El citraconato inhibe la catálisis de ACOD1 (IRG1), reduce las respuestas de interferón y el estrés oxidativo, y modula la inflamación y el metabolismo celular

Oct 22, 2023

Nature Metabolism volumen 4, páginas 534–546 (2022)Citar este artículo

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Aunque las propiedades inmunomoduladoras y citoprotectoras del itaconato se han estudiado ampliamente, no se sabe si sus isómeros naturales mesaconato y citraconato tienen propiedades similares. Aquí, mostramos que el itaconato se convierte parcialmente en mesaconato intracelularmente y que la acumulación de mesaconato en la activación de macrófagos depende de la síntesis previa de itaconato. Cuando se agregan a las células humanas en concentraciones suprafisiológicas, los tres isómeros reducen los niveles de lactato, mientras que el itaconato es el inhibidor más potente de la succinato deshidrogenasa (SDH). En las células infectadas con el virus de la influenza A (IAV), los tres isómeros alteran profundamente el metabolismo de los aminoácidos, modulan la liberación de citoquinas/quimioquinas y reducen la señalización del interferón, el estrés oxidativo y la liberación de partículas virales. De los tres isómeros, el citraconato es el electrófilo más fuerte y el agonista del factor 2 relacionado con el factor nuclear eritroide 2 (NRF2). Solo el citraconato inhibe la catálisis del itaconato por la cis-aconitato descarboxilasa (ACOD1), probablemente por unión competitiva al sitio de unión al sustrato. Estos resultados revelan que el mesaconato y el citraconato son compuestos inmunomoduladores, antioxidantes y antivirales, y el citraconato es el primer inhibidor natural de ACOD1.

Los pequeños ácidos dicarboxílicos insaturados itacónico, mesacónico y citracónico son isómeros naturales que difieren solo en la ubicación de un doble enlace (Fig. 1). El itaconato es un metabolito clave de los macrófagos activados y es el producto de la enzima mitocondrial ACOD11,2. Se está investigando intensamente como vínculo entre el metabolismo y la inmunidad, tiene propiedades inmunomoduladoras (revisadas en las referencias 3 y 4) y se ha detectado en biofluidos, células y tejidos humanos en una variedad de enfermedades inflamatorias e infecciosas, así como en modelos de roedores. de enfermedades humanas (resumido en la ref. 5). La información sobre el origen y catabolismo de mesaconato y citraconato en eucariotas es escasa. Teniendo en cuenta su gran similitud estructural, es concebible la interconversión entre los tres isómeros, por ejemplo, a través de isomerasas endógenas. Basado en el trabajo sobre el metabolismo del itaconato utilizando mitocondrias hepáticas aisladas6, Nemeth et al. sugirió que el mesaconato puede ser un producto del catabolismo del itaconato a través de la itaconil-CoA7. El único estudio que sugiere un mecanismo biosintético de citraconato en organismos superiores se basa en el perfil de metabolitos de pacientes con acidemia metilmalónica, donde se postuló que era un catabolito del aminoácido de cadena ramificada (BCAA) isoleucina8. Cada vez hay más pruebas de que los niveles elevados de mesaconato o citraconato pueden estar asociados con enfermedades metabólicas humanas (resumidas en la ref. 5). Sin embargo, queda por aclarar si estas concentraciones aumentadas son fisiopatológicamente relevantes o si simplemente representan epifenómenos de trastornos en el metabolismo. En humanos, no hay información sobre la distribución tisular de mesaconato o citraconato. Sin embargo, en una pantalla de órganos de ratones sanos, hemos demostrado recientemente que el mesaconato se produce en los ganglios linfáticos y el citraconato en los ganglios linfáticos y el bazo, lo que aumenta la posibilidad de alguna función en la inmunidad5.

Los intermedios de TCA seleccionados y el lactato se midieron mediante HPLC-MS/MS a las 6 y 24 h en los experimentos de captación de isómeros de itaconato que se muestran en la Fig. 1 de datos ampliados. Las concentraciones se expresan en función del volumen celular calculado. a, PCA que ilustra fuertes alteraciones debidas a los tres isómeros a las 6 h, pero una relativa normalización de los efectos del mesaconato y el citraconato a las 24 h. b–d, el isómero medido se indica arriba de cada gráfico, los isómeros agregados debajo del eje x. e, Concentraciones de lactato y productos intermedios de TCA seleccionados (concentraciones dadas en los ejes y) 6 h después de la adición de los isómeros indicados debajo del eje x. Los tres isómeros reducen los niveles de lactato (de acuerdo con la inhibición de la glucólisis), pero solo el itaconato eleva los niveles de succinato, lo que sugiere una inhibición de la SDH. Citra, ácido citracónico; Ita, ácido itacónico; Mesa, ácido mesacónico. n = 3 réplicas biológicas, medias ± sd Prueba t no pareada. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; NS, no significativo.

Las propiedades inmunomoduladoras y citoprotectoras del itaconato y derivados químicamente modificados como el dimetil-itaconato y el 4-octil-itaconato (4-OI) se están estudiando intensamente para crear intervenciones terapéuticas para enfermedades inflamatorias y degenerativas3,4 e infecciones virales9,10. Por el contrario, no se sabe si el mesaconato o el citraconato aplicados exógenamente pueden ser absorbidos por las células y si ejercen efectos inmunomoduladores, antioxidantes o antiinfecciosos similares a los del itaconato. Más allá de las funciones bien documentadas del itaconato en el inmunometabolismo, la síntesis aberrante de itaconato por ACOD1 se ha implicado en la carcinogénesis. El itaconato que se libera de los macrófagos peritoneales puede servir como factor de crecimiento para los tumores que se han diseminado a la cavidad peritoneal11, y también se ha informado un papel protumorigénico de ACOD1 en los gliomas12,13. Por lo tanto, los inhibidores de ACOD1 pueden tener propiedades antineoplásicas, pero no se sabe si existen moléculas endógenas que inhiban la actividad de ACOD1. Teniendo en cuenta estas preguntas abiertas, empleamos una combinación de ensayos sin células, modelos celulares, un modelo de infección por IAV y un modelo de ratón de inflamación inducida por lipopolisacáridos (LPS) para: (1) probar si existe una interconversión entre los tres isómeros; (2) evaluar el impacto del mesaconato y el citraconato en el metabolismo celular, la inflamación, el estrés oxidativo y la infectividad de IAV; y (3) probar si alguno de los tres isómeros inhibe la actividad de ACOD1.

Buscando los orígenes del mesaconato y el citraconato, primero probamos si existe una interconversión espontánea entre los tres isómeros y si ACOD1 también puede catalizar la síntesis de mesaconato o citraconato. No hubo evidencia de síntesis de mesaconato o citraconato en un ensayo de enzima ACOD1 libre de células2 (Figura complementaria 1b) y no hubo interconversión espontánea cuando los compuestos puros se incubaron en medio RPMI durante hasta 24 h (Figura complementaria 1c-e) . Sin embargo, se detectaron concentraciones contaminantes bajas biológicamente irrelevantes de cada isómero en stocks puros de los otros isómeros respectivos (Fig. 1g complementaria).

Cordes et al. demostraron que el itaconato añadido exógenamente (25 mM) puede dar lugar a concentraciones intracelulares de 14 mM en células murinas RAW 264.7 en reposo14. Después de determinar las concentraciones no tóxicas de los isómeros (Fig. 1h complementaria), probamos su absorción en células similares a macrófagos humanos diferenciados (dTHP1). De hecho, los tres isómeros se absorbieron de manera eficiente (Datos extendidos Fig. 1a-f) y no hubo evidencia de síntesis de novo de citraconato o itaconato. Sin embargo, cuando se añadió itaconato al medio, apareció mesaconato intracelularmente. La concentración de mesaconato con respecto al itaconato intracelular osciló entre 1,7 % y 8,0 % y se correlacionó inversamente con la concentración de itaconato intracelular (Datos ampliados, Fig. 1d).

Es de destacar que también apareció una pequeña cantidad de mesaconato en los sobrenadantes 24 h después de la adición de itaconato, lo que concuerda con la secreción de mesaconato generado intracelularmente (Datos ampliados, Fig. 1g). Por lo tanto, probamos si el itaconato sintetizado endógenamente también conduciría a la acumulación de mesaconato. De hecho, la estimulación con LPS/interferón-γ (IFN-γ) de las células dTHP1 condujo a la acumulación de mesaconato que alcanzó su punto máximo después del itaconato (Datos ampliados Fig. 2a-d), mientras que ni el itaconato ni el mesaconato fueron detectables en las células ACOD1-/- dTHP1 estimuladas con LPS/IFN-γ. No se detectó citraconato en ninguno de los tipos de células. También se detectó una conversión aparente de itaconato a mesaconato en el bazo de ratones durante un curso de 72 h de inflamación sistémica inducida por LPS (Datos extendidos Fig. 2e-h). Sin embargo, la conversión fraccionada de itaconato a mesaconato fue solo de alrededor del 4 %, que es mucho menor que en las células dTHP1. Para probar si la conversión de itaconato a mesaconato también puede tener lugar en células que no expresan fisiológicamente ACOD1, transfectamos la línea de células epiteliales respiratorias A549 con un vector que expresa constitutivamente ACOD1 humano (hACOD1) o ACOD1 murino (mACOD1; Datos extendidos Fig. 2i– l). En contraste con el retraso observado en las células dTHP1, hubo un aumento paralelo en itaconato y mesaconato, con mesaconato que ascendió a 4%-5% (hACOD1) y 2,5%-2,7% (mACOD1) con respecto a itaconato, pero las concentraciones absolutas de mesaconato fueron mucho más altos en las células que expresan mACOD1, que producen niveles mucho más altos de itaconato que la enzima2 humana (Datos extendidos Fig. 2j, k). No se detectó citraconato. El itaconato puede inhibir la SDH, elevando así los niveles de succinato15. De hecho, el succinato se acumuló notablemente en las células que expresan mACOD1 (Datos extendidos Fig. 2i). Se observó un aumento menor de succinato en células transfectadas con hACOD1, pero solo a concentraciones de itaconato que eran más altas que los niveles de succinato de referencia. En conjunto, los resultados que se muestran en las Figs. de datos ampliados. 1 y 2 sugieren que el citraconato tiene un origen independiente del itaconato, mientras que el mesaconato se origina a partir del itaconato a través de un proceso mediado por enzimas que ocurre fisiológicamente al menos en el bazo y los macrófagos, pero que no depende estrictamente del tipo celular.

Además de inhibir la SDH, el itaconato puede cambiar el metabolismo central de la glucosa de la glucólisis aeróbica a la derivación de pentosa-fosfato16. Por lo tanto, evaluamos los efectos de agregar concentraciones crecientes de los tres isómeros en el lactato, el succinato y otros intermedios del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) seleccionados. Como se muestra en la gráfica del análisis de componentes principales (PCA) en la Fig. 1a, los efectos de los isómeros diferían notablemente 6 h después de la adición y eran mayores para el itaconato. Es de destacar que, a las 24 h, los cambios debidos al itaconato aumentaron aún más, mientras que los debidos al mesaconato y al citraconato comenzaron a normalizarse (Fig. 1a). Los tres isómeros redujeron notablemente las concentraciones de lactato a las 6 h (Fig. 1e), pero el efecto disminuyó a las 24 h (Datos extendidos, Fig. 3a). Sorprendentemente, hubo un aumento único dependiente de la dosis en succinato en ambos puntos de tiempo después de la adición de itaconato, consistente con la inhibición de SDH, mientras que después de agregar mesaconato o citraconato, los niveles de succinato aumentaron ligeramente solo a las 24 h. Sin embargo, cuando se usó la relación succinato/fumarato como medida de la inhibición de SDH, también fue evidente una inhibición débil con dosis altas de mesaconato a las 6 h (datos extendidos, Fig. 3h) y una inhibición muy débil (aproximadamente 2 % de inhibición por itaconato) por mesaconato y citraconato a las 24 h. La acumulación mucho mayor de succinato debido a la adición de itaconato también se verificó en dos experimentos que utilizaron células infectadas con IAV (Datos extendidos Fig. 3i, j).

Se ha argumentado que el itaconato inhibe la SDH mediante la alquilación covalente de los grupos SH en el sitio activo (SDHA)17. Sin embargo, la formación de aductos de Michael con glutatión (datos extendidos Fig. 4a-c) fue en realidad más eficiente con citraconato (que no inhibe SDH), y fue 8 y 48 veces mayor en comparación con itaconato y mesaconato, respectivamente (Fig. 2a–d y Tabla Suplementaria 1). De hecho, los cálculos del índice de electrofilia y el orbital molecular desocupado más bajo (ω) 18 identificaron al citraconato como el electrófilo más fuerte y al mesaconato como el electrófilo más débil (Datos extendidos, Fig. 4d y Tabla complementaria 1).

Teniendo en cuenta la discrepancia entre la electrofilia de los compuestos (capacidad de alquilación de SH) y la actividad inhibidora de SDH, empleamos modelos estructurales para probar modos de unión alternativos. De hecho, la unión covalente a los residuos de cisteína más cercanos como el principal modo de inhibición se consideró inverosímil para el itaconato en SDHA humana y porcina (Fig. 2e, f complementaria). Dada la similitud estructural del itaconato con el succinato y los inhibidores similares a sustratos como el oxaloacetato, el itaconato puede dirigirse al sitio de unión del succinato a través de un mecanismo competitivo. El acoplamiento de los tres isómeros en el sitio activo de la SDHA humana y porcina reveló que se predice que el itaconato se unirá en el sitio de unión del succinato a través de interacciones electrostáticas con energías de unión favorables similares al oxaloacetato (Datos extendidos Fig. 4e,f y Fig. 2h complementaria ). El mesaconato y el citraconato muestran pocos contactos debido a la rigidez y planaridad que les confiere la conjugación extendida. Cabe destacar que el mesaconato es un análogo del producto de oxidación de succinato fumarato y es plausible que participe en interacciones con SDHA (Datos extendidos Fig. 4g, h y Fig. 2i complementaria), mientras que la configuración cis del citraconato parece ser desfavorable. para encuadernación (Fig. 2j complementaria). Un ensayo de actividad de SDH in vitro usando mitocondrias bovinas (cuyo sitio activo está 100% conservado en SDH humano) confirmó una fuerte inhibición de SDH por itaconato y esencialmente ninguna por citraconato, pero reveló un grado moderado de inhibición por mesaconato (Datos extendidos Fig. 4i ). De acuerdo con la evidencia bioquímica reciente19, estos resultados sugieren que el itaconato inhibe la SDHA a través de interacciones directas no covalentes con el centro activo. El bajo grado de inhibición de SDH por parte del mesaconato en nuestros experimentos basados ​​en células puede deberse a una menor entrada citoplásmica-mitocondrial o porque su fuerza de inhibición es insuficiente para causar diferencias pronunciadas en condiciones de estado estacionario.

Los derivados de itaconato se están estudiando como compuestos antivirales y tratamientos complementarios para modificar las respuestas del huésped en infecciones virales9,10. Por lo tanto, infectamos células dTHP1 y A549 con IAV y las tratamos con concentraciones no tóxicas de los tres isómeros, según lo determinado por el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) ( Figura complementaria 1h). Los análisis se realizaron en el momento de máxima respuesta intracelular a la infección, es decir, 12 h después de la infección (pi) (dTHP1) y 24 h pi (A549)20. Al igual que los macrófagos humanos primarios, las células dTHP1 admiten una infección por IAV no productiva que presenta replicación de ARN viral y una fuerte respuesta intracelular, pero no la liberación de viriones de progenie. En este tipo de células, los tratamientos no condujeron a una reducción notable en la síntesis del ARN mensajero (ARNm) de la hemaglutinina viral (HA) (Datos ampliados, Fig. 5a). Por el contrario, las células A549 favorecen la infección productiva con la liberación de nuevos viriones. Como era de esperar, a las 24 h pi hubo altos niveles celulares de ARNm de HA y títulos altos de IAV en los sobrenadantes de cultivo. La adición de los isómeros no afectó los niveles de ARNm de HA, pero, notablemente, los tres redujeron fuertemente los títulos virales en los sobrenadantes (itaconato, 30 veces; mesaconato, 36 veces; citraconato, 53 veces) (Datos extendidos Fig. 5b, c ). Por lo tanto, los tres isómeros poseen propiedades anti-IAV que aparentemente interfieren con la producción o liberación de nuevas partículas virales, presumiblemente al interferir con un proceso postranscripcional.

Para buscar correlatos metabólicos de sus efectos antivirales y obtener una visión más amplia de los efectos únicos y compartidos de los tres isómeros en el metabolismo celular, empleamos este modelo de infección por IAV en un análisis específico de aminoácidos y metabolitos relacionados. El impacto de IAV en el metabolismo de los aminoácidos fue débil en las células dTHP1, pero los tres isómeros efectuaron alteraciones pronunciadas en el metabolismo de los aminoácidos en las células infectadas que eran distintas de los cambios debidos al 4-OI (que se aplicó para comparación) y también aparecieron para diferir entre los isómeros (Datos extendidos Fig. 5d). En las células A549, el impacto de la infección fue mucho más fuerte, pero los isómeros efectuaron cambios adicionales en las poblaciones de metabolitos relacionados con los aminoácidos (Datos extendidos, Fig. 5e). El mayor impacto de la infección en el metabolismo de los aminoácidos en las células A549 fue evidente en que 21 analitos fueron diferencialmente abundantes (17 de los cuales se redujeron), mientras que solo un analito (Cys) cambió significativamente en las células THP1 (Datos extendidos Fig. 5f). Del mismo modo, la infección cambió los valores de 12 indicadores de metabolitos en las células A549, pero solo dos en las células dTHP1 (Datos extendidos Fig. 5g). El tratamiento de células dTHP1 infectadas con IAV con los isómeros dio como resultado 24 analitos significativamente cambiados, 19 de los cuales disminuyeron (Figuras complementarias 3a, b). Algunos efectos se asociaron únicamente con un isómero, pero otros fueron compartidos por dos o los tres. Por ejemplo, los tres isómeros aumentaron la actividad de prolil hidroxilasa prevista (una actividad enzimática importante para la desestabilización del factor 1α [HIF-1α] inducible por hipoxia), pero el itaconato y el citraconato tuvieron los mayores efectos sobre los niveles de prolina y trans-4-hidroxiprolina (Fig. .4j–l). Mesaconate efectuó el mayor número de cambios significativos; en particular, redujo ampliamente los niveles de aminoácidos, lo que fue evidente en todas las subclases de aminoácidos (Figuras complementarias 3c y 4b, c). En las células A549, los tratamientos provocaron menos cambios significativos, probablemente debido al mayor impacto de la infección (Fig. 3e-h complementaria). Esto se ejemplifica con Arg, His, Lys y Trp, cuatro aminoácidos que son importantes para la replicación del virus de la influenza y que normalmente se reducen en la infección productiva por el virus de la influenza21. Todos estos se redujeron significativamente en las células A549 infectadas, pero (a diferencia de las células dTHP1) los tratamientos no condujeron a una reducción adicional notable (Fig. 4d-g complementaria). No obstante, los efectos distintos y compartidos de los isómeros fueron evidentes en las células A549. Por ejemplo, los tres isómeros aumentaron los niveles de quinurenina (Kyn) y predijeron la actividad de IDO1, una enzima potencialmente inmunosupresora responsable de la conversión de Trp a Kyn y la generación de NAD+ como producto final de la vía Trp-Kyn-NAD+ (Suplementario Fig. 4h, i), mientras que el itaconato aumentó preferentemente los niveles de Thr, Ala, Ser, Asp y dimetilarginina asimétrica (Fig. 4m-q complementaria). Las poliaminas desempeñan un papel importante en las interacciones virus-huésped en múltiples pasos, en su mayoría postranscripcionales22. Las tres poliaminas medidas eran intermediarios de la vía N1-acetiltransferasa de espermidina/espermina, y su agotamiento puede inhibir la replicación del virus de ARN23. De hecho, los tres isómeros tendieron a disminuir los niveles de poliamina en las células A549 infectadas, aunque solo se logró significación en P <0.05 en el caso del precursor ornitina (Fig. 4t-y complementaria). En conjunto, estos resultados demuestran que las concentraciones suprafisiológicas (que imitan la aplicación farmacológica) de los isómeros de itaconato ejercen efectos profundos sobre el metabolismo de los aminoácidos en las células infectadas con IAV, que pueden diferir sustancialmente según el isómero, el tipo de célula y el tipo de infección (productiva versus no productiva). productivo), y puede relacionarse funcionalmente con redes antivirales como la vía de las poliaminas.

Teniendo en cuenta que el citraconato es el electrófilo más potente de los tres isómeros, comparamos la capacidad de los isómeros para activar la vía de señalización KEAP1-NRF224. El citraconato ejerció el efecto estabilizador más fuerte sobre NRF2 en los queratinocitos HaCaT e indujo el ARNm que codifica el miembro B10 de la familia 1 de aldo-ceto reductasa (AKR1B10, un factor aguas abajo inducido por NRF2) con mayor fuerza (Fig. 2a-c). En las células NRF2–/– HaCaT, la expresión del ARNm de AKR1B10 fue menor al inicio del estudio y hubo una inducción significativa solo en las concentraciones más altas de citraconato, con un cambio menor que en las células de tipo salvaje (Fig. 2d). Al analizar 14 genes25 potencialmente regulados por NRF2, el citraconato efectuó la inducción más fuerte, en general, en las células de tipo salvaje, mientras que la expresión de la mayoría de los objetivos al inicio y después de la estimulación fue menor en las células NRF2–/– (Datos extendidos Fig. 6a,b) . La estimulación con IFN-γ de las células HaCaT de tipo salvaje dio como resultado una marcada regulación a la baja del ARNm de SLC7A11, que fue rescatado por citraconato en las células de tipo salvaje pero no en las células NRF2-/- (Fig. 2e). De manera similar, en células dTPH1 infectadas con IAV, la aplicación de citraconato aumentó la expresión de ARNm de SLC7A11, GCLM y ME1, mientras que el mesaconato no tuvo efecto (Datos extendidos Fig. 6c-e). Estos efectos inductores fueron modestos, lo que concordó con la clasificación de los isómeros como electrófilos moderados (Tabla complementaria 1). El itaconato puede reducir los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS)14. Comparamos la actividad anti-ROS de los tres isómeros en células dTHP1 infectadas con IAV. La infección condujo a un aumento significativo en el número de células positivas para ROS mitocondriales, que se revirtió significativamente con itaconato y citraconato, mientras que la reducción de ROS por mesaconato fue solo marginalmente significativa (Fig. 2f).

a–d, Citraconate es el agonista NRF2 más potente. a, b, Estabilización de la proteína NRF2 en células de tipo salvaje. Western blot (3 h después de la estimulación) de dos experimentos independientes (a) y mediciones densitométricas combinadas de las bandas a 110–120 kDa correspondientes a NRF2 (b) (n = 2). c, d, Expresión del ARNm de AKR1B10 inducible por NRF2 en células de tipo salvaje y NRF2-/- 16 h después de la estimulación. Las células se pretrataron con isómeros de itaconato durante 6 h o se dejaron sin tratar y luego se estimularon con IFN-γ (300 U ml−1) durante 10 h en presencia o ausencia de los isómeros (n = 6, media ± sd). e, el citraconato rescata la supresión del ARNm de SLC7A11 por IFN-γ en células HaCaT de tipo salvaje, pero no en NRF2–/– (RT–qPCR). f, Citraconate ejerce efectos antioxidantes similares a itaconate. Se infectaron células dTHP1 con IAV y se midieron ROS a las 12 h pi (isómeros de itaconato = 25 mM, 4-OI = 125 µM). g – n, efectos inmunomoduladores compartidos y distintos de los isómeros y 4-OI. Se infectaron células dTHP1 con IAV en ausencia o presencia de itaconato, mesaconato, citraconato (concentraciones variables) o 4-OI (125 µM), y se midieron las moléculas relacionadas con la inflamación a las 12 h pi g,h, Los niveles de ARNm de CXCL10 en sedimentos celulares y proteína CXCL10 en el sobrenadante. i, Efectos diferenciales sobre polipéptidos relacionados con la inflamación en sobrenadantes de cultivos celulares (ensayo de 27 plex; experimento separado de g,h; concentraciones de isómeros = 20 mM, 4-OI = 125 µM). PCA basado en concentraciones de 25 objetivos que pasaron la calidad evaluación. c–i, n = 3 réplicas biológicas, media ± sd j,k, los isómeros de itaconato reducen la fosforilación de STAT1. Las células A549 y dTHP1 (una transferencia representativa de dos réplicas) se pretrataron con isómeros de itaconato (25 mM) o 4-OI, se infectaron con IAV durante 2 h y se trataron durante 10 h (dTHP1) y 22 h (A549) (anti-P -inmunotransferencia STAT1). l–n, el citraconato reduce las respuestas de IFN inducidas por IAV en el tejido pulmonar humano. Los explantes de pulmón se infectaron con IAV (2 × 105 FFU ml−1) en presencia o ausencia de itaconato, citraconato y 4-OI en las concentraciones indicadas (mM). La expresión de los ARNm diana se midió a las 24 h pi (cinco explantes, tres piezas por explante, n total = 15, mediana, rango intercuartílico). Citra, ácido citracónico; Ita, ácido itacónico; Mesa, ácido mesacónico. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; ANOVA unidireccional con prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, excepto l – n (prueba U de Mann-Whitney de dos colas con corrección de Bonferroni).

Datos fuente

El itaconato tiene fuertes propiedades inmunomoduladoras3,4 y, por lo tanto, probamos si el mesaconato y el citraconato también modifican las respuestas inflamatorias. En células dTHP1 infectadas con IAV, los tres isómeros redujeron el ARNm que codifica el ligando 10 de quimiocinas con motivo CXC (CXCL10), mientras que la reducción de la proteína CXCL10 en los sobrenadantes celulares fue mayor con itaconato y citraconato (Fig. 2g, h). El itaconato y el citraconato redujeron el ARNm de interleucina-6 (IL-6), ninguno afectó la transcripción de IL-1β, y solo el mesaconato y el citraconato redujeron el ARNm del factor de necrosis tumoral-α (TNFα) (Datos extendidos Fig. 6f-h). En un experimento independiente, la infección por IAV condujo a una reprogramación sustancial de las poblaciones de citoquinas/quimioquinas en los sobrenadantes, que fue fuertemente modulada por la adición de 4-OI, pero menos por los tres isómeros (Fig. 2i). No obstante, se observaron efectos comunes y únicos de los tres isómeros (Datos extendidos Fig. 6i-q). Nuevamente, solo el itaconato y el citraconato redujeron significativamente los niveles de proteína CXCL10. Los tres isómeros redujeron las concentraciones de IL-1β y proteína inflamatoria de macrófagos-1β (CCL4), mientras que solo el mesaconato redujo la IL-2 y el factor de necrosis tumoral-α. Cabe destacar que los tres isómeros aumentaron las concentraciones de la quimiocina CCL5 (RANTES), mientras que solo el itaconato y el citraconato aumentaron notablemente las concentraciones de IL-8. Este análisis reveló que: (1) la 4-OI ejercía los efectos "normalizadores" más potentes sobre la liberación de citoquinas/quimioquinas de las células dTHP1 infectadas; (2) el mesaconato y el citraconato aplicados exógenamente poseen propiedades inmunomoduladoras comunes y únicas (algunas de las cuales se comparten con el itaconato); y (3) las posibles consecuencias funcionales pueden relacionarse en parte con las diferencias en el reclutamiento de células inflamatorias adicionales. Para probar si la reducción observada en los niveles de ARNm y proteína de CXCL10 se debió a la disminución de la señalización canónica de IFN tipo I, evaluamos los efectos de los isómeros en el transductor de señal y la fosforilación del activador de la transcripción 1 (STAT1) en células dTHP1 y A549. La infección por IAV aumentó en gran medida los niveles de STAT1 fosforilado y no fosforilado, y los tres isómeros redujeron los niveles de STAT1 fosforilado pero no no fosforilado (Fig. 2j, k). El mesaconato tuvo un efecto algo más débil en las células dTHP1, mientras que el 4-OI fue, con mucho, el más potente en ambos tipos de células. El potencial anti-IFN del citraconato también se verificó en tejido pulmonar humano cultivado ex vivo. La infección por IAV condujo al aumento esperado en el ARNm viral de HA, IFIT1 y CXCL10. Aunque no hubo una reducción significativa en los niveles de ARN de HA viral, el citraconato redujo significativamente la expresión de IFIT1 y CXCL10 (Fig. 2l-n).

De varios compuestos con similitud con el cis-aconitato, solo el citraconato demostró ser un inhibidor de ACOD1. Sorprendentemente, no afectó la actividad de Aspergillus ACOD1, pero el citraconato 10 mM disminuyó la actividad de ACOD1 humano y murino en aproximadamente un 90 % (Fig. 3a-c y Datos extendidos Fig. 7a,b). La inhibición de ACOD1 por el citraconato también se verificó en células A549 que expresan ACOD1. De hecho, hubo una disminución dependiente de la dosis en la acumulación de itaconato en presencia de citraconato (Fig. 3d). Esto no se debió a la disminución de la expresión de ACOD1, porque los niveles de ARNm no se vieron afectados (Fig. 3e). Se encontró que la concentración de citraconato en el medio que resultó en la mitad de la inhibición máxima de la actividad de ACOD1 (IC50) fue de 50 µM (Fig. 5d, e complementaria). La comparación de la huella dactilar del farmacóforo de los tres isómeros de itaconato con la del cis-aconitato mostró que el citraconato tiene el coeficiente de Tanimoto más alto, es decir, la mayor similitud con el cis-aconitato (Datos ampliados, Fig. 7c). Esto sugirió que se une al sitio activo de ACOD1 y actúa como un sustrato análogo. De hecho, el modelado estructural predijo que se une favorablemente al sitio activo de ACOD12 humano y al homólogo murino2 en un modo similar al cis-aconitato (Fig. 3f-h y Datos extendidos Fig. 7d, e), mientras que el itaconato no plano y el mesaconato de isómero trans muestra energías de unión más bajas y se ajusta de manera menos óptima (Datos extendidos, Fig. 7f).

a–c, ensayo sin células. Se incubó hACOD1 recombinante con concentraciones crecientes de sustrato (cis-aconitato) e inhibidor (citraconato) y se midió la acumulación de itaconato por HPLC. n = 3 ensayos independientes, media ± sd La línea representa un ajuste de curva a la ecuación de Michaelis-Menten con un inhibidor competitivo. b, diagrama de Lineweaver-Burk de los datos que se muestran en a (media ± sd). c, resumen de la enzima y la cinética de inhibición basada en a (hACOD1) y los datos que se muestran en los datos extendidos, Fig. 7a,b (mACOD1). d, e, Ensayo basado en células. Se transfectaron células A549 con un plásmido que sobreexpresa hACOD1 y se incubaron con concentraciones crecientes de citraconato. Las concentraciones intracelulares de citraconato e itaconato se midieron mediante HPLC-MS/MS. Agregar citraconato conduce a una acumulación reducida de itaconato de una manera dependiente de la dosis (d), que no se debe a una transcripción disminuida de hACOD1 (e). n = 3 réplicas biológicas (d), n = 6 réplicas biológicas (e), media ± sd f–g, modo de unión putativo de citraconato (amarillo) en el sitio activo de hACOD1 (PDB ID: 6R6U)2. f, Los grupos carboxilo C1 y C4 del citraconato están óptimamente anclados en el sitio activo a través de una red de atracciones electrostáticas; es decir, enlaces de hidrógeno y puentes salinos (líneas discontinuas) con los residuos His159, Lys207, Lys272 y Leu278. Superficie de proteína electrostática en el sitio activo: positivo (azul), negativo (rojo) y neutro (blanco). g, Interacciones de ligandos bidimensionales. h, Modelado molecular de itaconato (amarillo) en comparación con cis-aconitato (magenta) que revela menos interacciones entre los dos grupos carboxilo de itaconato y los residuos básicos del sitio activo hACOD1, principalmente debido a su estructura no plana y flexible. IC: intervalos de confianza; citra, citraconato.

Para estudiar la cinética celular de los efectos de la inhibición de ACOD1 en un modelo clásico de activación de macrófagos, realizamos un experimento de curso de tiempo de 36 h de activación de LPS/IFN-γ de células dTHP1 en presencia de dos concentraciones diferentes de citraconato y concentraciones medidas de intermedios TCA, itaconato y mesaconato. PCA demostró efectos relativamente leves de un pretratamiento de 6 h con citraconato en células no estimuladas, pero una reprogramación progresiva de TCA durante la estimulación con LPS/IFN-γ (Fig. 4a). Cabe destacar que los tratamientos con citraconato tendieron a revertir los cambios inducidos por LPS/IFN-γ, lo que se debió principalmente (pero no exclusivamente) a la prevención de la acumulación de itaconato y mesaconato. Específicamente, en células estimuladas no tratadas, el itaconato se acumuló rápidamente y alcanzó su punto máximo a las 12 h, mientras que el citraconato 1 mM previno esencialmente el itaconato y redujo en gran medida la acumulación de mesaconato (Fig. 4b, c). El efecto inhibitorio del citraconato persistió durante 36 h, lo que coincidió con los niveles constantes de citraconato intracelular a lo largo del tiempo (Fig. 4d). Inesperadamente, la falta de síntesis de itaconato no estuvo acompañada de un aumento en los niveles de cis-aconitato en puntos de tiempo tempranos, lo que podría deberse a la menor disponibilidad de su precursor citrato (Fig. 4g, i). Ambas concentraciones de citraconato redujeron los niveles de lactato; en particular, la concentración de 0,1 mM condujo a una disminución moderada de los niveles de succinato y de la relación succinato/fumarato, lo que sugiere un modesto aumento de la actividad de SDH debido al alivio de la inhibición de SDH por el itaconato endógeno. El valor IC50 medido del citraconato intracelular para la catálisis ACOD1 (Fig. 5a-c complementaria) coincidió bien con los valores medidos en el ensayo sin células (Fig. 3c).

Las células dTHP1 se estimularon con LPS (200 ng ml−1) e IFN-γ (400 U ml−1) durante los tiempos indicados en ausencia o presencia de citraconato 0,1, 1, 5, 10 y 25 mM. Las células dTHP1 no estimuladas tratadas durante 6 h se usaron como control adicional. Los isómeros de itaconato, el lactato y los mismos intermedios de TCA que en la Fig. 1 se midieron mediante LC-MS/MS. Las concentraciones de citraconato 0,1 y 1 mM en el medio dieron como resultado una fuerte inhibición de ACOD1 en concentraciones de citraconato intracelular fisiológicamente plausibles y, por lo tanto, se usaron para los análisis que se muestran en a–l. Los datos obtenidos con las concentraciones de 5 a 25 mM se usaron adicionalmente para calcular los valores de IC50. a, PCA basado en todos los analitos excepto el citraconato. b-e, Evolución temporal de las concentraciones de itaconato (b), mesaconato (c), citraconato (d) y relación succinato/fumarato (e). f–l, Concentraciones de lactato y TCA intermedios seleccionados. m–o, la inhibición de ACOD1 por el citraconato no tiene un fuerte efecto sobre la inflamación en las células dTHP1 activadas por LPS-IFN-γ. Configuración experimental idéntica a a–l. Los niveles de los ARNm indicados se midieron mediante RT-qPCR 12 h después de la estimulación. m, ARNm de CXCL10. n, ARNm de IL-6. o, ARNm de IL-1β. Citra, ácido citracónico; ita, ácido itacónico. b–o, n = 3 réplicas biológicas, media ± sd *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett.

Teniendo en cuenta que la inhibición de ACOD1 resultó de concentraciones de citraconato sustancialmente más bajas que los efectos inmunomoduladores (0.03–1 mM versus 10–25 mM), luego probamos si la concentración más baja daría como resultado un fenotipo relacionado con la inflamación, que probablemente se deba a la abrogación farmacológica. de la síntesis de itaconato endógeno. Con este fin, activamos las células dTHP1 con LPS/IFN-γ, lo que da como resultado una activación máxima y una expresión de ACOD1 mucho mayor que la infección con virus como IAV. Aunque la estimulación con LPS/IFN-γ resultó en una vigorosa regulación positiva de IL-1β, IL-6 y ARNm de CXCL10, el tratamiento con citraconato 1 mM o itaconato 1 mM (usado como control que no inhibe ACOD1) no afectó a CXCL10 e IL ARNm de -1β en un grado notable. Por el contrario, la concentración de 25 mM de cualquiera de los isómeros redujo los niveles de ARNm de IL-6 (Fig. 4m-o). Por lo tanto, la inhibición farmacológica de la síntesis de ácido itacónico endógeno por dosis bajas de citraconato no tuvo un impacto importante en el fenotipo inflamatorio de las células dTHP1 activadas al máximo, mientras que se observó una reducción en el ARNm de IL-6 a la concentración más alta (inmunomoduladora). En un experimento separado, luego probamos si las concentraciones altas o bajas de los dos isómeros afectarían la respiración mitocondrial. El itaconato a 25 mM, pero no el citraconato, redujo la respiración máxima y la capacidad de reserva de las células dTHP1 no estimuladas o de las células dTHP1 estimuladas con LPS/IFN-γ (Datos ampliados, Fig. 8), lo que fue consistente con la reducción del flujo a través de la cadena de transporte de electrones debido a inhibición de SDH y estuvo de acuerdo con nuestra observación de que el citraconato no inhibe SDH (datos extendidos Fig. 4). La estimulación con LPS/IFN-γ redujo la respiración basal, la respiración máxima y la capacidad respiratoria de repuesto, y el citraconato 1 mM tendió a normalizar la respiración máxima y la capacidad respiratoria de repuesto, mientras que el citraconato 25 mM tendió a normalizar solo la capacidad respiratoria de repuesto. Los efectos del citraconato en dosis bajas podrían explicarse mediante un modelo en el que la inhibición de ACOD1 conduce a una acumulación reducida de itaconato endógeno, lo que a su vez aumenta el flujo de electrones al aliviar la inhibición de SDH mediada por itaconato.

En conjunto, nuestros resultados revelan que el mesaconato y el citraconato son parientes cercanos del itaconato previamente subestimados que ejercen efectos únicos y compartidos biológicamente relevantes sobre el metabolismo, la inflamación y la infección por virus. El resumen gráfico y la tabla de datos ampliados 1 resumen y comparan las características clave de los tres isómeros. Las diferencias observadas en los efectos probablemente se deban a las diferencias en las interacciones electrostáticas, las propiedades estéricas y la electrofilicidad, que a su vez podrían verse afectadas por la nucleofilicidad de los posibles donantes asociados de Michael. Las marcadas disparidades entre los tres isómeros en la inhibición de ACOD1 (citraconato) o SDH (itaconato) ejemplifican los efectos de las diferencias electrostáticas y estéricas, y la mayor capacidad del citraconato para inducir NRF2 probablemente se deba a su mayor electrofilia. Esto último también puede explicar su mayor efecto sobre la producción de IAV a partir de células A549, porque se ha demostrado que la inhibición a través de la vía de la exportina 1 por compuestos basados ​​en un esqueleto de itaconato inhibe la exportación de ribonucleoproteína viral al citoplasma mediante la alquilación SH de un residuo crítico de Cys9 . Citraconato puede, por lo tanto, efectuar la reducción más fuerte en la replicación de IAV en células A549 debido a su mayor capacidad para alquilar este residuo. Se ha propuesto que el itaconato ejerce efectos antivirales en virtud de la inhibición de SDH26, pero es poco probable que la inhibición de SDH desempeñe un papel en los efectos antigripales de los tres isómeros, porque el citraconato (que no inhibe la SDH) inhibió la replicación de IAV de manera más eficiente. .

Identificamos al citraconato como el primer inhibidor endógeno de ACOD1, pero se desconocen las consecuencias fisiológicas a nivel del organismo. En ratones sanos, encontramos previamente los niveles más altos de citraconato en los ganglios linfáticos5. Aunque se desconocen los tipos de células que contienen citraconato, es tentador especular que puede modular los procesos inmunitarios en los ganglios linfáticos al inhibir ACOD1. Debido a que no hay evidencia de que ocurra citraconato en las células mieloides, tal inhibición de ACOD1 probablemente tendría que ocurrir de manera paracrina. Su papel como agonista endógeno de NRF2 también requiere una mayor exploración, particularmente porque se desconocen los tipos de células que albergan citraconato in vivo. Teniendo en cuenta que el citraconato no se detectó en las células dTHP1 activadas, consideramos poco probable que desempeñe un papel más destacado en la señalización de NRF2 en los macrófagos que el itaconato. Nuestros resultados corroboran un modelo previamente formulado de que el mesaconato se deriva del itaconato6,7 (consulte también el artículo adjunto de He et al.27), pero uno solo puede especular sobre el origen o los orígenes fisiológicos del citraconato en humanos. Mostramos que no se deriva de itaconato o mesaconato. Basado en estudios de pacientes con aciduria metilmalónica, se ha propuesto que es un derivado de la isoleucina BCAA a través de tiglyl-CoA8. El metabolismo de los BCAA es un componente crítico de la homeostasis inmunológica y energética, y el citraconato puede, por lo tanto, constituir parte de las redes reguladoras que gobiernan el metabolismo de los BCAA. En general, el citraconato parece ser el isómero con mayor potencial para el desarrollo de fármacos traslacionales. Sus características multifacéticas, como las propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antivirales, lo convierten en una columna vertebral particularmente atractiva para el desarrollo de fármacos farmacológicamente optimizados para tratar trastornos provocados por inflamación, infección viral o ambos. La relevancia farmacológica de la inhibición de ACOD1 por parte del citraconato queda por explorar in vivo. Nuestros estudios con dosis bajas de citraconato (1 mM) sugieren que la anulación de la síntesis de itaconato endógeno puede no tener un fuerte impacto en la activación máxima de los macrófagos humanos, al menos con respecto al ARNm de CXCL10, IL-6 e IL-1β. La mayor parte del trabajo sobre el papel del itaconato endógeno se ha realizado en ratones, y se han descrito fenotipos hiperinflamatorios e hipoinflamatorios de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones ACOD1-/-28,29. Además, la ACOD1 murina es mucho más activa que la enzima humana, lo que da como resultado niveles de itaconato de cinco a diez veces más altos en los macrófagos activados en comparación con los humanos1,2. Por lo tanto, es posible que ACOD1 desempeñe un papel menos destacado en la regulación de la inflamación en humanos que en ratones. Además, las consecuencias de la inhibición de ACOD1 pueden manifestarse completamente solo a nivel del organismo y pueden no ser evidentes en modelos celulares. De hecho, recientemente descubrimos que la expresión de CXCL10 en macrófagos derivados de la médula ósea infectados con IAV no difería entre los ratones de tipo salvaje y los ratones ACOD1-/-, mientras que la inflamación pulmonar evaluada histológicamente era significativamente mayor en los ratones ACOD1-/-10. En contraste con la inflamación, el citraconato en dosis bajas tuvo un efecto marcado sobre los intermediarios del ciclo TCA y tendió a mejorar la respiración mitocondrial en células dTHP1 estimuladas con LPS/IFN-γ. Curiosamente, se ha demostrado que la acumulación de itaconato se correlaciona con la parálisis inmunitaria, como se encuentra, por ejemplo, en la sepsis30. Los derivados de citraconato pueden resultar beneficiosos en el tratamiento de pacientes con sepsis terminal u otros escenarios caracterizados por el agotamiento de la inmunidad innata. Además, teniendo en cuenta los efectos protumorigénicos de ACOD1, el citraconato puede resultar útil como andamio para el desarrollo de inhibidores de ACOD1 para la terapia del cáncer.

Nuestros resultados con respecto al mesaconato complementan los informados en el artículo adjunto de He et al.27. Usando análisis de flujo metabólico asistido por isótopos estables, estos autores demuestran que el mesaconato es de hecho un catabolito de itaconato. Informan sobre los efectos inmunomoduladores del mesaconato en macrófagos murinos, que parecen ser en gran medida independientes de Nrf2, y muestran efectos beneficiosos del mesaconato en un modelo de ratón de sepsis inducida por LPS. Además, muestran que el itaconato es un inhibidor de SDH mucho más potente que el mesaconato. Sin embargo, sus resultados difieren de los nuestros en que ven cierta inhibición de SDH por parte del mesaconato al analizar células completas. Las diferencias entre las observaciones de He et al. y por nosotros puede deberse a diferencias en las especies y ensayos utilizados. No obstante, en conjunto, los resultados de ambos artículos sugieren que es poco probable que la inhibición de la SDH por parte del mesaconato tenga un fuerte impacto biológico.

hACOD1 (aminoácidos 4–461) y mACOD1 (aminoácidos 4–462) se produjeron en Escherichia coli, se purificaron como se describió anteriormente2 y se almacenaron en tampón GF (HEPES 10 mM, pH 7,4, glicerol al 10 % v/v, NaCl 150 mM ). Los ensayos se realizaron por triplicado. Las enzimas en 46,6 µl de tampón GF (30 µg mACOD1 o 90 µg hACOD1) o 46,6 µl de tampón GF sin enzima se mezclaron con 3,3 µl de cis-aconitato 15 o 150 mM (pH 6,5), dando como resultado concentraciones finales de cis-aconitato de 1 o 10 mM. Los ensayos (50 μL) se incubaron a 37 °C durante 2 h y luego se colocaron en hielo. Para la extracción de ácidos orgánicos, se añadieron luego a la reacción 800 µl de disolvente de extracción (acetonitrilo/metanol 1:1) y el volumen resultante se transfirió a un tubo nuevo. Los tubos de reacción ahora vacíos se enjuagaron con agua (150 µl), que posteriormente se añadió a los tubos que contenían el ensayo de actividad en disolvente de extracción, dando como resultado un volumen final de 1000 µl. Las muestras se mezclaron durante 30 s y se almacenaron a –80 °C.

Se examinó un conjunto de ácidos carboxílicos (ácido pirúvico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido citracónico, ácido (2E)-2-etilbut-2-enodioico (EN300-234639, Enamina), ácido dl-isocítrico y ácido trans-aconítico). como posibles inhibidores. Los ácidos se disolvieron en agua y se neutralizaron. Los ensayos enzimáticos se realizaron en tampón de fosfato de sodio, pH 7,4, con cis-aconitato 2 mM y 10 mM del inhibidor potencial. Se utilizó la cantidad de enzima que descarboxilaría aproximadamente la mitad del sustrato por ensayo de 150 µl (20 µg de Aspergillus ACOD1, aminoácidos 12–490, 24 µg de hACOD1 y 5 µg de mACOD1). El itaconato se cuantificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), como se describe a continuación.

Se prepararon ACOD1 humano, de ratón y de Aspergillus como se describió previamente2 y se almacenaron en tampón GF (HEPES 10 mM, pH 7,4, glicerol al 10 % v/v, NaCl 150 mM). Las soluciones del inhibidor (ácido citracónico; Acros) y del sustrato (ácido cis-aconítico; Sigma-Aldrich), ambos pH 6.5 (NaOH), se almacenaron a –20 °C. Para el ensayo, se mezclaron en hielo 125 μl de tampón de fosfato de sodio 0,2 M, pH 6,5, con 5 μl de enzima, 10 μl de citraconato (o 10 μl de agua) y 10 μl de cis-aconitato. Las concentraciones finales del inhibidor fueron 50, 100 y 200 µM. Se usaron las siguientes combinaciones de cantidad de enzima y concentración de sustrato: 2 µg de hACOD1 o 0,4 µg de mACOD1 con sustrato 0,1, 0,2 o 0,5 mM; 3 µg de hACOD1 o 0,6 µg de mACOD1 con sustrato 1 o 2 mM; 5 µg de hACOD1 o 1 µg de mACOD1 con sustrato 5 o 10 mM. Los ensayos se realizaron por triplicado. La incubación a 37 °C durante 10 min fue seguida inmediatamente por la inactivación térmica de la enzima a 95 °C durante 3 min. El precipitado de proteína se sedimentó por centrifugación durante 1 hora. Los sobrenadantes se acidificaron con 100 μl de H3PO4 100 mM. El ácido itacónico se midió por HPLC (columna Shodex RSpak DE-413, 1 ml min−1 H3PO4 10 mM, volumen de inyección 10–20 µl, detección a 210 nm). Las curvas resultantes se ajustaron utilizando GraphPad Prism con la ecuación v = kcat[S]/(KM(1 + [I]/Ki) + [S]) (donde v = velocidad, kcat = constante de velocidad catalítica, KM = Michaelis- constante de Menten, Ki = constante de inhibidor) con las variables independientes concentración de inhibidor [I] y concentración de sustrato [S].

La inhibición de SDH se probó con el kit de ensayo de actividad MitoCheck Complex II (Cayman). El kit proporciona reactivos para medir la actividad SDH en mitocondrias de corazón bovino. El itaconato, el citraconato y el mesaconato se neutralizaron con NaOH (pH 7,4–7,7) y se analizaron en concentraciones de 10 mM, 3 mM, 1 mM, 0,25 mM, 50 µM y 10 µM. El inhibidor de SDH malonato disódico se utilizó como control positivo. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos por triplicado según las instrucciones del fabricante bajo inhibición de los complejos mitocondriales I, III y IV por rotenona 1 µM, antimicina A 10 µM y KCN 1 mM, respectivamente.

Se cultivó una línea celular de leucemia monocítica aguda humana (THP1, DSMZ n.º ACC 16) en RPMI 1640 (Gibco, n.º de catálogo 31870-025) complementada con suero fetal bovino avanzado inactivado por calor al 10 % (FBS-11A; Capricorn Scientific) y GlutaMAX-I al 1 % (100×; Gibco, nº de catálogo 35050-038), al 5 % de CO2 y a 37 °C. Se sembraron unas 5 × 105 células en placas de 12 pocillos (Falcon) y luego se diferenciaron en macrófagos adherentes. Las células se estimularon con 125 ng ml−1 de 13-acetato de forbol 12-miristato (Sigma-Aldrich, nº de catálogo P8139) durante 48 h en medio completo RPMI antes de renovar el medio. A continuación, se permitió que las células se diferenciaran aún más durante un día más. La diferenciación se verificó morfológicamente por microscopía y por citometría de flujo para la expresión de CD14 y CD11c. Células de adenocarcinoma humano que se asemejan a células epiteliales alveolares de tipo II (A549, ACC107, obtenidas de DSMZ) se propagaron en medio DMEM suplementado con FCS al 10 % y GlutaMAX-I al 1 %. La línea celular de queratinocitos humanos HaCaT fue proporcionada por T. Werfel (Hannover Medical School)31 y se cultivó en RPMI 1640 (Gibco, n.° de catálogo 21875-034) suplementado con FCS al 10 % al 5 % de CO2 y 37 °C. Las células NRF2–/– HaCaT se describen en la ref. 32. Se analizó la contaminación por Mycoplasma de todas las líneas celulares utilizando el kit de detección Venor GeM Classic Mycoplasma para PCR convencional (Minerva Biolabs, catálogo n.º 11-1100).

Las células dTHP1 se incubaron durante 6 o 24 h con diferentes concentraciones de itaconato (0,125, 5, 10 y 25 mM), mesaconato o citraconato (5, 10 y 25 mM) en 1 ml de RPMI. Después de la eliminación completa del medio y el lavado cuidadoso (de una a tres veces) de las células y los bordes de los pocillos con 1 ml de PBS, las células se extrajeron con 1 ml de tampón de extracción enfriado con hielo (acetonitrilo/metanol/agua, 2:2:1) que contenían estándares internos, seguido de mezcla durante 30 s y se mantuvieron a –20 °C para almacenamiento a corto plazo y a –80 °C para almacenamiento a largo plazo. Para el experimento de coestimulación LPS/IFN-γ, las células dTHP1 se trataron con 200 ng ml−1 de LPS (Sigma, nº de catálogo L6511) y 400 U ml−1 de IFN-γ humano (PeproTech, nº de catálogo 300-02 ) durante 0, 6, 12, 18, 24, 30 y 48 h y luego se extrajo con 1 ml de tampón de extracción enfriado con hielo como se describió anteriormente5.

Eliminamos un fragmento de 2962 pb (7347–10308) que abarcaba parte del exón 4 y la totalidad del exón 5. Las células THP1 se sometieron a electroporación transitoria con dos plásmidos de expresión EF1α-Cas9-2A-EGFP/U6-guideRNA (1250 V, 50 ms, 1 pulso; 5 × 106 células ml−1, 50 µg ml−1 cada plásmido), utilizando el sistema de transfección de neón (ThermoFisher Scientific)33, uno que contiene un ARN guía dirigido contra el exón 4 de ACOD1 (5′-CCATGGATTTTGATGACACG-3′) y el otro que contiene un ARN guía dirigido contra la región no traducida 3′ del locus ACOD1 (5′-CATGAGCCTCAAGGTTTTAG-3′). Las células se clasificaron para mejorar la expresión de proteína fluorescente verde después de 18 h y se sembraron como colonias de una sola célula mediante dilución limitada. Después de la expansión, los clones deficientes en ACOD1–/– se identificaron mediante PCR genómica y secuenciación de Sanger. La eliminación se verificó confirmando la ausencia de proteína ACOD1 por inmunotransferencia (Fig. 6b complementaria) y la ausencia de síntesis de itaconato por cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (Datos extendidos Fig. 2a).

Se infectaron unas 5 × 105 células dTHP1 con la cepa PR8M de IVA (H1N1) a una multiplicidad de infección de 1. En el caso de los tratamientos, las células se preincubaron durante 12 h con tampón de pH ajustado que contenía itaconato, mesaconato, citraconato y /o itaconato de 4-octilo a las concentraciones indicadas en las figuras y luego se incubaron con el virus durante 2 h en medio fresco para permitir la unión del virus y la entrada en las células. El medio de infección se reemplazó posteriormente con medio nuevo de pH ajustado que contenía el compuesto de tratamiento a la concentración indicada. Doce horas después de la infección, las células se lavaron en tampón, se sedimentaron y se extrajo el ARN para el análisis posterior de la expresión del ARNm mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR), utilizando las secuencias de cebadores enumeradas en la Tabla complementaria 2. Las concentraciones de CXCL10 en los sobrenadantes celulares fueron medido con el kit de desarrollo de ELISA ABTS estándar Human CXCL10 (PeproTech, n.º de catálogo 900-K39). Las concentraciones de citocinas/quimiocinas en los sobrenadantes se midieron utilizando el panel de citocinas humanas de 27 plex (Bio-Rad, nº de catálogo 171-A1112) como se describe en la ref. 10, del cual se usó el siguiente texto: "Se generaron curvas estándar con ocho diluciones en serie dobles a partir de 32 ng/mL. Se agregaron 100 μL de tampón de ensayo a cada pocillo de una placa de microfiltración, seguido de la adición de 50 μL de suspensión de perlas. Después de lavar las perlas con tampón de ensayo, se agregaron 50 μL de estándar o la muestra (sobrenadante) a cada pocillo y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con agitación suave. Se agregaron 25 μL de premezcla de anticuerpos para la detección. se agregó a cada pocillo seguido de incubación durante 30 min a TA con agitación suave. Se realizaron tres pasos de lavado utilizando 50 μL de tampón de ensayo en cada pocillo, seguido de lavado con solución de estreptavidina durante 10 min a TA con agitación. Lavado final con 125 μL de tampón de ensayo se realizó antes de la cuantificación utilizando el software BIO-PLEX Manager versión 4". IL-7 e IL-13 se excluyeron de análisis posteriores debido a concentraciones por debajo del límite de detección en la mayoría de las muestras.

Como se describió anteriormente34, se cultivaron células MDCK-II (American Tissue Culture Collection, n.º de catálogo CRL-2936) en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. Las células con una confluencia del 90 % se lavaron una vez con PBS++ (1x PBS que contenía Ca2+, Mg2+, BSA al 0,3 % (Sigma) y penicilina-estreptomicina (Invitrogen)) y las células se infectaron con diluciones de muestras de virus en serie de 10 veces y se incubaron a temperatura ambiente. temperatura durante 1 h. Se aspiró el inóculo de virus y se añadieron a cada pocillo 150 µl de Avicel al 1,25 % que contenía 1 µg de tripsina tratada con Np-tosil-L-fenilalanil clorometil cetona por ml y se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 h. A continuación, las células se fijaron a temperatura ambiente durante 1 h con PBS++ que contenía formaldehído al 3,7 % y Triton X-100 al 1 %. Las células se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 (0,05 %), luego se incubaron con anticuerpo primario (IgG monoclonal de ratón anti-IAV-NP, sobrenadante de hibridoma diluido 1:100; proporcionado por S. Ludwig, Universidad de Münster) a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, las células se lavaron tres veces y se incubaron con IgG conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-ratón de cabra (Invitrogen A16072) a temperatura ambiente durante 1 h. Se usó 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma) como sustrato para la inmunotinción y se incubó a temperatura ambiente durante 30–60 min. Después de un claro desarrollo de los focos teñidos de rojo, se contaron para determinar el título viral en unidades formadoras de focos (FFU) usando la ecuación FFU ml−1 (stock) = (1/dilución de virus) × (número de focos) × (factor de dilución).

El uso de tejidos humanos fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Hannover (archivo n.º 2923-2015) y todos los donantes dieron su consentimiento informado para el uso del tejido con fines de investigación. El tejido pulmonar explantado de pacientes con una indicación clínica para el trasplante de pulmón se dividió en piezas de aproximadamente 30 mg y se cultivó e infectó esencialmente como se describe en la ref. 10. Los tejidos se mantuvieron en tampón RPMI hasta 20 h antes del comienzo del experimento. Las piezas de tejido se pretrataron durante 14–19 h con tampón de pH ajustado que contenía el compuesto o solo el tampón y luego se incubaron en medio de infección RPMI que contenía IAV (2 × 105 FFU ml-1) y solo el compuesto o el tampón durante otras 24 h. Se utilizaron tres piezas de cada uno de cinco donantes (tres enfisema, tres fibrosis pulmonar idiopática; dos hombres, tres mujeres; edad 58–66 años).

Las células se lavaron una vez en PBS enfriado con hielo y se lisaron en tampón RIPA enfriado con hielo (que contiene inhibidor de proteasa y fosfatasa). Tras la cuantificación de la proteína mediante el ensayo de Bradford, se añadió un volumen igual de tampón de muestra de Laemmli 2x. Las muestras se desnaturalizaron con calor a 95 °C durante 10 min. Los extractos de proteínas se resolvieron mediante electroforesis en gel y se transfirieron a una membrana de transferencia de nitrocelulosa NC de 0,2 µm (GE Healthcare, nº de catálogo 10600004). La unión no específica se bloqueó con leche descremada en polvo al 5 % y las bandas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada con anticuerpos primarios específicos para STAT1 (Santa Cruz Biotechnology, catálogo no. sc-345; diluido 1:500), fosfo-STAT1 ( Cell Signaling, n.° de catálogo 9167S; diluido 1:1000), NRF2 (Cell Signalling, n.° de catálogo 12721S; diluido 1:1000), seguido de incubación con IgG-HRP anti-conejo de cabra (Southern Biotech, n.° de catálogo 4030- 05). La β-actina se visualizó utilizando el anticuerpo anti-β-actina conjugado con HRP (Abcam, n.° de catálogo ab49900) o el anticuerpo monoclonal de ratón IgG1 del anticuerpo β-actina (C4) (Santa Cruz Biotechnology, n.° de catálogo sc-47778). Las membranas se desarrollaron utilizando el reactivo de detección de transferencia Western Amersham ECL Prime (GE Healthcare, nº de catálogo RPN2232). Se usó un generador de imágenes de transferencia Western iNTAS (iNTAS Science Imaging) para obtener imágenes de la membrana.

Las células dTHP1 se sembraron a una densidad de 5 × 105 células por pocillo en una placa de 12 pocillos. Las células se preincubaron con los tratamientos durante 12 h, se infectaron con IAV (multiplicidad de infección de 1) y se incubaron con medio fresco que contenía los tratamientos. Los niveles de ROS mitocondriales se midieron 12 h después de la infección. Las células se incubaron durante 5 min con medio que contenía 5 μM de MitoSox Red (indicador de superóxido mitocondrial; ThermoFisher Scientific, catálogo n.° M36008) y luego se lavaron con PBS. Luego, las células se resuspendieron en PBS frío y los niveles de ROS mitocondriales se midieron a través del canal de ficoeritrina utilizando un citómetro de flujo BD LSR-II.

Se sembraron células HaCaT (1,5 × 105) en placas de 12 pocillos durante la noche, luego se trataron con las concentraciones indicadas de itaconato, mesaconato y citraconato durante 16 o 17,5 h. Luego, las células se lavaron en tampón, se sedimentaron y se extrajo el ARN para mediciones de ARNm mediante RT-qPCR utilizando las secuencias de cebadores enumeradas en la Tabla complementaria 2. La estabilización de NRF2 se evaluó mediante inmunotransferencia (ver arriba).

Se sembraron unas 2,5 × 104 células THP1 en una placa de 96 pocillos (Falcon) y luego se diferenciaron en macrófagos adherentes. Las células deben tener una confluencia del 80 % al 100 % antes de comenzar el ensayo. El stock de reactivo MTT (Life Technologies, n.º de catálogo M6494; 5 mg ml−1 en PBS) se diluyó 1:10 en medio complejo RPMI a 37 °C. Después de eliminar el sobrenadante, se añadieron 50 µl de la dilución preparada a las células y se incubaron a 37 °C durante 20–60 min mientras se observaba periódicamente el color de las células. El reactivo se eliminó cuando se completó la tinción y se añadieron 50 µl de dimetilsulfóxido (Merck). Después de mezclar en un agitador durante 5 a 15 minutos (hasta que la solución era homogénea), el cambio de color se cuantificó mediante un lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (BioTek Synergy 2), utilizando 540/570 nm como longitud de onda de medición y 630 nm como longitud de onda. longitud de onda de referencia.

El modelo de ratón se realizó esencialmente como se describe en la ref. 35, del cual se utilizaron partes del siguiente texto: "Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Luxemburgo y por las agencias gubernamentales correspondientes. El trabajo con animales del presente estudio se realizó y se informó de acuerdo con el ARRIVE (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) directrices para mejorar el diseño, el análisis y el informe de investigaciones con animales, maximizando la información publicada y minimizando los estudios innecesarios.Se obtuvieron ratones machos y hembras C57BL/6N de tres a cuatro meses de edad. de Charles River Laboratories (Francia). Los ratones se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con alimentos estériles y agua ad libitum. Los ratones estaban libres de patógenos específicos, se alojaron en jaulas ventiladas individualmente a un máximo de 5 por jaula y se mantuvieron a una temperatura de 22 °C y humedad relativa de 55 %, se mantuvieron sobre camas de mazorca de maíz esterilizadas en autoclave y se alimentaron con Dietas SAFE irradiadas a un mínimo de 25 kGy, el sistema de riego consistió en agua de ósmosis inversa con 2 ppm de cloro. Los ratones se trataron con una única inyección intraperitoneal de LPS (4 µg de LPS/g de peso corporal) o PBS como vehículo de control. Los ratones se anestesiaron profundamente con una combinación de ketamina (100 mg/ml; Nimatek Vet) y dorbeno (clorhidrato de medetomidina; 1 mg/ml; Dorbene Vet) 0, 12, 24 y 48 h después de la inyección de LPS. Los bazos se diseccionaron después de la perfusión transcardíaca con PBS enfriado con hielo, se recogieron en HBSS enfriado con hielo (Gibco/Life Technologies) con HEPES 1 M (Gibco/Life Technologies) y D-(+)-glucosa al 0,5 % (Sigma-Aldrich) y luego se almacena en nitrógeno líquido".

Las mediciones se realizaron de acuerdo con nuestro ensayo validado de cromatografía líquida de alto rendimiento y espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS)5. Brevemente, las muestras se extrajeron en 1000 µl de reactivo de extracción (metanol/acetonitrilo/agua con una relación final de 2:2:1 v/v/v; enriquecidas con citrato 13C2 0,1 µM y itaconato 13C5, 13C6-cis 0,2 µM -aconitato y succinato 13C4, y lactato 13C3 1 µM como estándares internos). Las suspensiones se transfirieron a tubos de reacción con cierre seguro de 2 ml (Eppendorf, nº de catálogo 0030120094), se agitaron durante 30 s y se congelaron a -20 °C durante la noche para completar la precipitación de proteínas. La preparación posterior de la muestra y el ensayo HPLC–MS/MS utilizando una columna de fase reversa Kinetex C18 (Phenomenex, n.º de catálogo 00D 4462 Y0) en un sistema de cromatografía Nexera (Shimadzu) acoplado a un espectrómetro de masas con trampa de iones lineal/triple cuadrupolo QTRAP5500 (Sciex ) se realizaron esencialmente como se describe5.

Los metabolitos celulares se extrajeron como se describe en la ref. 36, usando 6 × 106 celdas por muestra. Las concentraciones de aminoácidos (n = 20), metabolitos de aminoácidos (n = 30), aminas biogénicas (n = 9), succinato y lactato se midieron en un espectrómetro de masas AB SCIEX 5500 QTrap (Ab Sciex), utilizando el MxP Quant 500 kit (Biocrates Life Sciences) según protocolos del fabricante (https://biocrates.com/mxp-quant-500-kit). Las proporciones y sumas de analitos ("indicadores de metabolitos") se calcularon usando el software MetaboIndicator (Biocrates).

La tasa de consumo de oxígeno se determinó usando un Seahorse XF-96 Analyzer (Agilent) y el kit Mito Stress Test (Agilent, catálogo nº 103015-100) siguiendo los protocolos del fabricante. Brevemente, 2,5 × 104 células THP1 se sembraron en microplacas de cultivo celular Agilent Seahorse XF96 (n.º de pieza 101085-004) y se diferenciaron con forbol 12-miristato 13-acetato como se describe anteriormente. El día del ensayo, el medio de cultivo celular se cambió a medio Seahorse XF RPMI (Agilent, catálogo n.º 103576-100) que contenía glucosa 10 mM (Agilent, catálogo n.º 103577-100), piruvato 1 mM (Agilent, catálogo n.º 103578-100) y glutamina 2 mM (Gibco, n.º de catálogo 35050-038), y se colocaron en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante 45–60 min antes del ensayo. Tras la carga en el analizador Seahorse XF-96, se realizó la incubación secuencial in situ de los componentes de la siguiente manera: medición de referencia durante 18 min, oligomicina 1,5 µM (Agilent) durante 18 min, cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona 1 µM (Agilent) durante 18 min. min y rotenona/antimicina A 0,5 µM (Agilent) durante 18 min. Los datos de tasa de consumo de oxígeno se analizaron con el software Wave v.2.2.1 (Agilent).

Se agregaron ácido itacónico, mesacónico o citracónico (13,0 mg, 100 µM) o ácido oxaloacético (13,2 mg, 100 µM) en paralelo a un juego de cuatro tubos Eppendorf de 2 ml que contenían l-glutatión reducido (30,7 mg, 100 µM). Las mezclas de reacción se disolvieron en agua Milli-Q (1 ml) y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 h. Se transfirieron alícuotas de 10 µl a viales de LC-MS que contenían agua Milli-Q (490 µl), acetonitrilo (495 µl) y clorhidrato de difenhidramina (5 µl de solución 10 µM en acetonitrilo) como patrón interno. Los viales se taparon, se agitaron en vórtice y se sometieron a análisis de cromatografía líquida de ultra rendimiento y espectrometría de masas de alta resolución utilizando un sistema Dionex UltiMate 3000 UHPLC+ enfocado/Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap LC–MS/MS (ThermoFisher Scientific). Este sistema consta de bomba Dionex UltiMate 3000 RS, muestreador automático RS, compartimento de columna RS, detector de matriz de diodos y espectrómetro de masas cuadrupolo-Orbitrap, así como el software estándar Xcalibur v.4.4.16.14 para su funcionamiento. Como fase estacionaria se utilizó una columna RP EC 150/2 NUCLEODUR C18 Pyramid, 3 µm (150 mm × 2 mm) (Macherey-Nagel), y un sistema binario de solventes A y B (A = agua con 0.1% de ácido fórmico; B = acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico) como fase móvil. En una corrida de gradiente, el porcentaje de B se mantuvo constante a una concentración inicial de 1% de 0 a 2 min, luego se incrementó de 1% a los 2 min a 60% a los 8.5 min, luego a 95% a los 9.5 min y se mantuvo en 95% durante 0,4 min. El volumen de inyección fue de 2 μl y el caudal se fijó en 250 μl min−1. La temperatura de la columna fue de 40 °C y se adquirió el trazado ultravioleta a una longitud de onda de 254 nm. Los datos de espectrometría de masas de alta resolución se registraron en un sistema Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap. Los espectros de masas se adquirieron en modo positivo de 100 a 1000 m/z. El análisis de MS por ionización por electropulverización calentada se llevó a cabo a un voltaje de pulverización de 3800 V y una temperatura del tubo de transferencia de iones de 350 °C.

Todo el trabajo computacional se realizó utilizando Molecular Operating Environment (MOE), v.2020.09, Chemical Computing Group ULC, 910–1010 Sherbrooke St. W. Montreal, Quebec, H3A 2R7, Canadá. El procedimiento computacional fue adaptado de un protocolo informado37 con ligeras modificaciones.

Las estructuras bidimensionales de ácido itacónico, ácido mesacónico y ácido citracónico se esbozaron con ChemDraw professional 19.0 y se importaron a la ventana MOE. Los compuestos se sometieron a una minimización de energía hasta un gradiente de 0,001 kcal mol-1 Å2 usando el campo de fuerza MMFF94x y el modelo de solvatación de campo R, luego se guardaron como un archivo mdb. El estado de protonación predominante de los compuestos en medio acuoso a pH 7 se calculó mediante el cálculo | molécula | comando de lavado en la ventana del visor de la base de datos. Estructuras cristalinas de rayos X de SDHA humana en complejo con el cofactor oxaloacetato (ID de PDB: 6VAX)38, complejo respiratorio mitocondrial porcino II, que contiene oxaloacetato (ID de PDB: 3SFD)39, ACOD1 humano (ID de PDB: 6R6U)2 y ACOD1 de ratón (PDB ID: 6R6T)2 se utilizaron para los estudios de acoplamiento molecular. El potencial se configuró en Amber10:EHT como un campo de fuerza y ​​un campo R para la solución. La adición de átomos de hidrógeno, la eliminación de moléculas de agua de más de 4,5 Å del ligando o receptor, la corrección de errores de la biblioteca y la minimización de la energía anclada del sitio de unión se realizaron a través del módulo QuickPrep.

El sitio de unión se estableció en átomos ficticios que fueron identificados por el comando del buscador de sitios. Se seleccionaron los residuos de aminoácidos que delimitan el sitio de unión de oxalacetato/succinato en el sitio activo de la subunidad SDHA. Para ACOD1, el sitio de unión se definió según el supuesto sitio activo2. La ubicación del acoplamiento fue triangular con una opción de refinamiento de ajuste inducido. La primera función de puntuación fue alfa HB con 1000 poses, seguida de una puntuación de refinamiento London dG con 10 poses.

En la ventana del visor de la base de datos, se calcularon los descriptores moleculares para todas las entradas mediante la activación del panel de cálculo y la elección de la opción de cálculo de descriptores. Las energías (eV) del orbital molecular desocupado más bajo y el orbital molecular ocupado más alto se calcularon utilizando el modelo semiempírico de Austin 1 (AM1) hamiltoniano por el programa de química cuántica MOPAC v.7.0 incluido en MOE.

En la base de datos que contenía los dicarboxilatos, se calculó la huella dactilar bidimensional BIT_MACCS (166 claves estructurales públicas MDL MACCS, empaquetadas en bits) para todas las entradas. Se seleccionó succinato como estructura de consulta y se envió a la ventana del MOE. En la ventana del visor de la base de datos, la búsqueda de similitud se realizó eligiendo calcular | huella dactilar | comando de busqueda El sistema de huellas dactilares se configuró en BIT_MACCS y el coeficiente de Tanimoto (TC) como métrica de similitud. Los valores de TC van de 0 (sin similitud) a 1 (similitud total). La búsqueda de similitud para el cis-aconitato se realizó de la misma manera utilizando el piDAPH3 (farmacóforo de 3 puntos basado en la conformación 3D, considerando el sistema pi, las propiedades atómicas del donante y el aceptor) como huella digital y el cis-aconitato como estructura de consulta.

La importancia de las diferencias entre más de dos grupos se evaluó con un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Se usó la prueba t no pareada para evaluar la importancia de las diferencias entre dos grupos de n = 4 o n = 3, la prueba U de Mann-Whitney para la comparación de las medianas de los datos que no se distribuyen normalmente cuando n ≥ 7. Se ajustó para la prueba de múltiples hipótesis como se indica en las leyendas de las figuras. La significación se definió como un valor de P o tasa de descubrimiento falso ≤0,05 utilizando los siguientes símbolos: *≤0,05, **≤0,01, ***≤0,001 y ****≤0,0001. En los experimentos celulares, n siempre se refiere a réplicas biológicas, por ejemplo, células de la misma línea que fueron cultivadas en un pozo separado pero sujetas a las mismas manipulaciones experimentales que las otras réplicas. A menos que se indique lo contrario, los datos se muestran como medias, con barras de error que indican sd y los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v.9.3.1 (GraphPad Software). Para PCA, los valores se transformaron en log2 y luego se analizaron con MetaboAnalyst v.5.0 (https://www.metaboanalyst.ca). Los diagramas de Venn se dibujaron usando jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los datos de origen subyacentes al análisis relacionado con los aminoácidos que se muestran en la Fig. 5 de datos ampliados y las Figs. 3 y 4 están disponibles en los Datos complementarios 1. Los datos sin procesar que subyacen al análisis multiplex de citoquinas/quimiocinas que se muestra en la Fig. 2 y los Datos extendidos en la Fig. 6 están disponibles en los Datos complementarios 2. Los datos que respaldan las otras gráficas dentro de este documento y otros Los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos a Annette Garbe y Tarequl Nishad Islam por su asistencia técnica experta y a Djalil Coowar por supervisar el cuidado de los animales. Agradecemos el apoyo de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación Alemanes a través del proyecto Envejecimiento y Programación Metabólica (AMPro), la Iniciativa de la Asociación Helmholtz sobre Medicina Personalizada (iMed), el Fondo de Iniciativas y Redes de la Asociación Helmholtz y el Ministerio Federal de Ciencia y Tecnología de Alemania. Educación (BMBF) premio COVID-Protect (01KI20143C) (a FP). El sitio asociado del Centro Alemán para la Investigación de Infecciones (DZIF) Giessen (a SP) y la Fundación Alexander von Humboldt (a MS) proporcionaron apoyo adicional.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por Helmholtz Center for Infection Research GmbH (HZI).

Estos autores contribuyeron igualmente: WAM Elgaher, M. Winterhoff, K. Büssow.

Grupo de Investigación Biomarcadores para Enfermedades Infecciosas, Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones, Braunschweig, Alemania

F. Chen, M. Winterhoff, FH Waqas, N. Sahini, L. Czichon y F. Pessler

Grupo de Investigación de Biomarcadores para Enfermedades Infecciosas, Centro TWINCORE para la Investigación Experimental y Clínica de Infecciones, Hannover, Alemania

F. Chen, M. Winterhoff, FH Waqas, N. Sahini, L. Czichon y F. Pessler

Instituto Helmholtz de Investigación Farmacéutica Saarland – Centro Helmholtz de Investigación de Infecciones, Saarbrücken, Alemania

WAM Elgaher y AKH Hirsch

Departamento de Estructura y Función de Proteínas, Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones, Braunschweig, Alemania

K. Bussow, E. Graner y W. Blankenfeldt

Grupo de Neuroinmunología, Departamento de Investigación del Cáncer, LIH Instituto de Salud de Luxemburgo, Luxemburgo, Luxemburgo

Y. Pires-Afonso & A. Michelucci

Facultad de Ciencias, Tecnología y Medicina, Universidad de Luxemburgo, Esch-Belval, Luxemburgo

Y. Pires-Afonso

División de Medicina Molecular, Universidad de Dundee, Dundee, Reino Unido

L. Casares Perez & L. de la Vega

Instituto Fraunhofer de Toxicología y Medicina Experimental (ITEM), Hannover, Alemania

W. Zobl y S. Schuchardt

Instituto de Química Clínica y Farmacología Clínica, Centro Médico Universitario de Bonn, Bonn, Alemania

T. Zillinger

Instituto de Inmunología, Philipps-University Marburg, Marburg, Alemania

T. Zillinger

Instituto de Virología Médica, Justus-Liebig-University Giessen, Giessen, Alemania

M. Shehata y S. Pleschka

Centro Nacional de Investigación, Giza, Egipto

M. Shehata

Sitio asociado del Centro Alemán para la Investigación de Infecciones Giessen, Giessen, Alemania

S. Pleschka

Unidad central de investigación Metabolómica, Escuela de Medicina de Hannover, Hannover, Alemania

H. Bahre

Departamento de Inmunología de Trasplantes, Facultad de Medicina de Hannover, Hannover, Alemania

C. Falk

Centro de Luxemburgo para Biomedicina de Sistemas, Universidad de Luxemburgo, Esch-Belval, Luxemburgo

a. michelucci

Instituto de Bioquímica, Biotecnología y Bioinformática, Universidad Técnica de Braunschweig, Braunschweig, Alemania

W. Blankenfeldt

Departamento de Farmacia, Universidad de Saarland, Saarbrücken, Alemania

AKH Hirsch

Centro de Medicina Infecciosa Individualizada, Hannover, Alemania

F. Pessler

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FC, MW, WAME, WB, AKHH, KB y FP concibieron y diseñaron el estudio. FC, MW, FW, LCP y LdlV realizaron los experimentos basados ​​en células. EG y KB realizaron los ensayos in vitro. KB identificó la inhibición de ACOD1 por el citraconato. WAME llevó a cabo cálculos de similitud, electrofilia y modelado ligando-objetivo. FC, NS y TZ generaron las células ACOD1-/-. MW, FC, HB, WAME y SS realizaron la espectrometría de masas. YP-A., FC y AM desarrollaron el modelo de ratón LPS. LC realizó el modelo de pulmón humano. MS y SP llevaron a cabo la titulación de virus. CF realizó los ensayos de citoquinas/quimioquinas. FC, MW, WAME, KB y WZ analizaron los datos. FC, MW, WAME, KB y FP escribieron el manuscrito. Todos los autores leen la versión final del manuscrito y están de acuerdo con su publicación.

Correspondencia a F. Pessler.

FP, FC, MW, KB, WB, AKHH y WAME son coinventores de una patente que cubre las aplicaciones médicas del citraconato, incluido el uso inmunomodulador, antioxidante y antiviral. USO DEL CITRACONATO COMO MEDICAMENTO. Titular de la patente: Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones. Inventores: Pessler F, Chen F, Winterhoff M, Büssow K, Blankenfeldt W, Hirsch AKA, Elgaher WM, PCT/EP2022/060682 (22 de abril de 2022).

Nature Metabolism agradece a Luke O'Neill, Ping-Chih Ho, Jan Van den Bossche, Xavier Deup por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Isabella Samuelson, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Las células se incubaron con 25 mM del isómero respectivo durante 6 y 24 horas y luego se midieron las concentraciones de los tres isómeros mediante HPLC-MS/MS en sobrenadantes y extractos de células lavadas. a–f, Concentraciones intracelulares. Las concentraciones absolutas se muestran en a–c, y las fracciones de los otros dos isómeros con respecto al isómero añadido al medio en d–f. Hay un aumento dependiente de la dosis en mesaconato cuando se agrega itaconato al medio (g), pero una disminución en la fracción mesaconato/itaconato con concentraciones crecientes de itaconato (d). Ambas observaciones son consistentes con la conversión intracelular de una pequeña fracción de itaconato a mesaconato por un proceso saturable, presumiblemente enzimático. g–i, las concentraciones de itaconato permanecen estables en los sobrenadantes celulares. Las impurezas conocidas de itaconato en mesaconato y citraconato se detectan nuevamente (consulte también la figura complementaria S1c-g). n=3 réplicas biológicas, medias ±DE.

a–h, la acumulación de mesaconato alcanza su punto máximo después de la acumulación de itaconato en la inflamación inducida por LPS y depende de la síntesis previa de itaconato en las células dTHP1. a–d, las células dTHP1 se estimularon con LPS/IFNγ y las concentraciones intracelulares de los tres isómeros se midieron mediante HPLC-MS/MS en los puntos de tiempo indicados. No se detectó citraconato. No se detectaron ni itaconato ni mesaconato en células ACOD1–/– dTHP1. La concentración máxima de itaconato a las 24 h fue de 460 µmol/L. n=3 réplicas biológicas, medias ±DE. e–h, se provocó inflamación sistémica en ratones C57BL/6N mediante inyección intraperitoneal de LPS, y se midieron las concentraciones de los tres isómeros en homogeneizados de bazo mediante HPLC-MS/MS en los puntos de tiempo indicados. n = 2 ratones por punto de tiempo. i–l, Acumulación de mesaconato en células A549 que sobreexpresan ACOD1. Se expresó ACOD1 humano o murino en células A549 mediante transfección transitoria, y se midieron las concentraciones de los tres isómeros así como los intermedios de TCA seleccionados y el lactato mediante HPLC-MS/MS en los puntos de tiempo indicados. Los valores

Análisis basado en el experimento que se muestra en la Fig. 1, que muestra además el punto de tiempo de 24 h. La concentración de itaconato de 0,125 mM se usó para imitar la contaminación máxima de itaconato que se encuentra en el mesaconato de 25 mM. a–g, Concentraciones de los analitos indicados 6 h después del tratamiento con 5, 10 o 25 mM y 24 h después del tratamiento con 25 mM. h, Proporción de succinato a fumarato, que indica inhibición de SDH. n=3, media ± DE. Prueba T no pareada. i, j, niveles de succinato en células dTHP1 y A549 infectadas con IAV, obtenidos en el mismo experimento que se muestra en Datos extendidos Fig. 5d, e y un experimento independiente. Solo la adición de itaconato eleva los niveles de succinato, y el efecto es más pronunciado en las células dTHP1 que en las A549. n=4 réplicas biológicas, media ± DE. ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Valores de p: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001.

a–c, Estructuras de los aductos de GSH de los isómeros de itaconato. d, Clasificación de los tres isómeros en términos de electrofilia. e–h, Predicción de modelado molecular de la unión no covalente de itaconato y mesaconato al sitio activo de SDH. e, modo de unión 3D de itaconato (amarillo) en comparación con oxaloacetato (magenta) en el sitio de unión de succinato de SDHA humana (PDB ID: 6VAX)2. La unión se logró completamente a través de una red de atracciones electrostáticas, es decir, enlaces de hidrógeno y puentes salinos (líneas discontinuas) entre los grupos carboxilo C1 y C4 y los residuos del sitio activo (Thr308, Arg340, His407 y Arg451). Superficie de proteína electrostática en el sitio activo: positivo (azul), negativo (rojo), neutro (blanco). Dinucleótido de flavina y adenina (FAD, verde). f, interacciones de ligando 2D de itaconato. g, modo de unión potencial de mesaconato (amarillo) en comparación con oxaloacetato (magenta). Al igual que el itaconato, los grupos carboxilo C1 y C4 del mesaconato son los restos exclusivos responsables de unirse a través de enlaces de hidrógeno e interacciones iónicas (líneas discontinuas). Sin embargo, su estructura rígida y plana solo podía establecer contactos parciales en comparación con el itaconato. h, interacciones de ligando 2D de citraconato. i, Comparación de la inhibición de SDH por itaconato, mesaconato y citraconato (ensayo in vitro utilizando mitocondrias bovinas). La actividad SDH se midió en presencia de concentraciones crecientes de itaconato, mesaconato, citraconato y el inhibidor de control malonato (n=3 ensayos independientes, media ± SD). De los isómeros, el itaconato fue el inhibidor más fuerte de SDH, esencialmente no hubo inhibición por parte del citraconato.

Las células dTHP1 y A549 se dejaron sin tratar o se incubaron con itaconato, mesaconato o citraconato (20 mM) o itaconato de 4-octilo (4-OI, 125 µM), se infectaron con IAV PR8M (MOI = 1) y luego se incubaron con medio fresco que contenía los tratamientos La replicación se midió en células dTHP1 12 h pi mediante la expresión de ARNm de HA (RT-qPCR) y en células A549 24 h pi midiendo el ARNm de HA (RT-qPCR) y los títulos virales (ensayo de formación de focos). a, ARNm de HA (células dTHP1). b, ARNm de HA (células A549). c, títulos de IAV (células A549). n=4 repeticiones biológicas, media ± DE. ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Valores de p: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001. Efectos únicos y compartidos de los isómeros de itaconato sobre el metabolismo de los aminoácidos en células dTHP1 y A549 infectadas con IAV. dg, la misma configuración experimental que ac, excepto que se usó 4-OI (125 µM) como tratamiento adicional. Las concentraciones de 20 aminoácidos, 30 metabolitos de aminoácidos y 9 aminas biogénicas se midieron mediante HPLC-MS/MS (kit MxP Quant 500, Biocrates) después de 12 h para dTHP1, 24 h para A549 (n = 4 por grupo). Los datos adicionales, incluidas las concentraciones de analitos individuales y los valores de los indicadores de metabolitos, se muestran en las figuras complementarias S3 y S4. d, e, PCA basados ​​en los analitos relacionados con 59 aminoácidos. d, En las células dTHP1, la infección produce solo cambios modestos, mientras que los tres isómeros ejercen efectos similares pero claramente perceptibles, que difieren profundamente del impacto de 4-OI. e, En las células A549, la infección ejerce un impacto mucho más fuerte en el metabolismo de los aminoácidos. f, diagramas de Venn que muestran analitos que son diferencialmente abundantes (prueba T no pareada, FC>1.3, FDR ≤0.05) en células infectadas y no infectadas con A549 y dTHP1. g, Diagramas de Venn para los indicadores de metabolitos (66 sumas y proporciones de analitos funcionalmente relacionados, calculados con el software Biocrates MetaboIndicatorTM). Datos de origen La Tabla 1 contiene los datos de origen correspondientes a dg.

a,b, Expresión de 14 genes potencialmente inducibles por NRF2 en células WT y NRF2–/– HaCaT 17,5 h después de la administración de isómeros de itaconato (20 mM). La mayor diferencia entre la expresión en células WT y KO se observa tras la administración de citraconato. c–e, Inducción de ARNm de SLC7A11, GCLM y ME1 en células dTHP1 infectadas con IAV mediante citraconato pero no mesaconato. Las células se pretrataron con isómeros de itaconato (20 mM) durante 12 h, se incubaron con medio que contenía virus durante 2 h (MOI = 1) y luego se incubaron con medio fresco que contenía isómeros de itaconato durante 10 h más. f–q, Efectos inmunomoduladores de los isómeros de itaconato. Experimento de infección por IAV idéntico a c-e. f–h, Expresión de los ARNm indicados en células (RT-qPCR). i–q, Concentraciones de las citocinas/quimiocinas indicadas en sobrenadantes de cultivo (ensayo de microesferas multiplex). La tabla de datos de origen S2 contiene los datos sin procesar relacionados con i–q. aq, n=3 réplicas biológicas, medias ± SD. Valores de p: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett.

a,b, ensayo sin células. Se incubó mACOD1 recombinante con concentraciones crecientes de sustrato (cis-aconitato) e inhibidor (citraconato) y se midió la acumulación de itaconato por HPLC. n=3 ensayos independientes, medias ±DE. Datos cinéticos pertenecientes a los valores enumerados en la Fig. 3c. La línea representa un ajuste de curva a la ecuación de Michaelis-Menten con un inhibidor competitivo. b, diagrama de Lineweaver-Burk de los datos que se muestran en a. c, Similitud con cis-aconitato (coeficiente de Tanimoto) y energías de enlace de los isómeros de itaconato con ACOD1 humano y murino. d, Modo de unión putativo de citraconato (amarillo) en el sitio activo de ACOD1 de ratón (ID PDB: 6R6T)1. Los grupos carboxilo C1 y C4 del citraconato se unen electrostáticamente a través de enlaces de hidrógeno y contactos iónicos (líneas discontinuas) a los residuos del sitio activo (His103, His159, Lys207, Lys272 y Leu278). Superficie de proteína electrostática en el sitio activo: positivo (azul), negativo (rojo), neutro (blanco). e, interacciones de ligando 2D de citraconato. f, Superposición de modos de unión putativos de citraconato (amarillo), itaconato (cian) y mesaconato (verde) en comparación con el sustrato cis-aconitato (magenta) en el sitio activo de ACOD1 humano (PDB ID: 6R6U)1. Solo el citraconato puede adoptar el mismo modo de unión que el cis-aconitato, donde los grupos carboxilo orientados en cis están completamente involucrados en las interacciones con los residuos del sitio activo (His159, Lys207, Lys272 y Leu278). Por el contrario, los grupos carboxilo de itaconato y mesaconato interactúan parcialmente dando como resultado una menor afinidad de unión.

La estimulación con LPS/IFNγ y el tratamiento con citraconato o itaconato (1 mM o 25 mM) se realizaron como en la Fig. 4m-o. La respiración mitocondrial se midió mediante el ensayo Seahorse en células dTHP1 no estimuladas o después de 12 h de estimulación. ac, Gráficos de barras que muestran la tasa de consumo de oxígeno (OCR) debido a la respiración basal, la respiración máxima (ayb) y la capacidad respiratoria adicional (c). El itaconato 25 mM redujo significativamente la respiración máxima y la capacidad respiratoria adicional en células dTHP1 inducidas por LPS/IFNγ, mientras que hubo una tendencia (p = 0,076 y 0,096 respectivamente) de citraconato 1 mM para prevenir esta disminución, y hubo una tendencia de 25 mM itaconato para normalizar la capacidad respiratoria sobrante (p=0,082). En una (replicas biológicas) fueron las siguientes: sin tratar = 5; Citra 1 mM = 4; Citra 25 mM = 3; Ita 1 mM = 4; Ita 25 mM = 4. En bn fueron como sigue: sin tratar = 5; Citra 1 mM = 5; Citra 25 mM = 3; Ita 1 mM = 4; 25 mM Ita = 4. Los resultados en c se calculan a partir del experimento que se muestra en ayb y, por lo tanto, tienen el mismo n que los tratamientos respectivos en ayb. Medias ±DE; ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Valores de p: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001. dh, curvas de salida OCR que forman la base de los gráficos mostrados en ac. d, células no estimuladas frente a células estimuladas con LPS/IFNγ. e, tratamiento con citraconato, células no estimuladas. f, tratamiento con citraconato, células estimuladas con LPS/IFNγ. g, tratamiento con itaconato, células no estimuladas. h, tratamiento con itaconato, células estimuladas con LPS/IFNγ. Los resultados en dh se calculan a partir del experimento que se muestra en ayb y, por lo tanto, tienen el mismo n que los tratamientos respectivos en ayb. Media ± DE. Valores de p: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Abreviaturas: FCCP = cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Oligo = oligomicina; Rot = rotenona; AA = Antimicina A.

Figs suplementarias. 1 a 6 y las tablas 1 y 2.

Los datos de origen del análisis de aminoácidos por LC-MS/MS pertenecientes a la Fig. 5 de datos ampliados y las Figs complementarias. 3 y 4.

Datos de origen del análisis multiplex de citocinas/quimiocinas de microesferas pertenecientes a la Fig. 2 y Datos ampliados de la Fig. 6.

Transferencias de datos de origen para la figura complementaria 6b.

Imágenes de membrana sin recortar de inmunotransferencias, Fig. 2a, j y k.

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Recibido: 20 mayo 2021

Aceptado: 20 de abril de 2022

Publicado: 02 junio 2022

Fecha de emisión: mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00577-x

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