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Oct 18, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 294 (2023) Citar este artículo

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La conjugación es un mecanismo dependiente del contacto para la transferencia de ADN plasmídico entre células bacterianas, lo que contribuye a la diseminación de la resistencia a los antibióticos. Aquí, usamos microscopía de células vivas para visualizar la dinámica intracelular de la transferencia conjugativa del plásmido F en E. coli, en tiempo real. Mostramos que la transferencia de plásmido en forma monocatenaria (ssDNA) y su posterior conversión en ADN bicatenario (dsDNA) son procesos rápidos y eficientes que ocurren con una sincronización y localización subcelular específicas. En particular, la conversión de ssDNA a dsDNA determina el momento de la producción de proteínas codificadas por plásmidos. La región líder que ingresa primero a la célula receptora lleva promotores monocatenarios que permiten la síntesis temprana y transitoria de proteínas líderes inmediatamente después de la entrada del plásmido ssDNA. La conversión posterior en dsDNA desactiva la expresión del gen principal y activa la expresión de otros genes plasmídicos bajo el control de promotores de doble cadena convencionales. Esta estrategia molecular permite la producción oportuna de factores involucrados secuencialmente en el establecimiento, mantenimiento y diseminación del plásmido.

La conjugación de ADN bacteriano es un mecanismo de transferencia de genes horizontal generalizado en el que la información genética se transmite de una célula donante a una receptora por contacto directo1,2,3,4. La conjugación es responsable de la diseminación dentro y entre especies de diversas propiedades metabólicas y representa el 80 % de las resistencias adquiridas en bacterias5. El plásmido F fue el primer elemento conjugativo descubierto1,6 y ahora está documentado como el representante paradigmático de un gran grupo de plásmidos conjugativos muy extendidos en Escherichia coli y otras especies de Enterobacteriaceae, en las que están asociados a la diseminación de colicinas, factores de virulencia y antibióticos. resistencia7,8,9. Debido a su importancia clínica y fundamental, los plásmidos tipo F han sido objeto de extensos estudios que permitieron comprender en detalle las reacciones moleculares y los factores involucrados en su transferencia por conjugación3,4.

Dentro de la célula donante, los componentes del relaxosoma, incluido el factor de integración del huésped IHF, las proteínas accesorias codificadas por plásmidos TraY, TraM y la relaxasa multifuncional TraI, se reclutan en el origen de transferencia (oriT) del plásmido F10,11,12. Luego, el complejo de relaxosoma es reclutado para el sistema de secreción de tipo IV (T4SS) por la proteína de acoplamiento TraD, lo que da como resultado la formación del complejo de preiniciación13,14,15,16,17. Las proteínas TraI y TraD son componentes arquetípicos del conjunto central de subunidades requeridas para el establecimiento de la maquinaria de conjugación activa y se denominan respectivamente VirD2 y VirD4 en la nomenclatura común. Se propone que el establecimiento de la pareja de apareamiento induce una señal aún no caracterizada que activa el complejo de preiniciación. Luego, TraI introduce un corte (muesca) de ADN específico de sitio y hebra en el oriT del plásmido y permanece unido covalentemente al extremo 5' de fosfato. TraI también sirve como una helicasa que extruye el plásmido ssDNA para ser transferido, llamado T-strand18,19,20,21,22,23,24,25,26. Inicialmente se sugirió y luego se confirmó que se requieren dos relaxasas para llevar a cabo estas funciones27,28. En esta etapa, el 3'OH de la cadena T sirve para iniciar la replicación en círculo rodante (RCR) que convierte el plásmido de ssDNA circular intacto en dsDNA en la célula donante3,29,30, mientras que el 5'fosfato se une a TraI se transfiere a la célula receptora a través de la maquinaria T4SS. Si bien la estructura molecular del T4SS ha sido bien caracterizada31,32,33,34, la forma en que el complejo T (nucleoproteína T-strand-TraI) se transloca a través de la membrana de las células del donante y del receptor sigue sin estar clara.

El primer segmento transferido es la región líder de ~13,5 knt, que lleva genes que codifican la proteína SsbF homóloga a la proteína Ssb de unión de cadena única esencial codificada cromosómicamente, la proteína PsiB (inhibición de plásmido SOS)35,36,37,38 que inhibe Inducción de SOS durante la conjugación39,40 y otras proteínas de función desconocida. Sorprendentemente, la región líder se conserva en varios plásmidos enterobacterianos que pertenecen a una variedad de grupos de incompatibilidad41,42,43,44,45,46. La región de mantenimiento de ~17 knt adyacente y próximamente transferida lleva el sistema de partición de plásmido similar a ParABS (SopABC) y los orígenes de la replicación vegetativa47,48,49,50. El último segmento transferido del plásmido F es la gran región de ~33,3 knt tra que codifica todos los factores proteicos necesarios para el procesamiento y la transferencia del ADN del plásmido, incluido el relaxosoma, el T4SS y el sistema de exclusión contra la autotransferencia4. Además, los plásmidos tipo F a menudo llevan genes de carga involucrados en varias funciones metabólicas comúnmente integradas entre las regiones de mantenimiento y tra7,9. Una vez que los extremos 5' y 3' de la cadena T se han internalizado en la célula receptora, ahora denominada transconjugante, el plásmido ssDNA se circulariza mediante TraI26,27,51,52. El plásmido ssDNA también se convertirá en dsDNA mediante la reacción de síntesis de cadena complementaria. No está claro si esta reacción de síntesis de ADN ocurre cuando el plásmido ingresa a la célula receptora o si se inicia después de la recircularización del plásmido. No obstante, se requiere completar la conversión de ss a dsDNA para la replicación y partición del plásmido y, por lo tanto, es fundamental para la estabilidad del plásmido en el nuevo linaje de células huésped.

El modelo mecanicista descrito anteriormente está bien documentado; sin embargo, la dinámica en tiempo real y la organización intracelular de la conjugación permanecen en gran parte sin describir en la bacteria viva. En particular, sabemos muy poco sobre la localización subcelular y el momento de las reacciones en la célula receptora, incluida la entrada del plásmido ssDNA, la conversión de ss a dsDNA y la expresión génica del plásmido. Con respecto a lo último mencionado, trabajos anteriores reportaron que algunos genes líderes (ssbF y psiB en el plásmido F, y ssbColIb-P9, psiB y ardA en el plásmido ColIb-P9) se expresan rápidamente después de la entrada del plásmido en la célula aceptora36,37, 38,42,53,54. El trabajo in vitro de Masai et al.55 mostró que la forma monocatenaria de la secuencia no codificante de Frpo, ubicada en la región principal del plásmido F, se pliega en una estructura de bucle de tallo que reconstituye las cajas canónicas −10 y −35. Esta secuencia promotora puede reclutar la ARN polimerasa de E. coli que inicia la síntesis de ARN en ensayos in vitro55. También se encontraron secuencias homólogas a Frpo en la región líder de ColIb-P956,57. Estas observaciones llevaron a la propuesta de que las secuencias similares a Frpo podrían actuar como promotores de ssDNA iniciando la transcripción temprana de genes principales cuando el plásmido todavía está en forma de ssDNA. Queda por demostrar si este mecanismo de regulación ocurre durante la conjugación in vivo.

En este estudio, utilizamos imágenes de microscopía de células vivas para visualizar la secuencia de transferencia completa del plásmido F nativo entre las cepas de E. coli K12. Inspeccionamos los pasos clave de la conjugación utilizando indicadores genéticos desarrollados específicamente, incluida una fusión fluorescente de la proteína de unión de cadena única codificada cromosómicamente Ssb (Ssb-Ypet) para monitorear la transferencia de ssDNA, el sistema mCherry-ParB/parS para revelar el ss -a-dsDNA conversión y subsiguiente duplicación de plásmido, y fusiones fluorescentes traslacionales para cuantificar y cronometrar la producción codificada por plásmido en la nueva célula huésped58,59. Este enfoque descubre la coreografía de las reacciones de conjugación en bacterias vivas y proporciona nuevos conocimientos sobre la interacción entre el procesamiento de plásmidos y la expresión génica.

Supervisamos la localización dinámica de una fusión endógena fluorescente de la proteína de unión monocatenaria Ssb (Ssb-Ypet) codificada cromosómicamente en células donantes y receptoras, durante el crecimiento vegetativo y la conjugación (Fig. 1a, b y Fig. S1). Durante el crecimiento vegetativo, Ssb-Ypet forma focos discretos en las posiciones de la mitad y el cuarto dentro de la región interna de las células donantes y receptoras (Fig. 1c y Fig. S2a, b). Estos focos Ssb, denominados focos replicativos Ssb en lo sucesivo, están asociados con el ssDNA que sigue a las horquillas de replicación en el nucleoide DNA60,61. Durante la conjugación, la localización intracelular de Ssb cambia drásticamente. Como se informó anteriormente58,59, la entrada del plásmido ssDNA en la célula receptora, ahora llamada transconjugante, desencadena el reclutamiento de moléculas de Ssb y la formación de focos brillantes proximales a la membrana, denominados focos conjugativos de Ssb (Fig. 1b y Fig. S1). Aquí, también observamos la formación de focos conjugativos de Ssb en las células donantes, lo que revela la presencia de plásmido ssDNA en cada lado del poro de conjugación durante la transferencia (Fig. 1b y Fig. S1). El análisis de localización de focos revela que la salida y la entrada del plásmido se producen en posiciones específicas de la membrana dentro de las células del par de apareamiento. Los focos conjugativos de ssb se distribuyen en la periferia de la célula donante y preferentemente en las posiciones cuartas (Fig. 1c y Fig. S2a, b), lo que refleja la posición preferida para la salida del plásmido ssDNA a través de los poros de conjugación activos. Por el contrario, la entrada del plásmido ssDNA ocurre predominantemente dentro de las regiones polares de las células transconjugantes (Fig. 1c y Fig. S2a, b). Nuestros datos también nos permiten abordar si la conjugación ocurre en una etapa específica del ciclo celular. El análisis de la longitud de la célula como un indicador de la edad de la célula revela que las células del donante y del receptor que participan en la transferencia de plásmidos exhiben una distribución de longitud similar que durante el crecimiento vegetativo (Fig. 1d). Esto demuestra que los donantes pueden dar y los receptores pueden adquirir el plásmido en cualquier etapa de su ciclo celular, desde el nacimiento hasta la división celular.

a Imágenes de microscopía representativas de donantes y receptores que portan el gen de fusión ssb-ypet durante el crecimiento vegetativo. Los receptores también producen la proteína fluorescente difusa mCh-ParB. Barras de escala de 1 μm. b Imágenes de microscopía de lapso de tiempo de transferencia de plásmido entre un donante (D) y un receptor (R) que se convierte en una célula transconjugante (T). Barras de escala de 1 μm. Los eventos adicionales se presentan en la Figura S1. c Mapas de calor de localización 2D de Ssb-Ypet en donantes, receptores y transconjugantes durante el crecimiento vegetativo (veg.) y la conjugación (conj.). Normalización por la longitud celular de (n) células individuales de al menos tres réplicas biológicas. La barra de escala de densidad está a la izquierda. d Histograma de distribución de longitud celular de donantes, receptores y transconjugantes (n células analizadas de al menos tres experimentos independientes). e Tiempo de aparición del foco conjugativo de Ssb en el donante en relación con las células transconjugantes. Los histogramas con medias y SD representan la proporción de eventos de transferencia en los que el foco Ssb aparece en los donantes antes (−1 min), simultáneamente (0 min) o después (+1 min; +2 min) aparece en transconjugantes. Se indica el número (n) de eventos de transferencia individuales analizados a partir de tres experimentos independientes. f Gráfico de fluctuación de la intensidad de fluorescencia de los focos conjugativos de Ssb-Ypet tras la aparición simultánea. El número de focos analizados a partir de tres experimentos independientes (n) se indica con la Media y SEM correspondientes. La significación del valor de p de la prueba estadística bilateral de Mann-Whitney se indica mediante **** (P ≤ 0,0001). g Gráficos de fluctuación de la vida útil de los focos conjugativos Ssb-Ypet en células donantes y transconjugantes. La importancia del valor de p de la prueba estadística bilateral de Mann-Whitney se indica mediante **** (p = 0,0001). Se indica el número (n) de células analizadas de al menos cinco experimentos independientes. h Gráficos de violín de la asimetría de fluorescencia de un mCherry libre y del Ssb-Ypet en donantes, receptores y células transconjugantes. La mediana, el cuartil 1 y el cuartil 3 están indicados por los límites de las cajas, la media por un punto negro y los mínimos y máximos por los límites de los bigotes. Los puntos negros encima y debajo de los valores máximo y mínimo corresponden a valores atípicos. Los datos gratuitos de mCherry corresponden a un experimento representativo. Otras parcelas corresponden al mismo conjunto de datos que en el panel (c) de al menos tres réplicas biológicas. Se indica el número de células analizadas (n). i Gráfica de fluctuación de la intensidad de los focos replicativos y conjugativos de Ssb-Ypet en células transconjugantes durante la conjugación. El tiempo 0 min corresponde a la aparición del foco conjugativo Ssb-Ypet en los receptores. El número de células analizadas (n) de tres experimentos independientes se indica con la Media y SEM correspondientes. Donante (LY1007), receptor (LY358), transconjugante (LY358 después de la adquisición de Fwt de LY1007); el mCherry libre se produce a partir del cromosoma en MS388 wt background (LY1737). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En el 77,8 ± 7 % (n = 131) de los eventos de transferencia de plásmidos individuales visualizados mediante imágenes de lapso de tiempo (1 min/fotograma), aparecen focos conjugativos de Ssb en las células donantes y transconjugantes en el mismo fotograma (Fig. 1e). En estos casos, los focos conjugativos de Ssb son, en promedio, más brillantes en las células transconjugantes que en las células donantes, lo que refleja la cantidad relativa de plásmido ssDNA en cada lado del poro de conjugación (Fig. 1f). En el 22,2% restante de los eventos de transferencia, los focos conjugativos de Ssb aparecen primero en el transconjugante y luego en el donante uno o dos minutos más tarde (Fig. 1e). La acumulación tardía de ssDNA en el donante en relación con el receptor se corrobora mediante la cuantificación de una vida media de 2,9 ± 1,1 min (n = 294) de focos conjugativos de Ssb-Ypet en los transconjugantes, en comparación con 2,5 ± 1,1 min (n = 197 ) en las células del donante (Fig. 1g). Estos datos indican que la aparición de focos conjugativos es asíncrona en las células de pareja de apareamiento y sugieren una secuencia específica de transferencia de ssDNA. El primer segmento de la hebra T generado por la actividad helicasa de TraI en la célula donante no permanece el tiempo suficiente para reclutar moléculas de Ssb y se transfiere inmediatamente al receptor. Solo después de esta breve etapa de transferencia, el ssDNA también se acumula en el lado del donante, donde puede corresponder a la cadena de plásmido no transferida oa la cadena T o a ambas. Esto implica que la tasa de formación de ssDNA por actividad de helicasa TraI es más rápida que la eliminación de ssDNA por RCR y la transferencia a través de T4SS (ver discusión).

La internalización de una gran cantidad de plásmido ssDNA provoca el reclutamiento masivo de la reserva intracelular de moléculas Ssb en la periferia de las células donantes y transconjugantes. Este cambio en la distribución subcelular de Ssb-Ypet se revela mediante el análisis de sesgo, que proporciona una medida no sesgada de la asimetría de la distribución de fluorescencia dentro de las células sin un requisito para la detección de focos basada en el umbral (Fig. 1h). Las células de tipo salvaje que producen un mCherry libre (mCh) exhiben una baja asimetría correspondiente a la distribución homogénea de fluorescencia de píxeles dentro del citoplasma de la célula. Durante el crecimiento vegetativo, la fluorescencia de Ssb-Ypet es parcialmente difusa en el citoplasma y parcialmente concentrada localmente dentro de los focos de replicación, lo que da como resultado una asimetría de ~1,2. En comparación, Ssb-Ypet exhibe una fuerte asimetría de ~ 4.1 en donantes y transconjugantes durante la transferencia de plásmidos, lo que refleja la mayor proporción de moléculas de Ssb agrupadas dentro de los focos. Por lo tanto, nos preguntamos qué parte de las moléculas de Ssb están contenidas dentro de los focos conjugativos y si su formación estaba asociada con un agotamiento de Ssb dentro de los focos replicativos en la célula transconjugante. Para abordar esta pregunta, realizamos la detección automática de focos Ssb-Ypet y la cuantificación del brillo durante la transferencia del plásmido (Fig. 1i). Observamos que un minuto después del comienzo de la entrada del plásmido, los focos replicativos Ssb-Ypet todavía están presentes pero muestran la mitad de su intensidad inicial, mientras que los focos conjugativos son 35 veces más brillantes. Dado que la fluorescencia intracelular total de Ssb-Ypet no cambia durante la transferencia (Fig. S2c), estas variaciones pueden atribuirse al desplazamiento de las moléculas de Ssb-Ypet en el plásmido ssDNA entrante en lugar de la síntesis de novo de Ssb-Ypet. Esta dinámica refleja que el plásmido ssDNA entrante recluta la mayoría de las moléculas Ssb-Ypet en la célula aceptora durante la transferencia.

Se ha estimado que Ssb está presente en alrededor de ~1320 ± 420 monómeros por célula de E. coli y que un dímero de tetrámeros cubre alrededor de 170 nt in vivo61. En consecuencia, no hay suficientes copias de Ssb por célula para acomodar los 108 000 nucleótidos del plásmido F de ssDNA, más los pocos cientos de nucleótidos de ssDNA asociados con las horquillas de replicación (~650 nt a 22 °C62). De hecho, no se sabe si el plásmido F está alguna vez completamente presente en forma de ssDNA en el receptor, ya que no se sabe si la reacción de síntesis de la cadena complementaria ocurre simultáneamente con o después de completarse la transferencia de la cadena T. Aún así, el reclutamiento masivo observado de moléculas de Ssb en el ssDNA entrante podría reducir la disponibilidad de Ssb y provocar una alteración transitoria de la replicación del ADN del cromosoma huésped. Una forma de abordar esta pregunta in vivo es monitorear una fusión fluorescente del componente replisoma β2-clamp (mCh-DnaN), que se difunde en el citoplasma de las células que no se replican y forma focos discretos asociados al replisoma durante la progresión de la replicación del ADN60, 61,63. Las imágenes de microscopía y el análisis de asimetría no mostraron cambios en el patrón de localización de DnaN antes, durante o después de la formación de focos conjugativos de Ssb (Fig. S2d). Esto indica que el reclutamiento de Ssb en el plásmido ssDNA entrante no da como resultado el colapso de la horquilla de replicación. Sigue siendo una posibilidad si la tasa de replicación del ADN se ve afectada durante este proceso breve y transitorio.

La conversión del plásmido ssDNA recién adquirido en dsDNA mediante la reacción de síntesis de cadena complementaria y los eventos de duplicación del plásmido posteriores se analizaron utilizando el sistema de marcaje de ADN parS/ParB58,59. El sitio de unión de parS se inserta en el plásmido F, mientras que la proteína de unión de ParB marcada con fluorescencia con mCherry (mCh-ParB) se produce a partir de un plásmido solo en las células receptoras. Bajo el microscopio, la conversión de ss a dsDNA se informa por la desaparición del foco conjugativo Ssb-Ypet y la formación de un foco mCh-ParB en las células transconjugantes (Fig. 2a). Primero realizamos imágenes de lapso de tiempo (1 min / fotograma) para visualizar la tasa de éxito y el tiempo de conversión de ss a dsDNA después de la entrada de ssDNA (Fig. 2b). El análisis muestra que la aparición del foco conjugativo Ssb-Ypet va seguida de la formación del foco mCh-ParB en el 83,3 ± 2,3 % (n = 311) de las células transconjugantes individuales analizadas, lo que indica que la gran mayoría de los plásmidos ssDNA internalizados se convierten con éxito en plásmidos de dsDNA (Fig. 2c). En particular, observamos que el 40 ± 3, 2% (n = 286) de las células transconjugantes donde el plásmido ssDNA recién adquirido ya se ha convertido en dsDNA recibe posteriormente ssDNA adicional (Fig. 2d y Fig. S3a). Cuantificamos que el 92 ± 3,1% de estos múltiples eventos de adquisición de ssDNA se originan en el mismo donante, entre los cuales el 79 ± 5,3% parece tener lugar en la misma posición de la membrana, lo que sugiere que ocurren a través del mismo poro de conjugación (Fig. S3a). La evidencia de múltiples transferencias dentro de una pareja de apareamiento establecida demuestra que un solo donante puede dar sucesivamente varias copias de la cadena T y que los transconjugantes en los que ya se ha logrado la conversión de ss a dsDNA no se vuelven instantáneamente refractarios al plásmido de novo. adquisición. En consecuencia, se espera que el establecimiento de la inmunidad a la conjugación por células transconjugantes requiera la producción de las proteínas de exclusión TraS y TraT codificadas por plásmidos.

a Imágenes de lapso de tiempo que muestran la transferencia del plásmido ssDNA informada por la formación de los focos conjugativos Ssb-Ypet en las células del donante (D) y del receptor (R), seguido de la conversión de ss a dsDNA reflejada por la aparición de un mCh- Foco ParB en células transconjugantes (T). Barra de escala 1 μm. b Cuantificación de lapso de tiempo de una sola célula de la apariencia del foco Ssb-Ypet (línea azul) y la primera duplicación del foco mCh-ParB (línea roja) con respecto a la conversión de ss a dsDNA revelada por la formación del foco mCh-ParB en células transconjugantes ( 0 minutos). La apariencia del foco de Ssb-Ypet se analizó con lapsos de tiempo de 1 min/fotograma, mientras que la primera y la segunda duplicación de mCh-ParB se analizaron con lapsos de tiempo de 5 min/fotograma. Se indica la media y la SD calculadas a partir del número indicado de eventos de conjugación analizados (n) de siete experimentos independientes. c Histograma de conversión exitosa de ss a dsDNA reflejada por la conversión de los focos conjugativos Ssb-Ypet en un foco mCh-ParB. La media y la SD se calculan a partir de (n) eventos de transferencia individuales de seis réplicas biológicas (puntos negros). d Histograma que muestra el porcentaje de transconjugantes con un foco mCh-ParB que adquiere múltiples plásmidos ssDNA según lo revelado por la aparición sucesiva del foco conjugativo Ssb-Ypet. La media y la SD se calculan a partir de (n) células transconjugantes individuales de seis réplicas biológicas (puntos negros). e Gráfico de dispersión que muestra el tiempo de retraso entre la aparición de los focos Ssb-Ypet y mCh-ParB en transconjugantes. Se indican la media y la SD calculadas a partir de (n) eventos individuales (círculos azules) de siete réplicas biológicas. f Diagrama de dispersión que muestra el tiempo transcurrido entre la aparición del foco mCh-ParB y su duplicación visual en dos focos (primera duplicación) y en tres o cuatro focos (segunda duplicación). Se indican la media y la SD calculadas a partir de (n) eventos de duplicación individuales (círculos rojos) de al menos seis réplicas biológicas. g Cuantificación de lapso de tiempo de una sola célula del número de focos F por célula en la cepa donante portadora de F durante el crecimiento vegetativo y en transconjugantes después de la adquisición del plásmido F. Para los donantes, se muestra el número de focos F por célula (número de focos SopB-sfGFP) con respecto al nacimiento celular (t = 0 min) (curva gris). Para transconjugantes, se muestra el número de focos F por célula (número de focos mCh-ParB) con respecto a la apariencia del foco mCh-ParB (t = 0 min) (curva negra). Se indican la media y la SD calculadas a partir de (n) células individuales de cuatro réplicas biológicas, junto con las líneas de ajuste lineal de las curvas (verde y rojo). Cepa donante portadora de F (LY834), transconjugante (LY358 después de la adquisición de Fwt). h Mapas de calor de localización 2D de focos mCh-ParB en el momento de su aparición (arriba) y justo antes de su duplicación (abajo). Los mapas de calor son la normalización por la longitud celular de (n) células transconjugantes individuales de siete réplicas biológicas. a–f, h Fwt donante (LY1007), receptor (LY358) y transconjugante (LY358 después de la adquisición de Fwt). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Teniendo en cuenta solo los eventos exitosos de ss-to-dsDNA, calculamos un retraso de tiempo promedio de 4 ± 1,6 min (n = 475) entre la aparición del foco conjugativo Ssb-Ypet y la formación del foco mCh-ParB (Fig. 2e). Este período refleja el tiempo necesario para completar una cascada de reacciones que comprende la internalización del plásmido ssDNA, el inicio de la replicación de la síntesis de la cadena complementaria y el reclutamiento de moléculas ParB en el sitio parS en forma de dsDNA. Aunque nuestro sistema no permite evaluar la contribución de cada paso, los resultados muestran que la secuencia completa de reacciones se logra en un período relativamente corto y constante.

A continuación, primero realizamos imágenes de lapso de tiempo (5 min/fotograma) para examinar el momento de la duplicación del plásmido en las células transconjugantes (es decir, la replicación y la separación visual de las copias del plásmido) (Fig. 2b). Estimamos un período promedio de 10,4 ± 4,7 min (n = 158) entre la conversión de ssDNA a dsDNA y el primer evento de duplicación del plásmido (de uno a dos focos mCh-ParB) y similar 10,1 ± 5,1 min (n = 124) entre el primer y el segundo evento de duplicación (de dos a tres o cuatro focos mCh-ParB) (Fig. 2f). Luego decidimos comparar la tasa de duplicación de plásmidos en transconjugantes con la tasa de duplicación de plásmidos en una cepa donante portadora de F en crecimiento vegetativo. Para hacerlo, trazamos el número de focos de plásmido por célula desde la conversión de ss a dsDNA (apariencia de foco mCh) hasta la división celular en transconjugantes y desde el nacimiento celular hasta la división celular en células donantes portadoras de F (Fig. 2g). Los resultados muestran que el número de F por célula aumenta significativamente más rápido en las células transconjugantes que en las células portadoras de F en crecimiento vegetativo (aumento del 75 % de la pendiente de la curva de ajuste), pero para alcanzar un número final similar de ~4 ± 1 copias por célula antes división (Fig. 2g). Se sabe que el número de copias F, como la replicación cromosómica, está controlado por la progresión del ciclo celular, donde la iniciación ocurre cuando se logra una masa constante por origen64. Por lo tanto, nuestras observaciones son consistentes con la interpretación de que cuando una sola copia de plásmido llega a una célula receptora que puede estar en cualquier etapa del ciclo celular, el inicio de la replicación del plásmido no se reprime hasta que se restablece el número específico de copias de plásmido por masa celular. Esta replicación acelerada del plásmido permite el rápido aumento del número de copias de F antes de la división de las células transconjugantes, lo que facilita la segregación de las copias del plásmido en las células hijas.

El análisis de localización revela que la conversión de ss a dsDNA y el primer evento de duplicación ocurren en distintas posiciones subcelulares. El foco inicial de mCh-ParB aparece preferentemente en la región polar de la célula transconjugante, comparable a la ubicación de entrada del ssDNA (compare la Fig. 2h con la Fig. 1c y la Fig. S3b con la Fig. S2a). Una diferencia notable es que los focos mCh-ParB parecen menos periféricos, lo que indica que no están tan cerca de la membrana celular como los focos de conjugación Ssb-Ypet (compare la Fig. 2h con la Fig. 1c y la Fig. S3c con la Fig. S2b). Observamos que el foco mCh-ParB migra posteriormente a la posición de la celda media antes de la duplicación (Fig. 2h y Fig. S3b, c). Estos datos muestran que las dos reacciones de síntesis de ADN implicadas en el procesamiento del plásmido (es decir, la conversión de ss a dsDNA y la replicación del plásmido) están separadas en el tiempo y el espacio en la nueva célula huésped. El reclutamiento de la maquinaria de síntesis de la hebra complementaria y la reacción de replicación de ss a dsDNA ocurre en la vecindad de la posición polar de entrada del plásmido ssDNA, mientras que la replicación del plásmido ocurre en la región media de la célula. En conjunto, estos análisis revelan que los pasos de procesamiento de plásmidos (entrada de ssDNA, conversión de ss a dsDNA y replicación de plásmidos) ocurren en posiciones intracelulares específicas dentro de la nueva célula huésped y siguen una cronología precisa.

Construimos fusiones traslacionales de supercarpetas gfp (sfgfp) en el extremo 3 'de varios genes ubicados en las diferentes regiones funcionales del plásmido F para examinar el tiempo de producción de proteínas codificadas por plásmidos en células transconjugantes, que usamos para obtener información sobre el tiempo. de la expresión génica del plásmido (Fig. 3a y Fig. S4a). Los genes ygfA, ygeA, psiB, yfjB, yfjA y ssbF están ubicados en la región líder y se transfieren en orden después del origen de la transferencia oriT. El gen sopB es parte del sistema de partición SopABC y está ubicado en la región de mantenimiento. Los genes traM, traC, traS y traT se encuentran en la región tra que codifica factores implicados en la transferencia de plásmidos. TraM es la proteína accesoria del complejo relaxosoma que se recluta para el oriT65; TraC es la ATPasa de tráfico organizada como un hexámero de dímeros acoplados a las caras citoplasmáticas del T4SS66; TraS y TraT corresponden al sistema de exclusión (inmunidad) del plásmido F que protege contra la autotransferencia67,68,69.

a Mapa genético del plásmido F de 108 kb que indica las regiones líder (verde), Tra (roja) y de mantenimiento (azul), y las posiciones de los genes estudiados (triángulos). Las estrellas representan la ubicación genética de las inserciones PlacIQ1sfgfp. b Diagrama de resumen del tiempo de producción de cada fusión de proteína codificada por plásmido en células transconjugantes con respecto al tiempo de conversión de ss a dsDNA reflejado por la aparición del foco mCh-ParB (0 min). El diagrama representa los datos del aumento de foldchange en la señal sfGFP de la Fig. S5. Los colores naranja/verde, azul y rojo corresponden a la producción de proteínas de la región líder, de mantenimiento y de transferencia, respectivamente. Los tiempos de la producción citoplasmática de sfGFP del promotor PlacIQ1 insertado en las regiones intergénicas repE-sopA (repE), tnpA-ybaA (tnpA) y traM-traJ (traM) se representan en gris. Se indica el número (n) de células transconjugantes individuales de al menos tres réplicas biológicas analizadas. c Gráficas de fluctuación que muestran la fluorescencia verde intracelular (SNR) para cada fusión de sfGFP y reporteros dentro de células donantes en crecimiento vegetativo (izquierda) y transconjugantes (derecha) en el valor máximo de SNR de la Fig. S5. Cada punto representa datos de celdas individuales. Las medias y la DE se calculan a partir del número indicado (n=) de células transconjugantes de al menos tres réplicas biológicas independientes. Donantes de derivados F (ver Tabla S1), Receptor (LY358). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Primero realizamos experimentos de curso de tiempo en los que se adquirieron imágenes instantáneas de microscopía de la población de conjugación 1, 2, 4 y 6 h después de mezclar las células donantes y receptoras. Para cada punto de tiempo, la frecuencia de transconjugantes (T/R + T) se midió directamente a nivel de una sola célula a partir de la proporción de células receptoras que presentaban fluorescencia difusa de mCh-ParB (R) o células transconjugantes que albergaban focos de mCh-ParB (T ), y la relación señal/ruido (SNR) de fluorescencia verde intracelular se midió automáticamente (Fig. S4b-d). Este análisis instantáneo muestra que todos los derivados del plásmido F que llevan fusiones sfGFP conservaron su capacidad de transferencia y produjeron frecuencias de transconjugantes entre el 57 y el 95 % después de 6 h de apareamiento. Además, la adquisición de plásmidos portadores de fusión es seguida sistemáticamente por un aumento en la señal de sfGFP en células transconjugantes, con tiempos y niveles muy variables (Fig. S4b-d).

Se obtuvo una mejor resolución del nivel de producción y el momento de las fusiones de sfGFP con respecto a la conversión de ss a dsDNA (apariencia del foco mCh-ParB) en células transconjugantes individuales utilizando imágenes de lapso de tiempo de la conjugación realizada en la cámara de microfluidos (Películas S1, S2). Realizamos la detección de células transconjugantes y la cuantificación de las células sfGFP SNR intracelulares a lo largo del tiempo (Fig. S5a-d). Cuando la célula transconjugante se dividió, continuamos con la cuantificación de fluorescencia en las células hijas resultantes para monitorear la producción de sfGFP durante un período más largo. A partir de estos datos sin procesar, calculamos el aumento de veces en SNR por intervalo de 10 minutos, donde un aumento de veces superior a uno revela que las fusiones se están produciendo en los transconjugantes (Fig. S5a-d). Estos datos finalmente se tradujeron en un diagrama completo que presenta las ventanas de tiempo de producción para cada fusión en células transconjugantes en relación con el evento de conversión de ss a dsDNA (Fig. 3b). Este análisis revela que las fusiones que pertenecen a las diferentes regiones del plásmido exhiben tiempos de producción específicos con respecto a los pasos de procesamiento del plásmido.

Sorprendentemente, detectamos la producción sincrónica de las principales proteínas de fusión YgeA, PsiB, YfjB, YfjA y SsbF incluso antes de la aparición del foco mCh-ParB (Fig. 3b y Fig. S5a). Además, la producción de estas fusiones es solo transitoria, ya que alcanza su punto máximo en ~ 5 min y se detiene 25 a 35 min después del evento de conversión de ss a dsDNA. Esta observación inesperada indica que las fusiones principales comienzan a producirse cuando el plásmido todavía está en forma de ssDNA y se detiene rápidamente después de que el plásmido se convierte en forma de dsDNA. Una excepción interesante es YgfA-sfGFP, cuya producción solo se detecta en el intervalo de 10 a 20 minutos después de la aparición del foco mCh-ParB. El gen ygfA es el más cercano al oriT y, por lo tanto, es el primer gen que se transfiere al receptor (Fig. 3a y Fig. S4a). Sin embargo, la orientación del gen ygfA es opuesta a la de otros genes principales probados, lo que significa que la cadena T no se corresponde con la cadena molde para la transcripción de ygfA. En consecuencia, y de acuerdo con nuestras observaciones, la expresión de ygfA solo puede ocurrir después de sintetizar la cadena de plantilla complementaria mediante la conversión de ss a dsDNA.

La conversión de ss a dsDNA es seguida por la producción de proteínas de mantenimiento y Tra, comenzando con SopB y TraM, luego TraC y, finalmente, las fusiones TraS y TraT (Fig. 3b y Fig. S5b, c). Se espera que la producción de estas fusiones requiera la presencia del plásmido en forma de dsDNA ya que se sabe que los genes correspondientes están controlados por promotores de dsDNA (PsopAB para sopB, PM para traM y PY para traC y traST). Sin embargo, ¿qué podría explicar las diferencias observadas en los tiempos de producción? Abordamos si las discrepancias de tiempo podrían explicar simplemente la posición de las fusiones en el mapa genético del plásmido F. Esta posibilidad fue excluida por la observación de que la inserción del indicador fluorescente constitutivo PlacIQ1sfGFP (gen sfgfp bajo el control del promotor constitutivo PlacIQ1) en las regiones intergénicas repE-sopA, tnpA-ybaA y traM-traJ resultó en tiempos de producción de sfGFP similares, dentro de el intervalo de 0-10 min después de la aparición del foco mCh-ParB (Fig. 3b y Fig. S5d). En cambio, proponemos que los tiempos de producción diferenciales de los genes de mantenimiento y tra reflejan la actividad y regulación de los promotores de los genes correspondientes. El operón sopAB está bajo el control del promotor PsopAB, que es reprimido por la unión de SopA. Por lo tanto, se espera que el promotor PsopAB no esté completamente reprimido y sea activo en células transconjugantes desprovistas de SopA, lo que permite la producción rápida del complejo de partición SopAB requerido para la estabilidad y herencia del plásmido en las divisiones celulares. El gen traM está controlado por el promotor PM, que es débil pero constitutivamente activo, incluso antes de su activación completa al unirse a la proteína TraY70. Por el contrario, el promotor PY que controla la expresión de los genes traC, traS y traT necesita ser activado por la proteína TraJ, codificada por el gen traJ bajo el control de su propio promotor PJ y situada aguas arriba de PY4. El requerimiento de esta cascada de activación probablemente explica el retraso en la producción de TraC, TraS y TraT. El retraso adicional entre la producción de fusiones TraC y TraS/TraT podría reflejar potencialmente la distancia relativa de estos genes al promotor PY (5,9 kb para traC y 20,4 kb para traST). Es importante enfatizar que el plásmido F lleva una inserción natural de la secuencia de inserción IS3 en el gen finO del sistema de inhibición de la fertilidad FinOP, lo que da como resultado la regulación al alza y la expresión constitutiva de los genes tra71. Por lo tanto, se espera que otros plásmidos IncF en los que el sistema regulador FinOP todavía está activo muestren diferentes tiempos y niveles de producción de las proteínas Tra que los informados aquí.

En particular, los niveles intracelulares de proteínas Tra dentro de las células transconjugantes alcanzan una meseta entre 60 y 90 minutos después de la conversión de ss a dsDNA y permanecen estables a lo largo de nuestras observaciones (Fig. 3b y Fig. S5c). Esto implica que, en ese momento, las células transconjugantes han producido la maquinaria de transferencia y el sistema de exclusión y muy probablemente se han convertido en donantes de plásmidos competentes. En apoyo de esta interpretación, TraM, TraC, TraS, TraT y SopB se detectan a niveles similares en células donantes portadoras de F en crecimiento vegetativo (Fig. 3c y Figs. S4c, d, S5b, c). Este no es el caso de las proteínas líderes YgeA, PsiB, YfjB, YfjA y SsbF, cuyos niveles intracelulares comienzan a disminuir 25-35 min después de la conversión de ss a dsDNA en los transconjugantes, y que no se detectan en células donantes en crecimiento vegetativo ( Fig. 3c y Figs. S4b, S5a). Estos resultados son consistentes con la interpretación de que las proteínas principales se producen rápidamente y solo de forma transitoria tras la entrada del plásmido ssDNA en las células receptoras y no cuando el plásmido se mantiene en forma de dsDNA durante la replicación vegetativa.

Junto con trabajos previos37,38,54,56, la expresión temprana y transitoria de genes líderes en células transconjugantes respalda la existencia de secuencias específicas que actuarían como promotores monocatenarios para iniciar la transcripción de genes líderes del plásmido ssDNA internalizado. Utilizando el análisis bioinformático, identificamos una región aguas arriba de los genes ssbF, yfjA, yfjB, psiA y psiB, a la que llamamos Frpo2, que comparte un 92 % de identidad con la región Frpo informada anteriormente (rebautizada como Frpo1) ubicada aguas arriba de ygeA e ygeB y caracterizada previamente in vitro55 (Fig. 4a). La predicción del plegamiento del ADN utilizando mFold (http://www.unafold.org) indica que la forma monocatenaria de Frpo2 puede plegarse en una estructura de bucle de tallo altamente estable que también lleva cajas canónicas de −10 y −35, similar a la Frpo1 región (Fig. S6a)55. Abordamos el efecto de las deleciones de Frpo1 o Frpo2 en la expresión de los genes aguas abajo en células transconjugantes utilizando microscopía de células vivas. El análisis microscópico de células transconjugantes que recibieron F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp, F ΔFrpo2 ssbF-sfgfp o F ΔFrpo2 yjfA-sfgfp no reveló un aumento significativo en la fluorescencia de sfGFP antes o después de la conversión de ss a dsDNA en las células transconjugantes. (Figura 4b).

un Mapa genético de la región líder que muestra la posición de los genes (verde para las fusiones sfGFP estudiadas y blanco para los otros genes) y los promotores Frpo1 y Frpo2 (rojo) (arriba). El diagrama inferior muestra la estructura de bucle de tallo formada por las formas de ssDNA de las secuencias Frpo1 y Frpo2 (detalladas en la Fig. S6). b Histogramas de aumento de veces de sfGFP intracelular en transconjugantes después de la adquisición de F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp, F ΔFrpo2 ssb-sfgfp y F ΔFrpo2 yfjA-sfgfp. La media y la DE se calculan a partir de las células transconjugantes individuales indicadas (n) analizadas a partir de al menos tres experimentos independientes. Los niveles obtenidos con el plásmido Fwt de la Fig. S5a se muestran en verde como referencia. Donante de F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp (LY1368), F ΔFrpo2 ssb-sfgfp (LY1365), F ΔFrpo2 yfjA-sfgfp (LY1364) y el receptor (LY318). c Histogramas de Fwt, mutantes de deleción F ΔFrpo1, F ΔygeA, F ΔFrpo1 ΔygeA, F ΔFrpo1 ΔygeAB, FΔFrpo2 y FΔssbF frecuencia de transconjugante (T/R + T) estimada mediante ensayos de placas. La media y la desviación estándar se calculan a partir de tres experimentos independientes (que se muestran como puntos negros individuales). La significancia del valor de p ns y ****P ≤ 0,0001 se obtuvieron a partir de ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Donante de Fwt (LY875), F ΔFrpo1 (LY824), F ΔygeA (LY160), F ΔFrpo1 ΔygeA (LY1424), F ΔFrpo1 ΔygeAB (LY1425), F ΔFrpo2 (LY823), F ΔssbF (LY755), receptor (MS428). d Cuantificación de lapso de tiempo de una sola célula de la apariencia del foco Ssb-Ypet (línea azul) y la primera duplicación del foco mCh-ParB (línea roja) con respecto a la formación del foco mCh-ParB en células transconjugantes (0 min) que reciben el plásmido FΔssbF. Se indica el número de eventos de conjugación analizados (n) de cinco réplicas biológicas independientes. Los resultados obtenidos en la Fig. 2b con el plásmido Fwt se muestran en gris para comparar. e Gráfico de dispersión que muestra el tiempo transcurrido entre la aparición del foco Ssb-Ypet y la aparición del foco mCh-ParB en células transconjugantes después de la adquisición del plásmido F ΔssbF. Se indican la media y la DE calculadas a partir de (n) evento de conversión individual de ss a dsDNA (círculos azules) de cinco réplicas biológicas. La significación del valor de p ns (> 0.05 no significativo) se obtuvo de la prueba estadística bilateral de Mann-Whitney contra los resultados obtenidos con el plásmido Fwt (Fig. 2e). f Diagrama de dispersión que muestra el tiempo transcurrido entre la aparición del foco mCh-ParB y su duplicación visual en dos focos (primera duplicación) y en tres o cuatro focos (segunda duplicación) en células transconjugantes después de la adquisición del plásmido F ΔssbF. Se indican la media y la SD calculadas a partir de (n) eventos de duplicación individuales (círculos rojos) de ocho réplicas biológicas. Significancia del valor de P ** P = 0.0023 y *** P = 0.0007 se obtuvieron de la prueba estadística bilateral de Mann-Whitney contra los resultados obtenidos con el plásmido Fwt (Fig. 2f). Donante F ΔssbF (LY1068), receptor (LY358). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego abordamos el impacto de las eliminaciones de Frpo1 y Frpo2 en la eficiencia de la conjugación después de tres horas de apareamiento, según lo estimado por los ensayos de placas (Fig. 4c). F ΔFrpo1 exhibe una frecuencia significativamente reducida de transconjugantes de 25,2 ± 2,9 % en comparación con 92,6 ± 6,6 % para Fwt. Se obtuvieron resultados comparables para F ΔFrpo1 ΔygeAB (32,7 ± 7,1) y F ΔFrpo1 ΔygeA (14,5 ± 0,4). Sorprendentemente, la eliminación única de ygeA disminuye aún más la eficacia de la conjugación (3,9 ± 1,9 %) y, a pesar de nuestros múltiples intentos, nunca se pudo construir la eliminación de ygeB sola. Por el contrario, las deleciones de Frpo2 o ssbF no tienen un impacto significativo en la eficacia de la conjugación. Estos resultados muestran que se requieren Frpo1 y Frpo2 para la expresión temprana de los genes corriente abajo tras la entrada del plásmido en las células receptoras durante la conjugación in vivo. Sin embargo, los genes bajo el control de Frpo1 parecen tener un papel más crítico en la conjugación que los que están bajo el control de Frpo2.

La expresión rápida y transitoria de los genes líderes tras la entrada del plásmido sugiere fuertemente que las proteínas líderes tienen un papel esencial durante los primeros pasos del establecimiento del plásmido en la nueva célula huésped. La región principal conservada en varios plásmidos de enterobacterias codifica un homólogo de la proteína Ssb de unión a cadena sencilla codificada en el cromosoma de E. coli41,43,54,72,73,74. El gen ssb codificado cromosómicamente se conserva y es esencial en todos los organismos bacterianos, lo que plantea la cuestión de la razón de ser de los homólogos de ssb nacidos de plásmidos. Los primeros estudios muestran que la SsbF codificada por el plásmido F puede complementar parcialmente las mutaciones condicionales del gen cromosómico ssb73,75. De manera consistente, realizamos la visualización simultánea de SsbF-mCh producido a partir de un plásmido pTrc99a-ssbF-mch y el Ssb-Ypet codificado cromosómicamente (Fig. S7a) y observamos un posicionamiento intracelular similar (Fig. S7b) confirmado por análisis de colocalización (Fig. S7c) . Esto indica que tanto el plásmido SsbF como el huésped Ssb se reclutan en el ssDNA que sigue las horquillas de replicación en las células en crecimiento vegetativo. De manera similar, SsbF-sfGFP también forma focos en células transconjugantes que han adquirido el plásmido F ssbF-sfgfp, principalmente durante los eventos de duplicación del primer y segundo plásmido (Fig. S7d, e). No obstante, el papel de SsbF durante la conjugación aún no está claro y su eliminación del plásmido F no tiene un impacto significativo en la eficiencia de la conjugación (Fig. 4c).

Para obtener más información sobre el papel de SsbF durante la conjugación, revisamos la dinámica de la entrada de ssDNA, la conversión de ss a dsDNA y la duplicación del plásmido F ΔssbF. El análisis de imágenes de microscopía de lapso de tiempo revela que la eliminación de SsbF no tiene impacto en la dinámica de los focos conjugativos de Ssb-Ypet (Fig. 4d) o el momento de la conversión de ss a dsDNA (compare la Fig. 4e con la Fig. 2e). Sin embargo, la eliminación de SsbF retrasa drásticamente el momento de la duplicación del plásmido en las células transconjugantes (compárese la Fig. 4f con la Fig. 2f). El tiempo de retraso entre la aparición de mCh-ParB y la primera duplicación aumenta ~58 % (de 10,4 ± 4,7 para Fwt a 16,4 ± 9,5 para F ΔssbF), y el tiempo entre el primer y el segundo evento de replicación del plásmido aumenta ~29 % (de 10,1 ± 4,7 para Fwt a 13 ± 8 para F ΔssbF). Esto indica que SsbF tiene un papel en la facilitación de las primeras rondas de duplicación del plásmido en la nueva célula transconjugante, posiblemente al aumentar el grupo celular de proteína de unión monocatenaria disponible para la replicación del ADN. Esta función parece prescindible ya que la ausencia de SsbF retrasa la duplicación del plásmido pero no afecta a la eficacia final de la conjugación, al menos cuando la conjugación se realiza en condiciones óptimas entre cepas de E. coli MG1655.

Nuestro conocimiento actual de la conjugación surge principalmente de estudios genéticos, bioquímicos y estructurales experimentales que proporcionaron una comprensión bien documentada de las reacciones moleculares y los factores involucrados en la transferencia de ADN, mientras que los estudios genómicos y computacionales descubrieron la diversidad de plásmidos conjugativos y su importancia en la epidemiología. de la diseminación de la resistencia a los antibióticos. Es solo recientemente que la aplicación de la microscopía óptica ha comenzado a brindar información sobre la organización de la conjugación a escala celular58,59,76,77,78,79,80,81,82. En este estudio, la microscopía de células vivas combinada con indicadores fluorescentes desarrollados específicamente ofrece una vista única de la dinámica celular de la conjugación al tiempo que proporciona información sobre el momento y la localización de cada paso clave.

Informamos la presencia de plásmido ssDNA tanto en el lado del donante como en el del receptor durante la transferencia del plásmido. Notablemente, el plásmido ssDNA no se coloca aleatoriamente, sino que se asigna a ubicaciones subcelulares específicas dentro de las células del par de apareamiento. El punto de salida del plásmido ssDNA F se ubica preferentemente en el lado de la célula donante y preferentemente en las posiciones cuartas. Este patrón podría reflejar la posición intracelular de la maquinaria T4SS del plásmido F, que hasta donde sabemos, queda por describir. Esta posibilidad se debilitaría si la maquinaria del plásmido F T4SS se ubicara homogéneamente en toda la periferia de las células como en el caso de los plásmidos pTi y R38879,81. Alternativamente, la localización lateral de los poros de conjugación activos puede reflejar el acceso facilitado a las moléculas del plásmido F, que también se colocan en cuartos y se excluyen de los polos celulares83,84. Por el contrario, el ssDNA entra principalmente en la región polar de las células receptoras. Esto podría sugerir que el polo de la superficie de los receptores es la ubicación preferida para el pilus F del donante. apego o la estabilización de la pareja de apareamiento. Esta última posibilidad se ve reforzada por el hecho de que la estabilización de la pareja de apareamiento durante la conjugación F implica la interacción entre la proteína del plásmido TraN expuesta en la superficie de las células donantes y la proteína de la membrana externa del huésped OmpA de las células receptoras82,85. Se demostró que OmpA está enriquecido y es menos móvil en las regiones polares de las células de E. coli86, lo que posiblemente favorece la estabilización de la pareja de apareamiento y el poro de conjugación en esta ubicación.

El hallazgo inesperado de que el ssDNA aparece primero en la célula receptora y luego se acumula en el donante durante la conjugación también proporciona información sobre la actividad de TraI y su coordinación con la transferencia de la cadena T a través del T4SS o el RCR de los no- hebra transferida. Antes del inicio de la transferencia de ADN, el relaxosoma unido al oriT del plásmido se acopla al T4SS mediante la proteína de acoplamiento TraD, formando así el complejo de preiniciación (Fig. 5a (i)). Se propone el contacto con la célula receptora para inducir una señal que active el complejo de preiniciación. Descubrimos la existencia de un breve período en el que parte de la cadena T ya se transfirió a la célula receptora mientras que no hay ssDNA presente dentro del donante (Fig. 5a (ii). En esta etapa, la ausencia de ssDNA en el donante implica que todo el ssDNA generado por TraI ha sido eliminado, tanto por la transferencia de la hebra T a través del T4SS como por la complementación de la hebra de ssDNA no transferida por el RCR Después de este paso transitorio, el ssDNA también se acumula en el donante, lo que sugiere que el ssDNA se genera por la actividad de la helicasa TraI en el donante más rápido de lo que se elimina por transferencia y síntesis de RCR (Fig. 5a (iii)).

a(i) Antes del inicio de la conjugación, el complejo de preiniciación unido al origen de transferencia del plásmido se acopla al sistema de secreción Tipo IV (T4SS). (ii) El establecimiento de la pareja de apareamiento transduce una señal que activa el complejo de preiniciación. El desenrollado del plásmido dsDNA por la actividad helicasa de TraI produce el primer segmento de la cadena T, que se transfiere inmediatamente a la célula receptora donde recluta moléculas Ssb, mientras que la cadena no transferida se complementa con la replicación en círculo rodante ( RCR) en la célula donante. (iii) La actividad helicasa de TraI genera ssDNA a una tasa más alta que la cadena T que se transfiere a través de T4SS o la cadena no transferida se complementa con RCR, lo que da como resultado la acumulación de plásmido ssDNA recubierto por moléculas Ssb en el donante. celúla. b Tras la entrada del plásmido ssDNA en la célula receptora, las secuencias principales de Frpo1 y Frpo2 forman estructuras de bucle de tallo que sirven como promotores que inician la transcripción de los genes principales aguas abajo, lo que da como resultado rápidamente la producción de proteínas principales. La posterior conversión de ss a dsDNA inactiva Frpo1 y Frpo2 y autoriza la expresión de otros genes de plásmidos bajo el control de promotores de dsDNA convencionales. La producción de proteínas de mantenimiento, transferencia y otras codificadas por plásmidos finalmente da como resultado el desarrollo de nuevas funciones por parte de la célula transconjugante.

Suponiendo que la vida útil de 2,9 ± 1,1 min de los focos Ssb-Ypet en transconjugantes refleja el tiempo necesario para completar la internalización del plásmido F de ssDNA de 108 000 nt, calculamos una tasa de transferencia de 620 ± 164 nt s−1. Esto está razonablemente de acuerdo con la tasa histórica de 770 nt s−1 estimada a partir de los 100 min necesarios para transferir el cromosoma completo de E. coli de 4,6 Mb87. Además, la tasa de síntesis de ADN por la holoenzima ADN polimerasa III durante la RCR se estimó en 650-750 nuc s-1 88. En comparación, la tasa de actividad de la helicasa TraI se midió en 1120 ± 160 pb s-189. Estas estimaciones respaldan la opinión de que la acumulación de ssDNA en el donante explica la tasa más rápida de actividad de helicasa TraI que la tasa de transferencia de plásmido de cadena T o RCR. Por lo tanto, es posible que, en contraste con la propuesta previamente sugerida pero nunca demostrada, la actividad helicasa de la relaxasa no esté estrictamente acoplada con la actividad de translocación de ADN a través del T4SS.

La microscopía de células vivas descubre los pasos de conjugación de cronología global, como se resume en la Fig. 5b. El procesamiento del plásmido en la célula transconjugante es un proceso relativamente rápido, ya que la entrada del plásmido ssDNA y su conversión en dsDNA se completa en aproximadamente 4 min en promedio. Lo que es más importante, el evento de conversión de ss a dsDNA es el evento fundamental que determina el programa de expresión génica del plásmido. Los genes principales son los primeros en ingresar a la célula receptora y también los primeros en expresarse a partir del plásmido F en forma de ssDNA. De acuerdo con las propuestas anteriores55,56,57, mostramos que la expresión temprana de los genes principales depende de las secuencias que actúan como promotores monocatenarios cuando el plásmido aún se encuentra en forma de ssDNA. Como se describió anteriormente para Frpo1, proponemos que las secuencias altamente homólogas de Frpo2 identificadas aquí se pliega en estructuras estables de bucle de tallo que reconstruyen cajas de consenso -35 y -10, lo que da como resultado el inicio de la transcripción.

La expresión del gen líder también es transitoria, ya que la conversión de ss a dsDNA desactiva la producción de proteína líder al inactivar los promotores Frpo1 y Frpo2 mientras se autoriza la expresión de genes de mantenimiento, transferencia y otros genes de plásmidos bajo el control de los promotores de dsDNA convencionales, a menudo sujetos a sus propios genes. especificidades de la regulación. Los niveles de proteína de mantenimiento y transferencia dentro de los transconjugantes alcanzan un estado estacionario equivalente al de las células que contienen F en crecimiento vegetativo en alrededor de 30 a 90 minutos, dependiendo de la proteína. Curiosamente, nuestro trabajo anterior mostró que los factores de resistencia a la tetraciclina codificados por el transposón Tn10 insertado en la región intergénica ybdB-ybfA del plásmido F también se producen inmediatamente después de la conversión de ss a dsDNA y alcanzan el nivel de la célula resistente en ~90 min58. Estos hallazgos indican consistentemente que esta escala de tiempo corresponde al período necesario para que las células transconjugantes adquieran funciones codificadas por el plásmido, incluido el mantenimiento del plásmido, la capacidad de conjugación, la inmunidad contra la autotransferencia y la resistencia adicional potencialmente transportada por el plásmido.

La regulación de la expresión génica del plásmido mediante el procesamiento del plásmido es una forma elegante de garantizar la producción secuencial y oportuna de proteínas del plásmido en la célula transconjugante y, en particular, de restringir la producción de factores principales a una ventana de tiempo estrecha después de la entrada del plásmido ssDNA. Sin embargo, la síntesis de proteínas de novo podría no ser la única forma de proporcionar a la célula transconjugante proteínas codificadas por plásmidos. Un trabajo reciente de Al Mamun et al. informa que la transferencia del plásmido similar a F pED208 (IncFV) es concomitante con la translocación de varias proteínas codificadas por plásmidos, incluidas TraI, ParA, ParB1, el homólogo de Ssb SsbED208, ParB2, PsiB y PsiA90. La translocación de proteínas se detectó a baja frecuencia (10-5 recombinantes por célula donante entre una y cinco horas de apareamiento) usando un ensayo de recombinasa Cre altamente sensible. La translocación de proteínas también podría ocurrir durante la transferencia del plásmido F nativo, pero no podría explicar únicamente nuestras observaciones. De hecho, nuestro análisis de microscopía muestra que las fusiones principales de YgeA, PsiB, YfjB, YfjA y SsbF están por debajo del umbral de detección de microscopía en las células donantes, pero se cuantifican a niveles intracelulares significativos en todas las células transconjugantes. Esto implica que las cantidades de proteínas principales observadas en las células transconjugantes no pueden originarse simplemente a partir de células donantes, sino que resultan de la síntesis de proteínas de novo, que mostramos depende de las secuencias Frpo1 y Frpo2. Por lo tanto, parece probable que la translocación directa de proteínas y la síntesis de novo sean mecanismos concomitantes que garanticen la presencia de factores principales y funciones asociadas inmediatamente después de la entrada del plásmido ssDNA en la célula transconjugante. Esto sugiere además el papel crítico de la región líder en la conjugación. Varios elementos apoyan esta opinión. La región principal se conserva en una variedad de plásmidos conjugativos41,42,43,44,45,46. Además, las regiones líderes de plásmidos que pertenecen a una amplia gama de grupos de incompatibilidad (IncF, IncN, IncP9 e IncW) clasificados como plásmidos MOBF que usan la relaxasa como marcador filogenético se reportaron como el objetivo preferencial para los sistemas CRISPR-Cas dirigidos contra conjugación8,91,92. Recientemente, se demostró que la región principal es un objetivo evolutivo importante para la diseminación del plásmido pESBL (IncI)93. Con respecto al plásmido F, podemos enfatizar que Frpo1 y Frpo2 comparten un 92% de similitud a nivel de nucleótidos y están ubicados a solo 5 kb de distancia. Esto implica que cuando están en forma de dsDNA durante la replicación del plásmido vegetativo, las secuencias de Frpo1 y Frpo2 serían un sustrato potencial para la recombinación homóloga, lo que daría como resultado la eliminación del segmento intermedio. Sin embargo, el segmento intermedio porta los genes flmAB, homólogos funcionales del sistema toxina-antitoxina hok/sok del plásmido R194, que probablemente salvaguarden la estabilidad de la región líder.

A pesar de este cuerpo de evidencia, actualmente es un desafío racionalizar la importancia de la región principal ya que aún se desconocen las funciones moleculares de la mayoría de las proteínas principales. Nuestros datos indican que los genes aguas abajo de Frpo1 (ygeA et ygeB) tienen una función crítica en la conjugación. Por el contrario, los genes ubicados aguas abajo de Frpo2 (ssbF, yfjA, yfjB, psiB, psiA y flmC) parecen ser prescindibles ya que las eliminaciones de Frpo2, ssbF o psiB44 no tienen un impacto significativo en la eficiencia de conjugación general abordada por los ensayos de placas. Sin embargo, se ha demostrado que SsbF y PsiB suprimen la inducción de SOS inducida por la conjugación en la célula transconjugante43,54,90, lo que probablemente sea importante para la fisiología y proliferación del transconjugante más que para la transferencia de plásmidos per se. Una limitación potencial del estudio de conjugación es que los ensayos de eficiencia de transferencia generalmente se realizan entre cepas bacterianas idénticas o estrechamente relacionadas en condiciones óptimas de temperatura y medio. Es probable que esto socave el papel de los genes que no son estrictamente esenciales pero que podrían facilitar u optimizar la conjugación o ayudar a la proliferación de la célula transconjugante. Por lo tanto, es posible que la importancia de los factores principales se revele mejor en condiciones menos favorables, entre bacterias filogenéticamente distantes o en la escala evolutiva. Mientras tanto, la microscopía en tiempo real podría ayudar a descubrir la influencia potencialmente sutil de estos genes en la secuencia de conjugación en células vivas.

Las cepas bacterianas se enumeran en la Tabla S1, los plásmidos en la Tabla S2 y los oligonucleótidos en la Tabla S3. La fusión de genes con etiquetas fluorescentes y la eliminación de genes en el plásmido F utilizó la recombinación λRed95,96. Los plásmidos F modificados se transfirieron a la cepa de fondo K12 MG1655 por conjugación. Cuando se requirieron múltiples modificaciones genéticas en el plásmido F, los genes kan y cat se eliminaron usando una recombinación específica del sitio inducida por la expresión de la recombinasa Flp del plásmido pCP2095. La clonación de plásmidos fue realizada por Gibson Assembly y verificada por secuenciación de Sanger (Eurofins Genomics biotech). Las cepas y los plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger (Eurofins Genomics). Las células se cultivaron a 37 °C en un medio M9 suplementado con glucosa (0,2 %) y casaminoácido (0,4 %) (M9-CASA) antes de la toma de imágenes, y en caldo Luria-Bertani (LB) para ensayos de eficiencia de conjugación. Cuando fue apropiado, los suplementos se usaron en las siguientes concentraciones; Ampicilina (Ap) 100 µg/ml, Cloranfenicol (Cm) 20 µg/ml, Kanamicina (Kn) 50 µg/ml, Estreptomicina (St) 20 µg/ml y Tetraciclina (Tc) 10 µg/ml.

Los cultivos durante la noche en LB de células receptoras y donantes se diluyeron a un A600 de 0,05 y se cultivaron hasta que se alcanzó un A600 comprendido entre 0,7 y 0,9. Se mezclaron 25 µl de cultivo donante y 75 µl de cultivo receptor en un tubo Eppendorf y se incubaron durante 90 min a 37 °C. Se añadió suavemente alrededor de 1 ml de LB y los tubos se incubaron nuevamente durante 90 min a 37 °C. La mezcla de conjugación se agitó, se diluyó en serie y se sembró en agar LB X-gal 40 µg/ml IPTG 20 µM suplementado con el antibiótico apropiado para seleccionar poblaciones de receptores o donantes. A continuación, las colonias receptoras (R) se sembraron en placas de agar LB que contenía tetraciclina 10 µg/ml para seleccionar transconjugantes (T) y la frecuencia de transconjugantes se calculó a partir de (T/R + T) presentado en la Fig. 4c.

Los cultivos durante la noche en M9-CASA se diluyeron a un A600 de 0,05 y se cultivaron hasta alcanzar un A600 = 0,8. Las muestras de conjugación se obtuvieron mezclando 25 µl del donante y 75 µl del receptor en un tubo Eppendorf. Para los experimentos de lapso de tiempo, se cargaron 50 µl del cultivo puro o la mezcla de conjugación en una cámara microfluídica B04A (ONIX, CellASIC®)97. El suministro de nutrientes se mantuvo a 1 psi y la temperatura se mantuvo a 37 °C durante todo el proceso de formación de imágenes. Se tomaron imágenes de las células cada 1 o 5 min durante 90 a 120 min. Para obtener imágenes instantáneas, se colocaron muestras de 10 µl de cultivo clonal o mezcla de conjugación en una almohadilla de agarosa al 1 % M9-CASA en un portaobjetos98 y se tomaron imágenes directamente.

Las imágenes de microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional se llevaron a cabo en un microscopio Eclipse Ti2-E (Nikon), equipado con un objetivo de fase Plan Apo Lambda de aceite x100/1,45, una cámara CMOS digital ORCA-Fusion (Hamamatsu) y utilizando el software NIS para la adquisición de imágenes. . Las adquisiciones se realizaron utilizando una potencia del 50 % de una fuente de luz Fluo LED Spectra X a longitudes de onda de excitación de 488 y 560 nm. Los ajustes de exposición fueron 100 ms para Ypet, sfGFP y mCherry y 50 ms para el contraste de fase.

El análisis cuantitativo de imágenes se realizó utilizando el software Fiji con MicrobeJ plugin99. Para el análisis de instantáneas, la detección del contorno de las células se realizó automáticamente con MicrobeJ y se verificó con la interfaz de edición manual. Para los experimentos de lapso de tiempo, la detección de celdas se realizó de forma semiautomática utilizando la interfaz de edición manual, que permite seleccionar las celdas a monitorear y detectar automáticamente los contornos de las celdas. Dentro de las poblaciones de conjugación, las categorías de donante (sin señal de mCh-ParB), receptor (señal difusa de mCh-ParB) o transconjugante (focos de mCh-ParB) se asignaron mediante la opción "Tipo" de MicrobeJ. Las células receptoras se detectaron sobre la base de la presencia de fluorescencia roja por encima del nivel de fondo de autofluorescencia de la célula detectado en los donantes. Entre estas células receptoras, los transconjugantes se identificaron ejecutando la detección automática MicrobeJ de los focos de fluorescencia ParB (detección máxima). Este enfoque se usó independientemente de la presencia o ausencia de las fusiones Ssb-Ypet o sfGFP dentro de las células del donante y el receptor. Dentro de los diferentes tipos de células, los parámetros de fluorescencia de intensidad media (au), asimetría, relación señal/ruido (SNR) o longitud de células (µm) se extrajeron y trazaron automáticamente utilizando MicrobeJ. SNR corresponde a la relación (señal intracelular media/señal de ruido media), donde la señal intracelular media es la señal de fluorescencia por área celular y el ruido es la señal medida fuera de las células (debido a la fluorescencia emitida por el medio circundante). En contraste con la cantidad total de fluorescencia por célula, que depende del tamaño/edad de la célula y representa el fondo, la estimación cuantitativa de SNR es más adecuada para la cuantificación imparcial de la fluorescencia intracelular a lo largo del tiempo. Los focos Ssb-Ypet, SsbF-mCh y mCh-ParB se detectaron utilizando la función de detección MicrobeJ Maxima, y ​​la localización de los focos y la intensidad de fluorescencia se extrajeron y trazaron automáticamente. Las parcelas que presentaban datos de lapso de tiempo se alinearon con el primer cuadro donde la célula transconjugante exhibe un foco conjugativo Ssb-Ypet (adquisición de ssDNA) o un foco mCh-ParB (conversión de ss a dsDNA) como se indica en la leyenda de la figura correspondiente. Es importante destacar que, debido a que la conjugación es asíncrona en la población, las películas de lapso de tiempo no siempre capturan la secuencia completa de la transferencia de ADN, es decir, la aparición/desaparición del foco Ssb-Ypet, la formación del foco mCh-ParB, el primer y segundo evento de duplicación mCh-ParB. Es de destacar que el uso de lapsos de tiempo de 1 min / fotograma fue adecuado para analizar la aparición / desaparición de Ssb-Ypet en relación con la formación de mCh-ParB (Fig. 2b-e), pero provocó el blanqueo de mCh-ParB, lo que dificultó el análisis de mCh-ParB eventos de duplicación a largo plazo. Luego, utilizamos lapsos de tiempo de 5 min / cuadro para analizar los eventos de duplicación primero y segundo de mCh-ParB en relación con la formación del foco mCh-ParB (Fig. 2b, f). Asimismo, se realizó la caracterización de los diferentes parámetros de transferencia mediante análisis específicos. Por ejemplo, los retrasos de tiempo se calcularon contando el número de fotogramas entre los dos eventos considerados (aparición y desaparición de Ssb-Ypet en las Figs. 2e, 4e; formación de foco mCh-ParB y primera o segunda duplicación en las Figs. 2f, 4f). Por el contrario, las Figs. 2b, 4b se generaron anotando la presencia/ausencia de focos Ssb-Ypet o mCh-ParB en cada marco de lapso de tiempo.

La importancia del valor de P se analizó ejecutando pruebas estadísticas específicas en el software GraphPad Prism. Los datos de una sola célula del análisis de microscopía cuantitativa se extrajeron de la interfaz MicrobeJ y se transfirieron a GraphPad. La importancia del valor de p de los datos cuantitativos de una sola celda se realizó mediante la prueba estadística bilateral no paramétrica de Mann-Whitney no emparejada, que permite comparar las diferencias entre grupos de datos independientes sin el supuesto de distribución normal. La significación del valor de p para la frecuencia de transconjugantes obtenidos mediante ensayos de placas se evaluó mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, que permite determinar la significación estadística de las diferencias observadas entre las medias de tres o más grupos experimentales independientes frente a una media del grupo de control (correspondiente al Fwt). Cuando se requiere, el valor de P y el significado se indican en los paneles de figuras y dentro de la leyenda correspondiente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos para comprender y evaluar las conclusiones de esta investigación están disponibles en el texto principal y la Información Complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento en el archivo de datos de origen. Los datos de microscopía sin procesar están disponibles en Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21206444). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Los autores agradecen al National BioResource Project y Coli Genetic Stock Center por proporcionar cepas, A. Ducret por su valiosa ayuda con MicrobeJ y N. Fraikin por su útil debate. Esta investigación fue financiada por la Fundación para la Investigación Médica, número de subvención FRM-EQU202103012587 a CL y AC; la Agencia Nacional de Investigación de Francia, concesión número ANR-18-CE35-0008 a CL, YY y KG; y la Universidad de Lyon a través de la financiación de CVCL también reconoce a la Fundación Schlumberger para la Educación y la Investigación (FSER 2019).

Microbiología Molecular y Bioquímica Estructural (MMSB), Université Lyon 1, CNRS, Inserm, UMR5086, 69007, Lyon, Francia

Agathe Couturier, Chloé Virolle, Kelly Goldlust, Annick Berne-Dedieu, Audrey Reuter, Sophie Nolivos, Sarah Bigot y Christian Lesterlin

Universidad Paris-Saclay, CEA, CNRS, Instituto de Biología Integrativa de la Célula (I2BC), 91198, Gif-sur-Yvette, Francia

yoshiharu yamaichi

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CL y SB concibieron, diseñaron y supervisaron la ejecución del estudio; AC, CV, KG, AB-D., AR, SN y SB realizaron los experimentos y analizaron los datos. CL y SB escribieron el artículo y CL preparó las cifras. CL y YY proporcionaron financiación.

Correspondencia a Sarah Bigot o Christian Lesterlin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Couturier, A., Virolle, C., Goldlust, K. et al. Visualización en tiempo real de la dinámica intracelular de la transferencia de plásmidos conjugativos. Nat Comun 14, 294 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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Recibido: 05 Octubre 2022

Aceptado: 11 de enero de 2023

Publicado: 18 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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