identificaron recientemente como involucrados en la interacción de unión, mientras que cuatro residuos de Fd previamente asignados para interactuar con PSI (Gln62, Asp66, Glu71, Tyr81)24 no se encontró que hacerlo en este estudio. Se identificaron un total de seis moléculas de agua puente (HOH202 a Fd:PsaA, HOH203, HOH204, HOH205 a Fd:PsaC, HOH101, HOH201 a Fd:PsaE) cerca de la superficie de unión, lo que ofrece posibles enlaces de hidrógeno entre PSI y Fd. En la Fig. 4 se presenta una comparación de los resultados de la cristalografía de rayos X, la saturación cruzada transferida por RMN y este estudio sobre la cuestión de qué residuos de Fd interactúan con PSI al unirse.

Cada interfaz involucrada en la encuadernación se presenta por separado en estilo de libro abierto. Se marcan los residuos de aminoácidos que interactúan directamente y las moléculas de agua. a, b para Fd:PsaA, c, d para Fd:PsaC, e, f para Fd:PsaE. Los residuos recién identificados involucrados en la interacción están marcados en rojo. Todas las superficies de las proteínas están coloreadas según el potencial electrostático (positivo en azul, negativo en rojo).

Los residuos interactivos se determinaron mediante una difracción de rayos X PSI:Fd cocristalizada (PDB ID: 5ZF024), b Cryo-EM (este estudio) y c RMN transferida por saturación cruzada. Los residuos únicos determinados por cada método se destacan mediante las etiquetas correspondientes (se omitieron los residuos en el lado dorsal).

En la Fig. 5 se muestran dos interfaces de unión PSI:Fd importantes. Se identificaron un par de interacciones catión-π entre Phe38 de Fd con Lys34 de PsaC y Arg41 de Fd (Fig. 5a). Arg39 de PsaE, que interactúa con Arg41 de Fd a través de interacciones hidrofóbicas, realiza interacciones adicionales con Asp27 y Tyr24 de Fd. El residuo Gln15 de PsaC forma el mayor número de interacciones intermoleculares entre PSI y Fd, y puede estar estratégicamente situado en la vecindad de los grupos de donación y aceptación de electrones (Fig. 5b). Gln15 de PsaC participa en interacciones hidrofóbicas con Cys45 y Phe64 de Fd y también forma un enlace de hidrógeno con Ala44. Además, a través de un enlace de hidrógeno con HOH205, Gln15 de PsaC está conectado al Tyr97 C-terminal de Fd. Tyr97 a su vez hace una interacción catión-π con Arg18 de PsaC. Tyr97 de Fd exhibe una densidad bien definida, lo que es sorprendente dada la flexibilidad conocida del extremo C (Fig. 8 complementaria), lo que indica fuertes interacciones entre Fd Tyr97 y PsaC.

un nexo de interacciones que contribuyen a la afinidad de unión de PSI con Fd. Se destacan los residuos cruciales de PSI Lys34 de PsaC y Arg39 de PsaE y sus respectivos socios de unión a Fd. PsaC en cinta morada, PsaE en cinta verde, Fd en cinta cian y sus átomos de cadena lateral de residuos que interactúan en bola y palo con su densidad correspondiente en silueta. b Centro de interacciones alrededor de Gln15 de PsaC y con Cys45, Phe64 y Tyr97 de Fd. Estos residuos sufren un cambio conformacional tras la reducción de Fd. PsaC en cinta morada, Fd en cinta cian y residuos que interactúan con átomos de cadena lateral en bola y palo con su densidad correspondiente en silueta. El agua interfacial 205 se muestra como una bola roja. El grupo de hierro-azufre FB de PSI y el grupo de galio-azufre de Fd se representan en formato de bola y palo.

Para visualizar los cambios estructurales dinámicos tras la formación de complejos entre PSI y Fd, utilizamos "modevectors" de secuencias de comandos de Python que se ejecutan en el sistema de gráficos moleculares PyMOL (versión 2.3.2, Schrödinger, LLC). En la Fig. 6, los modelos atómicos de PSI antes (PDB ID: 1JB0) y después de la unión a Fd (estudio actual, PDB ID: 7FIX) se superpusieron en función de las posiciones de carbono α del heterodímero PsaA/PsaB estable. Los desplazamientos de carbonos α >0,7 Å antes y después de la formación del complejo se destacan con puntas de flecha para un protómero. Debido a que las cadenas laterales individuales pueden estar involucradas en el empaquetamiento de cristal para las estructuras de rayos X de PSI o Fd, intencionalmente usamos las posiciones de carbono α de las estructuras de la cadena principal para las comparaciones y los modelos de bastón Cα sin cadenas laterales se muestran en la Fig. 6 El análisis muestra que las perturbaciones causadas por la unión de Fd y la presencia de Cyt c6 no se limitan al lado estromal, sino que también se propagan al lado luminal. Al comparar el modelo atómico de Fd en nuestra estructura compleja (PDB ID: 7FIX) con el modelo atómico de Fd libre (PDB ID: 5AUI27) al mostrar desplazamientos de> 0.7 Å en el carbono α (Fig. 6c), encontramos que la región proximal del grupo permaneció imperturbable, mientras que tres regiones distales (en círculos discontinuos) sufrieron cambios estructurales después de unirse a PSI.

a, b, d La unión de Fd indujo desplazamientos estructurales en un protómero PSI desde tres puntos de vista diferentes. El modelo atómico de PSI libre de Fd (PDB ID: 1JB04) se superpuso con nuestro modelo de PSI:Fd (PDB ID: 7FIX) basado en las coordenadas de la columna vertebral Cα del heterodímero PsaA/PsaB. Las flechas rojas representan desplazamientos superiores a 0,7 Å. c Desplazamientos estructurales de Fds en estado libre y vinculado a PSI. El modelo atómico de Fd no unido (PDB ID: 5AUI27, coloreado en naranja) se superpuso con Fd unido a PSI (coloreado en cian). Las flechas rojas resaltan los desplazamientos de la cadena principal más allá de 0,7 Å.

Se realizaron mediciones de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para obtener parámetros termodinámicos para la interacción entre Ga-Fd y el trímero PSI. Para evitar la posible interferencia de las micelas de detergente libre con las mediciones ITC41, las muestras del trímero PSI se prepararon utilizando el enfoque GraDeR34 como se hizo para la crio-EM de una sola partícula. Los resultados representativos de los termogramas de ITC, la isoterma de unión de las interacciones entre Ga-Fd y el trímero PSI y los parámetros termodinámicos se muestran en la Fig. 7 y la Tabla 1. Los análisis de ITC demuestran que el valor de la estequiometría de unión es ~3 (2,9 ± 0,2) , lo que indica que Fd está unido a cada protómero PSI en una proporción de 1:1; lo cual está de acuerdo con nuestro mapa de densidad crio-EM. El valor de Kd estaba en el orden submicromolar (758,0 ± 123,5 nM), lo que sugiere que la afinidad interproteica entre Ga-Fd y PSI es fuerte. Una serie de valoraciones de Ga-Fd a trímero PSI generó picos de ITC positivos seguidos de una saturación gradual (Fig. 7a), lo que indica las interacciones intermoleculares endotérmicas entre Ga-Fd y PSI. En general, las interacciones Fd-PSI mostraron un valor ΔH positivo termodinámicamente desfavorable (1,1 ± 0,1 kcal/mol) y un valor TΔS positivo favorable más fuerte (9,5 ± 0,1 kcal/mol), lo que demuestra que la formación de complejos está impulsada por la entropía.

a Resultados representativos de termogramas de ITC, b La isoterma de unión ajustada utilizando un conjunto de sitios.

Nuestra estructura crio-EM del complejo PSI:Fd se basa en un mapa de densidad con una simetría rotacional triple estricta con una resolución general de 1,97 Å. La resolución mejorada podría ser el resultado de cuatro factores: (i) pureza y homogeneidad excepcionales de nuestra preparación de PSI a alta concentración, (ii) un estado redox estrictamente controlado del complejo transitorio de transferencia de electrones PSI:Fd y la presencia de Cyt c6 ( iii) preparación optimizada del complejo de proteína de membrana utilizando el método GraDeR, y (iv) uso de un microscopio crioelectrónico avanzado CRYO ARM 300 equipado con una pistola de emisión de campo frío, un filtro de energía Ω en columna y una cámara de detección directa K3 ( JEOL, GATÁN). Un hallazgo digno de mención de nuestro mapa crio-EM de alta resolución es la visualización de varias densidades en forma de barra entre cada protómero PSI (Fig. 1b y Fig. 5 complementaria), lo que indica un empaque estable y específico de las colas de lípidos. Aunque las membranas de los tilacoides contienen varios lípidos, incluidos PG, MGDG, DGDG y SQDG42, la estructura original de rayos X de 2,5 Å4 solo describía tres fosfolípidos y un galactolípido unidos internamente a las subunidades principales PsaA y PsaB. En total, se encontraron diecisiete colas de ácidos grasos recientemente identificadas en nuestra estructura a pesar de excluir densidades ambiguas que no podían distinguirse claramente de las cadenas de fitol de clorofila o que eran demasiado cortas o no perpendiculares al plano de la membrana. Estos lípidos interprotómeros recién encontrados no se asignaron a tipos específicos debido a la falta de densidades de grupos de cabeza, lo que indica su movilidad. Las colas de ácidos grasos visibles estaban fuertemente unidas a residuos de aminoácidos hidrofóbicos y ligandos de antena (clorofilas y carotenoides), lo que implica su función potencial para estabilizar la trimerización de PSI. Estos hallazgos explican las discrepancias entre el número de lípidos asociados determinados por análisis estructurales y bioquímicos43. De hecho, nuestros hallazgos sugieren una función adicional de los lípidos en el endurecimiento estructural de la interfaz del protómero para permitir la formación estable de PSI oligomérico y acomodar los ligandos de antena que sobresalen, especialmente en la región entre los protómeros. Hasta la fecha, estos aspectos solo han sido considerados en detalle para la estructura del PSII2, 44.

En este documento, describimos la estructura crio-EM de alta resolución de PSI de cianobacterias en presencia de Fd oxidado y Cyt c6 reducido. La muestra para la determinación estructural se preparó mezclando las tres proteínas sin reticulación y solo mediante una breve incubación en la oscuridad antes de la preparación de la crio-rejilla. Además, utilizamos Fd sustituido con galio (Ga-Fd), que es estructuralmente idéntico al Fd oxidado de tipo salvaje pero no se puede reducir27, 45. El estado redox uniforme resultante en el lado del aceptor de PSI elimina la posibilidad de reacciones redox inesperadas. entre Fd y PSI provocada por la absorción de luz. Por lo tanto, el estado redox del complejo era el de PSI justo antes de la transferencia de electrones de PSI a Fd. En este estudio, pudimos visualizar densidades adicionales débiles, sin embargo, para los tres protómeros PSI colocados de manera idéntica en la vecindad de la región N-terminal de PsaF asignada a Cyt c6 (Fig. 4b, c complementaria) que ya estaban claramente presentes en el Modelo inicial 3D de novo de nuestra estructura crio-EM (Fig. 2e complementaria). La muy baja resolución local podría ser consecuencia de la baja estequiometría de 1,0:0,4 (PSI:Cyt c6) en la mezcla utilizada para la preparación de la crio-red. Sin embargo, la visualización fallida que se intentó anteriormente para Cyt c6 unida al trímero PSI de T. elongatus en la estequiometría de PSI:Cyt c6 mucho más alta de 1:10 en condiciones de tampón reductor y en presencia de reticulador32 sugiere que la estequiometría y el estado redox de el búfer de muestra por sí solo podría no ser suficiente para explicar el único nivel cercano al ruido de la densidad luminal extra detectada aquí.

Sorprendentemente, Cyt c6 no se encontró cerca del aceptor de electrones primario de P700 en PSI (distancia de centro a centro P700 a Cyt c6 ~ 55 Å), pero a una distancia suficiente para evitar la transferencia productiva de electrones. Aunque la falta de resolución local impidió la determinación de la orientación de Cyt c6, creemos que el sitio en sí es un sitio de unión secundario fisiológicamente relevante para Cyt c6 que difiere claramente del de la plastocianina visualizada en la estructura PSI:Pc recientemente informada (PDB número de identificación: 6ZOO31). En la estructura de PSI:Pc, se encontró que Pc se unía a la superficie hidrofóbica creada por las subunidades PsaA y PsaB, y la extensión N-terminal de PsaF específica para la planta vacuolar colocó a Pc cerca de P700 lo suficientemente cerca para la transferencia productiva de electrones. Debido a que las cianobacterias no contienen una extensión N-terminal de la subunidad PsaF para la unión productiva de Pc/Cyt c646, parece poco probable que las cianobacterias Cyt c6 se unan a una posición similar a la de las plantas superiores. Los intentos anteriores de visualizar PSI con Cyt c6 unida mediante entrecruzamiento no tuvieron éxito32 y, hasta donde sabemos, las densidades crio-EM de Cyt c6 en nuestro estudio son la primera visualización experimental de Cyt c6 unida a PSI en este sitio periférico no productivo.

¿Cuál podría ser la función fisiológica de este sitio de unión de Cyt c6 recién descubierto? El sitio de unión de Cyt c6 es claramente diferente del sitio de unión productivo de Pc/Cyt c6. Los resultados del análisis cinético de transferencia de electrones de algas verdes y plantas superiores indicaron características bifásicas46, 47: una fase de transferencia de electrones rápida relevante para la reducción de P700; y una fase lenta responsable del tiempo de difusión de Pc/Cyt c6 en el espacio luminal a los centros de reacción PSI. La base estructural de esta cinética bifásica se asignó a la extensión N-terminal rica en Lys de PsaF de algas verdes46. Recientemente, una estructura crio-EM de PSI de Chlamydomonas reinhardtii mostró una densidad adicional en el lado luminal del complejo que sugiere una unión no productiva de Pc48. Esta región adicional ofrece sitios de interacción electrostática a las proteínas donantes de electrones, lo que desempeña un papel clave para guiarlas hacia el centro de reacción P700. El resultado de la reticulación heterogénea y las características cinéticas indicaron la existencia de sitios de unión tanto productivos como no productivos49. La prueba de entrecruzamiento50 realizada en Chlamydomonas reinhardtii dio un resultado similar. Específicamente, solo el 33% de Cyt c6 realizó una transferencia de electrones rápida a P700, mientras que el otro 67% de reticulación inactiva indicó la existencia de un sitio de unión adicional potencial. Dichos sitios de unión no productivos pueden estar demasiado lejos de P700 para la transferencia de electrones, pero no obstante, garantizan un suministro continuo y rápido de donantes de electrones. Una posible función del sitio de unión de Cyt c6 visualizado aquí podría ser un sitio de unión no productivo, análogo al que se encuentra en las plantas vasculares.

Se cuestionó la existencia de la reacción de dos fases en las cianobacterias dado que el PsaF cianobacteriano no contiene la extensión N-terminal que se encuentra en el PsaF de las algas verdes y las plantas superiores12. Recientemente, sin embargo, un estudio cinético de reducción de P700 in vivo sobre el PSI de Synechocystis sp. PCC6803 mostró características cinéticas similares a las de las algas verdes y plantas superiores51. La reacción de dos fases podría ser la consecuencia de la unión no productiva de los donantes de electrones (Pc y Cyt c6) en el lado luminal del PSI de cianobacterias. La falta de extensiones en PsaF cianobacteriano puede hacer que la unión de Cyt c6 sea específica pero flexible, lo que podría proporcionar una explicación adicional de la resolución limitada de Cyt c6 en nuestro mapa de densidad. Esta propuesta es consistente con la baja resolución local de Pc unida en el sitio no productivo de Chlamydomonas PSI48. También podría explicar por qué en el estudio anterior de crio-EM realizado por Kölsch et al.32 sobre T. elongatus PSI, el entrecruzamiento de PSI y Cyt c6 combinado con el refinamiento 3D enmascarado no localizó densidades potenciales similares a las de Cyt c6 en la región relacionada. en el lado luminal de PSI a pesar de la estequiometría mucho mayor de Cyt c6 a PSI (10:1) empleada. Por lo tanto, suponemos que una diferencia obvia entre el estudio de Kölsch et al.32 y el nuestro es la adición de Ga-Fd. Esto sugiere que el estado de unión del aceptor de electrones (en nuestro caso, Fd) en el lado estromal de PSI puede ser crucial para la unión de la proteína donadora de electrones (en nuestro caso, Cyt c6) en el lado luminal y como consecuencia la capacidad de visualizarlo. Por lo tanto, el estado de transferencia de electrones en el lado estromal de PSI podría afectar el modo de unión de los donantes de electrones en el lado luminal a través de la señalización transmembrana basada en alteraciones conformacionales. Es de esperar que los estudios futuros que se centren específicamente en optimizar la unión específica de Cyt c6 en alta ocupación aclaren estos aspectos de la transferencia de electrones mediada por PSI de cianobacterias.

La unión de Fd a PSI se ha estudiado en detalle mediante mutagénesis de las subunidades del estroma. Estos estudios identificaron residuos clave involucrados en las interacciones que permiten una rápida transferencia de electrones entre proteínas (resumidos en la Tabla complementaria 2). Nuestro modelo atómico proporciona la base estructural del importante papel que desempeñan estos residuos de aminoácidos clave y puede explicar sus efectos mutacionales. En la interfaz de unión a Fd en PsaE, las interacciones clave previamente establecidas de Arg3952, cuya mutación a una glutamina interrumpe completamente la unión de Fd, ahora se racionalizan por su interacción electrostática con Asp27 e interacciones hidrofóbicas con Tyr24 y Arg41 de Fd (Fig. 5a y Figura complementaria 7c). En la interfaz con PsaC, Lys34 participa en interacciones hidrofóbicas con Phe38 de Fd, lo que explica la incapacidad del mutante PsaC K34D25, 53 para formar la interacción catión-π crucial, interrumpiendo por completo la transferencia rápida de electrones (Fig. 5a). Además, en la interfaz de unión a Fd de PsaC cerca del grupo de hierro y azufre FB, Gln15 muestra amplias interacciones directas con Ala44, Cy45, Phe64 y también indirectamente con Tyr97 a través de la molécula de agua HOH205 (Fig. 5b), que también ha sido identificado como uno de los dos parches de interacción clave para la unión eficiente de Fd54 (Fig. 5).

Una pregunta importante en la transferencia de electrones mediada por PSI es cómo el Fd unido logra una disociación rápida de su sitio de unión PSI después de recibir un electrón. La estructura cristalográfica de rayos X de alta resolución de Anabaena Fd en su estado oxidado y reducido55 sugirió que los principales cambios estructurales tras la reducción implican un cambio en el enlace peptídico entre Cys45 y Ser46 (numeración de T. elongatus), un cambio en la cadena lateral de Phe64 y movimiento de cadena lateral del C-terminal Tyr97. El nexo de interacciones entre PSI y Fd visualizado en nuestra estructura centrada alrededor de Gln15 de PsaC se ve interrumpido por estos cambios conformacionales inducidos por reducción (Fig. 5b). El cambio del plano peptídico por sí solo rompería la interacción entre Fd-Cys45 y PsaC-Gln15 y el cambio resultante de Phe64 también podría alterar la interacción con Gln15. Finalmente, el movimiento del C-terminal Tyr97 podría desalojar los enlaces de hidrógeno mediados por agua asociados con Gln15. El costo de energía entálpica de perder este centro de interacciones formado por Gln15 podría ser suficiente para cambiar el equilibrio energético hacia la disociación. Por lo tanto, nuestra estructura de la interfaz PSI:Fd en las proximidades de los grupos de hierro-azufre involucrados en la transferencia de electrones entre proteínas proporciona un escenario convincente para explicar el mecanismo de disociación inducida por transferencia de electrones de Fd de PSI.

En este estudio, utilizamos las estructuras cristalinas de PSI de tipo salvaje (ID de PDB: 1JB04) y Fd de tipo salvaje de T. elongatus BP-1 (ID de PDB: 5AUI27) como referencia inicial para el modelado y el refinamiento. Aunque se encontraron algunas diferencias que se originaron en la mejora significativa de la resolución en comparación con nuestro análisis anterior24 mediante cristalografía de rayos X a una resolución de 4,2 Å y RMN (PDB ID: 5FZ0, BMRB:11596, Fig. 1), las diferencias observadas en los residuos que interactúan entre Fd y PSI son menores y están de acuerdo con nuestra interpretación anterior. Aquí, pudimos incluir información de la cadena lateral en la asignación de interacciones de Fd con PSI por primera vez. En nuestra estructura de rayos X anterior del complejo PSI:Fd, concluimos que PsaD no interactúa con Fd, pero esta observación entró en conflicto con los resultados de la mutagénesis dirigida al sitio en Synechocystis PSI56. Sin embargo, nuestra estructura crio-EM de alta resolución actualizada ahora corrobora fuertemente la falta de interacción entre PsaD y Fd estrechamente unido. Basándonos en nuestra estructura cristalina de rayos X del complejo PSI:Fd, propusimos previamente que el PsaF cianobacteriano puede actuar como un transductor de señal transmembrana activado por Fd-binding24. Si bien los cambios estructurales observados son solo pequeños, la ausencia de contactos de red con vecinos cristalográficos en este estudio, que también visualizó cambios estructurales en PSI tras la unión de Fd y en presencia de Cyt c6 en el lado estromal y luminal (Fig. 6) , respalda nuestra propuesta anterior basada en la estructura cristalina de rayos X de que los pequeños cambios estructurales transmembrana podrían indicar la unión de Fd al lado luminal. Aunque no se puede determinar la relevancia fisiológica de los cambios estructurales detectados aquí, la idea de un sistema de retransmisión transmembrana para la coordinación del transporte de electrones a través de PSI sigue siendo atractiva.

Sorprendentemente, en la estructura se pueden visualizar seis moléculas de agua que median enlaces de hidrógeno entre Fd y PSI (Fig. 3 y Fig. 7 complementaria). Antes de la formación del complejo, tanto Fd como las subunidades estromales de PSI deben estar completamente hidratadas con disolvente. Después de formar el complejo de transferencia de electrones específico entre Fd y PSI, las moléculas de agua de las capas de hidratación, excepto las seis moléculas de agua restantes, deben excluirse de la interfaz. Para obtener información termodinámica sobre la formación compleja de Fd con PSI, incluidas las moléculas de agua hidratantes, se realizaron mediciones ITC. Según el análisis de los parámetros termodinámicos, la formación del complejo Fd:PSI es similar a la del tipo Fd:FNR57 y Fd:GmHO58 (ΔH > 0 y ΔS > 0) pero no a la del tipo Fd:SiR59 (ΔH < 0 y ΔS > 0). La unión de Fd a su proteína asociada (en este caso, PSI) parece estar totalmente impulsada por la entropía. Las interacciones electrostáticas atractivas, las interacciones polares y las interacciones impulsadas por la fuerza de Van der Waals podrían contribuir a un ΔH negativo (ΔH < 0), pero el desprendimiento de las moléculas de agua unidas a las interfaces para la complejación de Fd y PSI costará termodinámicamente dar un valor positivo para el ΔH neto (ΔH > 0), como también se observó en la formación del complejo Fd:FNR57, 60. No obstante, el desorden conformacional que acompaña al desplazamiento de las moléculas de agua de la interfase puede hacer que la formación del complejo sea energéticamente favorable debido al aumento de entropía asociado. El análisis de ITC demuestra una fuerte afinidad interproteica entre Ga-Fd y PSI con un valor de Kd de ~0,8 μM, que se corresponde estrechamente con la afinidad de Fd nativa por PSI medida por espectroscopia de absorción instantánea24. Por último, la estequiometría de unión (valor n) calculada en función de los resultados de medición de ITC fue de aproximadamente tres, lo que significa que un Ga-Fd se une a un protómero PSI en solución, lo que es consistente con los resultados de nuestra estructura crio-EM.

Con base en los análisis cinéticos y nuestro estudio estructural actualizado, proponemos un mecanismo de formación de complejos de transferencia de electrones que involucra cinco pasos de la siguiente manera (consulte también la caricatura en la Fig. 8). (i) Fd y Cyt c6 están inicialmente en un estado libre libre antes de la transferencia de electrones (Fig. 8a). (ii) Una vez que ocurre un evento de separación de carga impulsado por la luz dentro de PSI, el Fd oxidado se acerca a PSI para unirse al lado del estroma para recibir el electrón excitado. Las alteraciones estructurales finas dentro de PSI desencadenadas por la unión de Fd se transmiten al lado luminal para reclutar Cyt c6 en el sitio de unión no productivo (Fig. 8b). El aumento de la afinidad de los sitios de unión no productivos para Cyt c6 puede proteger el centro de reacción PSI de una reducción excesiva cuando FA y FB están en un estado reducido. (iii) PSI reduce Fd (Nota, en nuestra estructura, Ga-Fd no se puede reducir y, por lo tanto, Fd permanece unido a PSI y Cyt c6 permanece unido en el sitio no productivo (Fig. 8c)). (iv) Una vez que Fd se reduce por un electrón excitado y luego se separa de PSI, Cyt c6 migrará al sitio de unión productivo proximal de P700 para la transferencia de electrones posterior (Fig. 8d). (v) Finalmente, Cyt c6 oxidado se separa de PSI y comienza otra ronda de reacciones de transferencia de electrones.

a Cyt c6 reducido y Fd oxidado están en un estado libre no unido. b La separación de carga inducida por la luz a través de la membrana hace que el Fd oxidado se una al lado del estroma y abre sitios de acoplamiento no productivos para Cyt c6 en el lado luminal. El símbolo rosa en forma de corazón representa un sitio de unión activado y la señal de tráfico 'cerrado' representa un centro de reacción cerrado. c Cyt c6 está unido a sitios de acoplamiento no productivos luminales, mientras que el Ga-Fd permanentemente oxidado permanece unido al lado del estroma con el marco de línea discontinua que indica la estructura determinada en este estudio. d El electrón excitado ha dejado PSI con su transportador soluble Fd y la Cyt c6 reducida se ha movido al sitio productivo de unión proximal P700* para la transferencia de electrones y el posterior desprendimiento de PSI.

En resumen, proponemos que PSI se involucra en dos tipos de mecanismo de unión de Pc o Cyt c6 al centro de reacción. Un mecanismo implica la "unión previa" de Pc a la extensión N-terminal de PsaF como se observa para Chlamydomonas reinhardtii. El mecanismo alternativo implica la unión "no productiva" inducida por la unión de Fd para facilitar la transferencia de electrones eficiente en las cianobacterias. Estos mecanismos de reclutamiento pueden haber evolucionado aún más para proporcionar la base para una transferencia de electrones eficiente y robusta a P700 en algas verdes y plantas vasculares.

Las cianobacterias termófilas de la cepa mutante Thermosynechococcus elongatus BP-1, modificadas genéticamente con una etiqueta His10 N-terminal en la subunidad PsaF, así como un gen resistente al cloranfenicol como marcador seleccionable, se cultivaron bajo iluminación para la purificación de ambos trímeros PSI y Cyt c6. El cultivo se realizó bajo iluminación continua a 30 μM de fotones m-2 s-1 a 50 °C en medio BG11 como se describió anteriormente61. Se recogió un total de 16 l de cultivo cuando la absorbancia de OD730 nm alcanzó un valor de uno. Los trímeros PSI marcados con His se purificaron a partir de membranas de tilacoides usando la metodología descrita por Kubota et al.43 con modificaciones menores como se describe a continuación.

Las células recolectadas se concentraron por centrifugación (8000 × g, 2 min a 4 °C, rotor JLA 9.1000, Avanti™ HP-26XP), se resuspendieron en tampón A que contenía MES 50 mM (pH 6,5), glicerol al 25 %, CaCl2 20 mM y MgCl2 20 mM, luego se congela para su almacenamiento a -80 °C o se usa inmediatamente para la ruptura celular como se describió anteriormente62. Las células se rompieron en tampón B preenfriado recién preparado (los mismos componentes que en el tampón A con la adición de benzamidina 1 mM, ácido 6-aminohexanoico 1 mM, PMSF 1 mM solubilizado en etanol y ADNasa I 1 mM) y las membranas tilacoides se separado del contenido celular soluble por ultracentrifugación (40 000 × g, 30 min a 4 °C, rotor P50AT2, HITACHI himac CP80WX).

Las membranas tilacoides se resuspendieron en Tampón A a una concentración de clorofila de 1 mg/mL y, posteriormente, se añadió gota a gota una solución madre de β-DDM al 10 % hasta que la concentración de β-DDM alcanzó el 1 %. Luego, la mezcla se incubó en la oscuridad a 4 °C con agitación suave durante 45 min. Después de la solubilización de la membrana, los contenidos insolubles se eliminaron mediante ultracentrifugación (50 000 × g, 30 min a 4 °C, rotor P50AT2, HITACHI himac CP80WX) y el sobrenadante se aplicó a una columna abierta con Ni-NTA Sepharose (Qiagen, Hilden, Alemania) . Los trímeros de PSI se eluyeron de la columna usando tampón C que contenía MES 20 mM (pH 6,5), CaCl2 20 mM, MgCl2 20 mM, β-DDM al 0,05 % e imidazol 100 mM. Los trímeros de PSI eluidos se concentraron mediante ultrafiltración a 3000 × g, 4 °C (tubos de ultrafiltración Amicon15, 100 kDa MWCO; Amicon, Miami, FL, EE. UU.) hasta una concentración final de clorofila de alrededor de 10 mg/mL.

Se aplicó el enfoque GraDeR34 para intercambiar el detergente β-DDM por glicodiosgenina (GDN) y para eliminar el exceso de detergente libre. Para lograr esto, se preparó un gradiente escalonado de sacarosa con concentraciones de sacarosa de 1,7 M, 1,3 M, 0,9 M, 0,5 M y 0,1 M de abajo hacia arriba, y GDN de 0,1 %, 0,05 %, 0,03 %, 0,01 % y 0.005% de abajo hacia arriba. Después de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa (25,000 × g, 20 h a 4 ° C, rotor P28S, HITACHI himac CP80WX, resultado ver Fig. 1a complementaria), se recolectaron trímeros PSI de la banda correspondiente y una columna de desalinización (PD-10, GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.) para eliminar la sacarosa y para el intercambio de tampones. Los trímeros de PSI finales se concentraron a una concentración de clorofila de 10 mg/ml en tampón D (tricina 10 mM, pH 8,0, MgCl2 10 mM y GDN al 0,005 %) y se examinaron en cuanto a pureza, estabilidad y monodispersidad mediante microscopía electrónica de tinción negativa como se describe abajo. La muestra final del trímero PSI se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido en alícuotas de 10 μL usando tubos EP fotofóbicos y se almacenó hasta su uso posterior a -80 °C. La concentración de proteína del trímero PSI se determinó en base a la proporción de contenido de clorofila de CPro/CChl = 3,92.

La calidad de las muestras de proteína PSI se evaluó mediante tinción negativa. Una alícuota de 3,5 μL de la muestra final se diluyó 1/100 y se aplicó a rejillas de cobre recubiertas con película de carbono continuo descargadas luminiscentes (5 mA, 10 s, Eiko) (Nisshin EM, Tokio, Japón). La tinción se realizó aplicando 3,5 μL de solución de acetato de uranilo al 2%. Después de la incubación durante 30 s, la solución de tinción se secó con papel de filtro (Whatman #1; Whatman, Little Chalfont, Reino Unido) y se secó a temperatura ambiente. Las rejillas EM se inspeccionaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión HITACHI H-7650 a un voltaje de aceleración de 80 kV equipado con una cámara CCD Tietz FastScan-F114 de 1 × 1K. En la figura complementaria 1b se presenta una micrografía de tinción negativa típica de partículas PSI triméricas.

El sobrenadante obtenido por disrupción de células T. elongatus BP-1 y ultracentrifugación como se describe anteriormente se utilizó para el aislamiento de Cyt c6 basado en un método de purificación anterior63 con algunas modificaciones. Se añadió gradualmente al sobrenadante sulfato de amonio sólido (AS) a 25 °C hasta que la saturación alcanzó el 45 %. Después de agitar durante 45 min a 25 °C, el precipitado se eliminó mediante centrifugación (9500 × g, 30 min a 25 °C, rotor JLA 9.1000, Avanti™ HP-26XP). El sobrenadante resultante se cargó en una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HiTrap® Phenyl HP) preequilibrada con tampón que contenía tricina 10 mM (pH 7,5) y 45 % de AS mediante un sistema de cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC, ÄKTA explorer). Las fracciones que contenían Cyt c6 se eluyeron disminuyendo la concentración de AS a alrededor del 20 %. Después de la desalinización mediada por columna (PD-10, GE Healthcare), las fracciones se intercambiaron con un tampón que contenía tricina 10 mM (pH 7,5) y NaCl 10 mM, y se cargaron en una columna de intercambio aniónico (HiTrap® Q HP) preequilibrada con el mismo tampón. La proteína unida se eluyó aumentando la concentración de NaCl a alrededor de 100 mM y se agruparon las fracciones con una coloración rosa. La muestra agrupada luego se sometió a un paso final de cromatografía de filtración en gel (Superose® 75 16/60) utilizando un tampón de funcionamiento que contenía Tricina 30 mM (pH 8,0) y MgCl2 10 mM. La calidad de la muestra y el estado redox se evaluaron midiendo la relación de absorbancia OD553nm/OD273nm según un protocolo publicado anteriormente64 y las propiedades de absorbancia se caracterizaron mediante espectroscopia de absorbancia UV-Vis. El color rosa intenso y el pico de absorción característico a 553 nm verificaron el estado reducido de Cyt c6 purificado en comparación con resultados espectroscópicos previos65 de Cyt c6 reducido. El análisis SDS-PAGE de Cyt c6 purificado se presenta en la Fig. 1c complementaria.

Un fragmento de ADN que codifica la ferredoxina (Fd) nativa de T. elongatus BP-1 se clonó en el vector pET28a (Novagen, Madison, WI, EE. UU.) usando sitios de restricción NcoI-BamHI y se expresó usando la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli cultivada en Luria -Bertani (LB) medio. La purificación de Fd y la subsiguiente sustitución de su grupo nativo [2Fe-2S] por el grupo redox inerte [2Ga-2S] se realizaron como se describió previamente27. En resumen, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en un tampón que contenía Tris 50 mM (pH 7,5) y glicerol al 10%. Después de la ruptura celular mediante sonicación, los lisados ​​resultantes se centrifugaron durante 30 min a 45 000 rpm, 4 °C (rotor P45AT, Hitachi CP80WX) y el sobrenadante resultante se cargó en una columna de celulosa de intercambio aniónico (DE52, Whatman). Las fracciones de color rojo que contenían Fd se eluyeron con un tampón que contenía Tris 50 mM (pH 7,5) y NaCl 500 mM y se dializaron durante la noche a 4 °C frente a 3 L de tampón que contenía Tris 50 mM (pH 7,5) y NaCl 50 mM. Luego, el dializado se aplicó a una columna HiTrap Q HP (GE Healthcare) en tampón que contenía Tris 50 mM (pH 7,5) y se eluyó usando un gradiente lineal de NaCl (0–1 M NaCl). Posteriormente, para la precipitación con sulfato de amonio, se añadió un tampón AS saturado al 100 % (Tris 50 mM (pH 7,5) 1:1 a las fracciones agrupadas. El precipitado se centrifugó (8000 × g, TOMY) y se descartó. La muestra finalmente se sometió a a la cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una columna de fenil Sepharose (GE Healthcare) equilibrada en tampón A (Tris 50 mM pH 7,5, sulfato de amonio saturado al 40 %). 7.5) y se recogieron las fracciones de color rojo.

Para la sustitución con galio, se desnaturalizaron 45 mg de Fd mediante la adición de cloruro de hidrógeno (HCl) a una concentración de 6 M hasta una concentración final de HCl 1 M. La solución turbia se sedimentó (10 min, 10 000 × g a temperatura ambiente, máquina centrífuga de TOMY) y el precipitado blanco se enjuagó inmediatamente con agua Milli-Q, seguido de una resuspensión en un tampón que contenía Tris 100 mM (pH 8,0). Los pasos anteriores se repitieron dos veces para asegurar la eliminación de todos los átomos de hierro del Fd. El precipitado de proteína final se resuspendió en un tampón que contenía Tris 100 mM (pH 8,0), clorhidrato de guanidina 6 M y ditiotreitol 10 mM en un entorno anaeróbico.

El Fd desnaturalizado se replegó a 4 °C diluyéndolo en un tampón de replegamiento (GaCl3 2 mM, Na2S 2 mM, DTT 2 mM y Tris 20 mM, pH 8,0) y se incubó a 4 °C durante la noche en condiciones anaeróbicas. El Ga-Fd replegado se purificó mediante cromatografía en columna HiTrap-Q (GE Healthcare) utilizando un gradiente de elución de NaCl de 0 a 1 M en Tris-HCl 20 mM (pH 7,5). Los perfiles de elución de las proteínas se controlaron mediante absorbancia a 280 nm. Las fracciones eluidas que contenían Ga-Fd se recolectaron y concentraron por ultrafiltración utilizando una unidad Amicon Ultra-15 de corte de 10 kDa que se centrifugó en un rotor basculante (2000 × g, 4 ° C). A continuación, la muestra concentrada se cargó en una columna Superdex 75 16/60 (GE Healthcare) preequilibrada en Tris 100 mM (pH 8,0) a un caudal de 0,5 ml/min en el mismo tampón. Las fracciones que contenían Ga-Fd se detectaron por absorbancia a 280 nm y luego se sometieron a un paso final de cromatografía de exclusión por tamaño. La concentración de Fd nativo y Ga-Fd se calcularon a partir de sus coeficientes de extinción molar de ε422 = 9,68 mM/cm y ε280 = 170,2 mM/cm, respectivamente27. La pureza de Ga-Fd se evaluó mediante análisis SDS-PAGE como se muestra en la Fig. 1d complementaria.

Todas las mediciones de ITC se realizaron con un instrumento MicroCal PEAQ-ITC (Malvern Panalytical, Reino Unido) a 25 °C. Las concentraciones de Ga-Fd en la jeringa y el trímero PSI en la celda fueron de 600 μM y 11 μM, respectivamente. Todas las soluciones de proteína se sometieron a intercambio de tampón en tampón Tricina-NaOH 30 mM (pH 8,0) que contenía MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM y GDN al 0,005 % mediante el uso de columnas PD-10 (GE Healthcare Life Sciences) y se eliminaron las burbujas de aire. por centrifugación durante 5 min a 10.000 × g antes de ITC. Se utilizaron los siguientes parámetros ITC: titulación, 19 inyecciones; retardo inicial, 60 s; tiempo de espaciamiento, 180 s; potencia de referencia, 10 μcal/s; y velocidad de agitación, 750 rpm. El volumen de inyección fue de 0,4 μL para la primera inyección y de 2 μL para las inyecciones restantes. El calor de dilución se midió valorando Fd sustituido con Ga 600 μM en la jeringa en una celda de muestra llena con tampón solo. El flujo de calor y la isoterma de unión se calcularon restando el calor de dilución. Los datos se ajustaron al modelo de unión de un conjunto de sitios incorporado en el software de análisis MicroCal PEAQ-ITC. Los parámetros termodinámicos se muestran como media ± SEM derivados de tres experimentos ITC independientes.

Un total de 10 μL de trímero PSI purificado a una concentración de proteína de 37 μM (40 mg/mL), 1 μL de Ga-Fd purificado a una concentración de 400 μM (4,4 mg/mL) y 2 μL de Cyt c6 purificado en concentración de 75 μM (0,75 mg/ml) se mezclaron a temperatura de hielo hasta una concentración final de trímero PSI de 30 mg/ml. Después de la incubación en hielo en la oscuridad durante 2 h, se aplicó una alícuota de 2,6 μL a una rejilla Quantifoil cryo-EM (R 1.2/1.3 Cu 300 malla) y sumergir congelado en etano líquido usando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) equipado con papel de filtro Whatman #1 para transferencia a 4 °C y 100 % de humedad durante 3,5 s con fuerza de transferencia 0. Congelada las rejillas se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento. El cribado se realizó utilizando un microscopio crioelectrónico de transmisión Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) operado a 200 kV. Se extrajeron de la Talos Arctica criorrejillas que exhibían una distribución de partículas y un espesor de hielo apropiados y se utilizaron para la recopilación de datos de alta resolución.

Con el cartucho adaptador de rejilla automática (JEOL, Tokio, Japón), se transfirió una única rejilla criogénica preseleccionada recortada como una rejilla automática (Thermo Fisher Scientific) a un microscopio crioelectrónico de transmisión CRYO ARM 300 (JEOL) operado a 300 kV y equipado con una pistola de emisión de campo frío y un filtro Ω en columna. La adquisición de imágenes se realizó utilizando iluminación paralela de haz de inundación en modo de imagen de campo brillante. Las películas fueron grabadas automáticamente por SerialEM utilizando el cambio de imagen (5 × 5 orificios por posición de escenario) y una cámara de detección directa K3 (Gatan, AMETEK, Pleasanton, CA, EE. UU.) en modo CDS con un aumento nominal de ×60 000 al nivel de la cámara. correspondiente a un tamaño de píxel de 0,806 Å con 48 fotogramas en un tiempo de exposición de 3 s, lo que da como resultado una dosis total de 48 e−/Å2. Se recopilaron un total de 3018 películas en serie dentro de un rango de desenfoque de -0,5 μm a -1,5 μm. Una micrografía típica y la distribución angular de los complejos de proteínas se muestran en las Figs. complementarias. 2b y 3b, respectivamente.

Todo el procesamiento de imágenes se realizó con RELION 3.1 y UCSF CHIMERA66 en una estación de trabajo de GPU local equipada con dos GPU (consulte la Fig. 2a complementaria para conocer el flujo de trabajo). Un total de 3018 películas se dividieron en seis grupos, y el algoritmo MotionCor267 implementado en Relion realizó la corrección de movimiento ponderada por dosis. Para cada película con corrección de movimiento, la función de transferencia de contraste (CTF) se estimó utilizando CTFFIND468. Después de la estimación de CTF, las películas de 1959 con una resolución estimada de mejor que 5 Å y buenos anillos de Thon (Fig. 2c complementaria) se guardaron para su posterior procesamiento. Para la construcción de novo de un modelo inicial, se seleccionaron automáticamente 40 483 partículas de uno de los 500 grupos de películas utilizando el método Laplaciano de Gauss. Las partículas seleccionadas se sometieron a una ronda de clasificación 2D sin referencia y el modelo inicial se calculó utilizando 30 580 partículas de las mejores clases 2D. La Fig. 2e complementaria presenta una visualización de isosuperficie del modelo inicial en cuatro umbrales diferentes. La selección automática de películas de los seis grupos se realizó utilizando el modelo inicial como referencia 3D. Se seleccionaron un total de 511 737 partículas de todas las películas y se realizó una clasificación 2D de las partículas seleccionadas para cada grupo de películas. Se seleccionaron, agruparon y utilizaron buenas clases 2D (Fig. 2d complementaria) que contenían un total de 366,174 partículas para la clasificación 3D. Las partículas de la mejor clase 3D, indicadas por un título rojo en la figura complementaria 2f que representa el 56,6 % (207 142 partículas) de todas las partículas, se seleccionaron para la reconstrucción 3D mediante el refinamiento automático estándar. Posteriormente, se realizaron varias rondas de refinamiento CTF y pulido bayesiano hasta que la resolución general del mapa no mejoró más. Siguiendo los procedimientos estándar de posprocesamiento, el mapa final enmascarado dio una resolución estimada de 2,06 Å sin simetría aplicada (C1) y 1,97 Å con simetría aplicada (C3). No se pudo observar ninguna diferencia obvia entre los mapas C1 y C3 en términos de características estructurales. El mapa simetrizado C3 se usó para la construcción de modelos porque exhibió una mejor distribución del ángulo de Euler y un nivel reducido de ruido. La distribución de resolución local (Fig. 4a complementaria) del mapa simetrizado C3 se calculó utilizando RELION.

Coot69, Phenix, MolProbity70 y UCSF Chimera66 se utilizaron para la construcción de modelos y el refinamiento del espacio real. Las estructuras cristalinas de rayos X del trímero PSI de Synechococcus elongatus determinadas a una resolución de 2,5 Å (ID de PDB: 1JB04) y de la estructura cristalina de rayos X de ferredoxina de T. elongatus BP-1 determinada a una resolución de 1,5 Å (ID de PDB: 5AUI27) fueron utilizado como modelo inicial para el refinamiento del espacio real en Phenix 1.19.2 después del ajuste manual en UCSF Chimera 1.13.1. Coot 0.9.5 se utilizó para la corrección manual y la minimización de valores atípicos de rotámero, geometría y Ramachandran en el modelo refinado del espacio real. Los archivos precisos de restricción de ligandos no metálicos se descargaron de Grade Server (http://grade.globalphasing.org) y se utilizaron durante el refinamiento. Para tener en cuenta la presencia observada de magnesio en ambos lados del plano del anillo de cloro, se eliminó la limitación de quiralidad del plano de unión del magnesio en las restricciones de las clorofilas (CLA y CL0) para permitir un ajuste razonable dentro del mapa de densidad. Además, se aplicaron nuevas restricciones de grupos de hierro y azufre71 utilizando una geometría romboidal para el refinamiento de grupos de hierro y azufre (SF4). Los archivos de restricción recién modificados se cargaron junto con el modelo en el sitio de depósito wwPDB. La visualización de mapas y modelos en todas las figuras se realizó utilizando PyMOL 2.3.2, UCSF Chimera 1.13.1 y ChimeraX72 1.2.5. Para el posicionamiento de Cyt c6 presentado en la Fig. 2, se realizó la rutina Phenix "Dock in map" (https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html) con la entrada del mapa de densidad local correspondiente y el Estructura cristalina de rayos X de T. elongatus BP-1 Cyt c6 determinada a una resolución de 1,7 Å (PDB ID: 6TR165).

No se aplicó ningún método estadístico para presuponer el tamaño o la forma de la muestra de proteína, y los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de los resultados. Los experimentos de purificación de trímeros PSI, ferredoxina y citocromo c6 se repitieron tres veces, lo que presentó características de muestra casi idénticas. Las mediciones de ITC se repitieron tres veces y se obtuvieron resultados similares (los Datos complementarios 1 muestran los datos fuente de la medición de ITC descrita en el documento). Los datos de Cryo-EM se recopilaron de una única crio-red. Las imágenes individuales con una resolución estimada inferior a 5 Å y anillos de Thon borrosos, así como un espesor de hielo insatisfactorio, se excluyeron del conjunto de datos manualmente. Las estadísticas detalladas de las estadísticas de recopilación, procesamiento y refinamiento de datos se resumen en la Tabla complementaria 1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las 3018 películas crio-EM sin procesar se depositaron en el Archivo de imágenes públicas de microscopía electrónica (EMPIAR) con el número de acceso EMPIAR-10928. El mapa de densidad crio-EM final se ha depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con el número de acceso EMD-31605. Las coordenadas atómicas del modelo PSI:Fd refinado se han depositado en el Protein Data Bank (PDB) con el número de acceso 7FIX. Todos los datos relevantes están disponibles de los autores correspondientes a pedido razonable.

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Agradecemos el apoyo técnico y el valioso aporte científico para este proyecto de Hisako Kubota-Kawai, Yuko Misumi, Hideaki Tanaka, Mika Hirose, Norbert Krauß, Orkun Çoruh y Takayuki Kato. Este trabajo fue financiado por JST-CREST con el número de subvención JPMJCR20E1 (GK) y una subvención para la investigación científica con el número de subvención 21H02417 (GK) de MEXT-KAKENHI, el Proyecto de plataforma para apoyar el descubrimiento de fármacos y la investigación en ciencias de la vida de AMED con el número de subvención JP20am0101117 (KN) y JP16K07266 (CG), y JP22ama121001j0001 a Masaki Yamamoto, CG y GK y la subvención Cyclic Innovation for Clinical Empowerment (CiCLE) número JP17pc0101020 de AMED a KN y GK, y la Fundación Nacional de Investigación de Corea ( NRF) subvenciones financiadas por el gobierno coreano con el número de subvención 2019R1A2C1004954, la subvención del Consejo Nacional de Investigación de Ciencia y Tecnología (NST) financiada por el gobierno coreano con el número de subvención CCL22061-100 y el fondo KBSI con el número de subvención C220000, C230130, C280320 y C270100 a Y.-HL, y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en el marco del Research Training Group 234 'MiCon' (MMN). Este trabajo también cuenta con el apoyo de la beca del China Scholarship Council (CSC) para el estudio de JL en la Universidad de Osaka (CSC No. 201706220064).

Laboratorio de Cristalografía de Proteínas, Instituto de Investigación de Proteínas, Universidad de Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japón

Jiannan Li, Noriyuki Hamaoka, Akihiro Kawamoto, Christoph Gerle y Genji Kurisu

Departamento de Ciencias Biológicas, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Osaka, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japón

Jiannan Li y Genji Kurisu

Departamento de Ciencias Macromoleculares, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Osaka, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japón

Noriyuki Hamaoka y Genji Kurisu

Escuela de Graduados en Biociencias Fronterizas, Universidad de Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japón

Fumiaki Makino y Keiichi Namba

JEOL Ltd., Akishima, Tokio, Japón

fumiaki makino

Centro de Investigación para el Análisis de Bioconvergencia, Instituto de Ciencias Básicas de Corea, Ochang, Chungbuk, 28119, Corea del Sur

Yuxi Lin y Young-Ho Lee

Bioquímica Vegetal, Facultad de Biología y Biotecnología, Ruhr University Bochum, 44780, Bochum, Alemania

Matthias Rögner y Marc M. Nowaczyk

Ciencias Bioanalíticas, Universidad de Ciencia y Tecnología, Daejeon, 34113, Corea del Sur

Young Ho Lee

Escuela de Graduados en Ciencia Analítica y Tecnología, Universidad Nacional de Chungnam, Daejeon, 34134, Corea del Sur

Young Ho Lee

Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas y Centro SPring-8, Suita, Osaka, Japón

Número de Keiichi

JEOL YOKOGUCHI Research Alliance Laboratories, Universidad de Osaka, Suita, Osaka, Japón

Número de Keiichi

Centro RIKEN SPring-8, Kouto, Sayo-gun, Hyogo, 679-5198, Japón

cristobal gerle

Instituto de Iniciativas de Investigación Abiertas y Transdisciplinarias (OTRI), Universidad de Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japón

genji kurisu

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GK, MR y MMN iniciaron el estudio; investigación diseñada por GK y CG; JL, NH, FM, AK e YL realizaron experimentos; JL, NH, YL, Y.-HL y CG analizaron los datos; KN supervisó la investigación y JL, CG y GK escribieron el manuscrito con aportes y comentarios de todos los autores.

Correspondencia a Christoph Gerle o Genji Kurisu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Mei Li por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Manuel Breuer. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Li, J., Hamaoka, N., Makino, F. et al. Estructura del fotosistema de cianobacterias I complejado con ferredoxina a una resolución de 1,97 Å. Commun Biol 5, 951 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

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Recibido: 13 julio 2022

Aceptado: 30 de agosto de 2022

Publicado: 12 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

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