Visualización de micro

Oct 18, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13375 (2022) Citar este artículo

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Las técnicas de microscopía óptica son una opción popular para visualizar microagentes. Generan imágenes con una resolución espaciotemporal relativamente alta, pero no revelan información codificada para distinguir los microagentes y el entorno. Este estudio presenta microscopía de fluorescencia multicolor para la identificación codificada por colores de microagentes móviles y entornos dinámicos mediante desmezcla espectral. Informamos el rendimiento de la microscopía multicolor al visualizar la unión de microagentes individuales y de grupo a esferoides de cáncer formados con células HeLa como prueba de concepto para la demostración de administración de fármacos dirigida. Se desarrolla un chip de microfluidos para inmovilizar un único esferoide para la unión, proporcionar un entorno estable para la microscopía multicolor y crear un modelo de tumor en 3D. Para confirmar que la microscopía multicolor es capaz de visualizar microagentes en entornos vascularizados, se emplean como modelos experimentales una red de vasculatura in vitro formada con células endoteliales y membrana corioalantoidea de pollo ex ovo. La visualización completa de nuestros modelos se logra mediante la excitación secuencial de los fluoróforos en forma rotativa y la adquisición de imágenes individuales sincrónicas de tres bandas de espectro diferentes. Demostramos experimentalmente que la microscopía multicolor descompone espectralmente microagentes, cuerpos orgánicos (esferoides y vasculaturas cancerosas) y medios circundantes utilizando fluoróforos con características de espectro bien separadas y permite la adquisición de imágenes con 1280 \(\times\) 1024 píxeles hasta 15 fotogramas por segundo. Nuestros resultados muestran que la microscopía multicolor en tiempo real proporciona una mayor comprensión mediante la visualización codificada por colores con respecto al seguimiento de microagentes, la morfología de los cuerpos orgánicos y la distinción clara de los medios circundantes.

El campo de la microrobótica ha abierto nuevas vías para diversas aplicaciones en medicina gracias a los avances en las tecnologías de micro/nanofabricación1,2,3. Una de las aplicaciones más destacadas es la administración dirigida de fármacos, que es una técnica innovadora para aumentar la tasa de éxito del tratamiento, mitigar los efectos secundarios de los medicamentos y reducir el tiempo de recuperación del paciente4,5. Los microagentes, los efectores finales de los sistemas de microrobótica, se utilizan como transportadores para la administración de fármacos en nanopartículas y se dirigen hacia el tejido de interés mediante estímulos externos (p. ej., campos magnéticos y ondas acústicas)6. Las técnicas de imagen se utilizan para que los microagentes lleguen al tejido objetivo, ya que la integración del sensor sigue siendo un desafío debido a las limitaciones de tamaño7,8. Las imágenes adquiridas pueden considerarse solo una fuente de retroalimentación para la identificación de objetivos, la manipulación de los microagentes y la liberación de los fármacos en la ubicación deseada. Por lo tanto, la visualización clara juega un papel crucial en el proceso de entrega.

La resonancia magnética nuclear (RMN), la tomografía computarizada (TC), la fluoroscopia, la ecografía y la imagen fotoacústica se utilizan para visualizar microagentes en condiciones in vitro e in vivo. La resonancia magnética se utiliza para la activación y visualización simultáneas de microagentes con una alta relación contraste-ruido9,10,11. Además, las imágenes de resonancia magnética contienen detalles anatómicos con una alta relación de contraste a ruido para una dirección precisa de los microagentes. Sin embargo, la baja tasa de adquisición de imágenes de MRI hace que no sea adecuada para aplicaciones de microagentes que requieren visualización en tiempo real12. Al igual que la RM, la TC proporciona imágenes de alta resolución de microagentes, pero tiene un espacio de trabajo limitado para la integración de sistemas de actuación y detección13. La fluoroscopia es un método de imagen alternativo para la TC para obtener un espacio de trabajo más grande y lograr una mayor tasa de adquisición de imágenes14,15. Tanto la TC como la fluoroscopia tienen efectos nocivos tanto para los médicos como para los pacientes debido a la exposición a la radiación ionizante16. Entre las modalidades de imagen, las técnicas basadas en ultrasonido no tienen efectos secundarios conocidos sobre la salud y se utilizan para la visualización en tiempo real de los microagentes17,18,19,20,21. Las imágenes por ultrasonido proporcionan un gran espacio de trabajo para la colocación de los sistemas de actuación, ya que las imágenes se adquieren con una pequeña sonda manual22,23,24. Sin embargo, las imágenes de ultrasonido son inherentemente ruidosas y contienen artefactos que dificultan la detección de microagentes. Las imágenes fotoacústicas superan la limitación de las imágenes por ultrasonido mediante la mejora del contraste con microagentes. La absorción de luz calienta los microagentes que contienen materiales metálicos y las ondas acústicas posteriores se generan por expansión térmica25. Las ondas acústicas generadas hacen que los microagentes alcancen una relación señal/ruido más alta que la ecografía y se resuelvan del entorno26,27,28.

Las técnicas de microscopía óptica se utilizan para pruebas preliminares y microagentes en aplicaciones de laboratorio en un chip, ya que los entornos experimentales se fabrican con materiales transparentes6,7. Las técnicas de microscopía de fluorescencia de campo brillante y de banda única se utilizan ampliamente para visualizar microagentes. La visualización completa de las muestras se obtiene con microscopía de campo brillante, pero las diferencias de altura entre los microagentes y el entorno físico provocan que las imágenes adquiridas se vean borrosas29. La microscopía de fluorescencia de banda única solo proporciona visualización de microagentes con alta resolución y no proporciona información sobre el entorno30,31. En nuestro estudio anterior, se introdujo la microscopía de fluorescencia multicolor para superar las limitaciones de las técnicas de microscopía óptica para visualizar microagentes29. Se desarrolló un microscopio multicolor de campo amplio como herramienta para recopilar imágenes enfocadas de diferentes bandas de espectro y corregir aberraciones. Las muestras completas se resolvieron espectralmente y se obtuvo una visualización sin oclusión de microagentes y alrededores.

En este estudio, abordamos la falta de imágenes multicolores en tiempo real de microagentes y alrededores. La principal diferencia entre las técnicas de imagen utilizadas en estudios anteriores y nuestro enfoque es que se establece un mejor mecanismo de comprensión de la funcionalidad y la dinámica de los microagentes mediante la codificación por colores de las muestras completas. Dado que el color es un portador de información esencial para la percepción humana y la amplificación de la cognición, las imágenes multicolores adquiridas permiten una visualización clara de los microagentes y el entorno32. El potencial de la microscopía multicolor se demuestra mediante la visualización de microagentes móviles como sustitutos de los portadores de fármacos en tumores 3D y entornos vascularizados. Las principales contribuciones de este estudio (en el campo de la microrrobótica) son (1) la demostración de la microscopía de fluorescencia multicolor en tiempo real mediante la separación espectral de microagentes, cuerpos orgánicos (esferoides y vasos de cáncer) y canales de microfluidos. (2) Desarrollar un chip de microfluidos que inmovilice un solo esferoide de cáncer 3D en una ubicación fija para tareas de entrega con microagentes y adquisición de imágenes multicolores desde un entorno confinado. (3) Visualización codificada por colores en tiempo real de microagentes dentro de la red vascular perfundible in vitro formada en un sistema de microfluidos. Además, se llevan a cabo múltiples experimentos de imágenes utilizando microagentes con diferentes geometrías y tamaños para mostrar nuestras contribuciones.

Para los experimentos de imágenes, se crea un modelo tumoral colocando esferoides de cáncer formados con células HeLa cervicales en el chip de microfluidos desarrollado lleno de medio de cultivo. La red vascular de microfluidos basada in vitro y la membrana corioalantoidea de pollo basada ex ovo se utilizan como modelos para visualizar microagentes dentro de entornos vascularizados. Las imágenes multicolores se adquieren a través de experimentos en los que los microagentes se mueven magnéticamente dentro de los modelos. La adquisición de imágenes multicolores en tiempo real se configura en función de una codificación de colores inequívoca, así como de la excitación de los fluoróforos con intervalos de tiempo mínimos. En primer lugar, la diafonía espectral inhabilita la identificación de microagentes y su entorno a partir de una sola banda de espectro y su visualización con un color designado. Para superar la diafonía, los fotones de fluorescencia emitidos se recogen de tres bandas de espectro relativamente bien separadas para la formación de imágenes individuales. En segundo lugar, los fluoróforos tienen una vida útil limitada y la intensidad de los fotones de fluorescencia emitidos disminuye durante la obtención de imágenes debido al fotoblanqueo. Para prolongar la vida útil de las imágenes multicolores mediante la reducción del fotodaño en los fluoróforos, se utiliza una estrategia de excitación secuencial.

Los beneficios de las estrategias de excitación simultánea33,34 y secuencial35,36 para la microscopía de fluorescencia multicolor se estudian ampliamente utilizando estructuras celulares. La excitación simultánea de los fluoróforos proporciona la adquisición de imágenes de bandas de espectro sin demora. Sin embargo, las imágenes adquiridas contienen interferencias significativas que inhabilitan la detección inequívoca de microestructuras o compartimentos específicos. La excitación secuencial de los fluoróforos y la activación sincrónica de los sensores de imagen (es decir, multiplexación espectral) superan la diafonía37,38. El inconveniente de la estrategia secuencial es que las imágenes con resolución espectral se adquieren con el mismo retraso, lo que limita la tasa de formación multicolor39. Los modelos que contienen microagentes móviles y estacionarios se resuelven por completo sin diafonía mediante la excitación secuencial de los fluoróforos de forma rotativa y la adquisición de imágenes sincrónicas con la secuencia de excitación. La visualización en tiempo real de los modelos se obtiene mediante una multiplexación espectral relativamente rápida.

Descripción general de la fabricación de microagentes magnéticos y fluorescentes mediante electrohilado. ( a ) Representación esquemática de la configuración de electrohilado y el contenido de la solución de polímero. (b1) y (b2) Imágenes de microscopio electrónico de barrido de las mallas de fibras rectas y con cuentas depositadas en el colector usando electrospinning, respectivamente. (c1) Proceso de molienda de polímeros para la obtención de micro-agentes cortando las fibras continuas utilizando un sonicador. (c2) Imágenes de fluorescencia de los microagentes fabricados. (c3) Perfil de superficie 3D del microagente visualizado usando microscopía confocal. ( d1 ) Análisis de espectro ultravioleta-visible de cumarina-6 en dimetilformamida (DMF). (d2) y (d3) Análisis de espectro de cumarina-6 en DMF a diferentes longitudes de onda de excitación y emisión. (e1) Microscopía de fluorescencia para visualizar el movimiento de microagentes con un campo magnético de 21 mT. (e2) Los campos vectoriales superpuestos a las imágenes de fluorescencia muestran el movimiento de los microagentes analizados mediante el flujo óptico de Lucas-Kanade. Barra de escala 100 \(\upmu\)m.

Nuestros microagentes se fabrican triturando las fibras rectas y perladas continuas sintetizadas mediante electrohilado (Fig. 1). Las fibras sintetizadas consisten en poliestireno como polímero portador y nanopartículas de óxido de hierro (\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)) como material magnético (Fig. 1b). La cumarina 6 se selecciona para teñir las fibras ya que está inmovilizada en una matriz de poliestireno e insoluble en agua. Además, la cumarina 6 tiene una resistencia al fotoblanqueo relativamente alta. El proceso de molienda rompe las fibras en fragmentos usando ondas de ultrasonido. Esto permite obtener microagentes magnéticos y fluorescentes que varían en tamaño de 4 a 131 \(\upmu\)m (Fig. 1c1,c2). Se realiza microscopía de fluorescencia de banda única para visualizar el movimiento y la interacción electrostática de los microagentes fabricados en el agua Milli-Q. La figura 2a muestra el movimiento de tracción de dos microagentes fabricados con fibras rectas. La figura 2b demuestra el movimiento dinámico de un microagente fabricado con fibras de perlas. Durante los experimentos con imágenes, observamos que los microagentes fabricados con fibras rectas están completamente cargados con \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) y son rígidos. Por otro lado, la solución polimérica preparada para la síntesis de fibra perlada permite la fabricación de micro-agentes flexibles ya que la distribución de \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) es aleatoria. Las Figuras 2c1–c3,d1,d2 muestran el movimiento diagonal y vertical de un microagente flexible que utiliza un campo magnético oscilante, respectivamente. La interacción electrostática entre microagentes se visualiza mediante tres experimentos. El primer experimento se lleva a cabo para visualizar el comportamiento de los microagentes en un campo giratorio. Observamos que los microagentes fabricados con fibras rectas y con cuentas se agregan debido a la interacción dipolo-dipolo y forman un grupo con el tiempo. La Figura 2e muestra un caso representativo para la formación de un grupo de microagentes con un campo giratorio de 16 mT a 8 Hz. El segundo experimento está diseñado para visualizar la unión de dos microagentes que utilizan fuerzas electrostáticas. La Figura 2f1 muestra imágenes de lapso de tiempo adquiridas resaltando el archivo adjunto (autoensamblado). El movimiento de los microagentes adjuntos se representa como campos vectoriales utilizando el flujo óptico de Lucas-Kanade y se muestra en la Fig. 2f240. Nuestros resultados muestran que los microagentes adjuntos se mueven juntos y las fuerzas electrostáticas evitan la desagregación. En el tercer experimento se observa el comportamiento de los microagentes cuando no se les aplica campo magnético. Las imágenes adquiridas revelan que los microagentes fabricados con fibras rectas se hunden y crean un patrón de autoorganización en forma de línea tanto en un depósito abierto como en un canal de microfluidos (Fig. 2g1, g2). El patrón de autoorganización no se observa cuando se repite el experimento con los microagentes fabricados con fibras de perlas. Una disminución en la concentración de material magnético en los microagentes inhabilita el comportamiento de autoorganización. Los microagentes fabricados se utilizan como sustitutos de los portadores de fármacos y se unen a los esferoides de células HeLa teñidos con CellTracker Red CMTPX.

Microscopía de fluorescencia de banda única para visualizar microagentes magnéticos marcados con cumarina 6. (a) La imagen de lapso de tiempo muestra el movimiento hacia adelante de los microagentes por tracción magnética. (b) La secuencia de instantáneas demuestra el movimiento oscilante del microagente. (c1) y (d1) Las imágenes de fluorescencia superpuestas muestran el movimiento diagonal y vertical de los microagentes, respectivamente. (c2), (c3) y (d2) Patrones de movimiento oscilante de los microagentes. (e) Agregación de los microagentes por un campo magnético giratorio. (f1) Unión de los microagentes por interacción electrostática. (f2) El campo vectorial expresa el movimiento de los microagentes adjuntos analizados mediante el flujo óptico de Lucas-Kanade. (g1) y (g2) Autoorganización de los microagentes en un reservorio y un canal microfluídico, respectivamente. Barra de escala 100 \(\upmu\)m.

Visualizamos la unión de microagentes únicos y múltiples a esferoides de células HeLa con tres experimentos en un depósito abierto que contiene verde de indocianina en el medio de cultivo. En todos los experimentos, se forman imágenes multicolores a 15 fps y los microagentes se dirigen hacia los esferoides con una intensidad de campo magnético de 36 mT. En los primeros dos experimentos, los microagentes con puntas afiladas se unen perforando los esferoides (Fig. 3a1,b1). En el tercer experimento, tres microagentes se unen consecutivamente al esferoide. Los primeros dos microagentes se adhieren a la superficie del esferoide por interacción electrostática, mientras que el tercer microagente se adhiere mediante perforación (Fig. 3c1). Los archivos adjuntos se verifican mediante la detección de cambios a largo plazo utilizando imágenes dinámicas. La luz de excitación genera un gradiente de calor entre las áreas iluminadas y no iluminadas, lo que da como resultado un flujo. Visualizamos la movilidad de los microagentes en el flujo como un método pasivo para la verificación de apego. El efecto del flujo en los microagentes adjuntos y no adjuntos durante 92 min se muestra en la Fig. 3a2. Aunque la velocidad del microagente adjunto se mide aproximadamente en 0 \(\upmu\)m/s, los microagentes no adjuntos son movilizados por el flujo. También observamos que un microagente no adjunto movido por el flujo se agrega con el microagente adjunto utilizando fuerzas electrostáticas (Fig. 3a3). El desplazamiento de los microagentes agregados se mide 0 \(\upmu\)m durante 92 min. Nuestro experimento valida que la unión al esferoide aumenta la inercia de los microagentes y los inmoviliza en el flujo. En todos los experimentos, los archivos adjuntos se verifican al visualizar la inmovilidad de los microagentes en el flujo durante más de 90 minutos (Fig. 3a2-c2). Las imágenes dinámicas adquiridas para la verificación también revelan que los microagentes adjuntos se desplazan junto con los esferoides debido a la evaporación del medio dentro del depósito por el calor generado (Fig. 3a3,b2,c2). Después de la evaporación completa del medio, los desplazamientos se miden 20 \(\upmu\)m y 68 \(\upmu\)m para los esferoides a los que se unen microagentes individuales y múltiples, respectivamente. Para confirmar que la evaporación no afecta el apego, se mueve rotativamente un microagente alrededor de su parte insertada en el esferoide con un campo magnético de 14 mT durante dos minutos (Fig. 3b3). La velocidad máxima para el extremo distal del microagente se mide como 1,4 longitud corporal/s (180 \(\upmu\)m/s). No se observa desprendimiento del microagente del esferoide. Nuestros resultados muestran que la microscopía multicolor genera imágenes codificadas por colores en tiempo real para visualizar y verificar la unión de microagentes a los esferoides.

Microscopía de fluorescencia multicolor de lapso de tiempo para la unión de microagentes magnéticos únicos y múltiples a esferoides de células HeLa. (a1–c1) Unión de microagentes a esferoides de células HeLa con un campo magnético de 36 mT. (a2,a3) Efecto del flujo pasivo sobre los microagentes adheridos y no adheridos. (b2,c2) Visualización de los cambios en los microagentes unidos a los esferoides. (b3) Comprobación de la unión mediante el movimiento de rotación del microagente alrededor de su parte insertada en el esferoide después de transcurridas dos horas. Barra de escala 100 \(\upmu\)m. Consulte el video adjunto (Parte 1).

La microscopía de fluorescencia multicolor en tiempo real se realiza mediante la excitación secuencial de los fluoróforos en forma rotativa y la adquisición de imágenes individuales sincrónicas de 500 a 540 nm, 592,5 a 667,5 nm y 817,5 a 875,5 bandas de espectro nm. Las imágenes individuales de los microagentes marcados con cumarina 6 se obtienen de la banda de espectro de 500 a 540 nm. Los esferoides se tiñen con CMTPX y verde de indocianina para representar su visualización en bandas de espectro de 592,5 a 667,5 nm y de 817,5 a 875,5 nm, respectivamente (Fig. 5a4). Por lo tanto, el movimiento simultáneo de los esferoides y los microagentes se puede visualizar desde todas las bandas de espectro utilizadas en la microscopía multicolor. Nuestros microagentes pueden movilizar esferoides de células HeLa mediante un campo magnético externo. La Figura 4a muestra un esferoide impulsado por múltiples microagentes unidos en el depósito que contiene verde de indocianina en el medio de cultivo con un campo magnético de 60 mT. La figura 4b demuestra la rotación en el sentido de las agujas del reloj de un esferoide debido a desequilibrios en la unión de microagentes durante la propulsión. Movilizamos los esferoides con microagentes para informar el rendimiento de la microscopía multicolor en tiempo real. El depósito abierto se utiliza como banco de pruebas experimental, ya que permite la movilidad de traslación y rotación de los esferoides mediante la unión de microagentes. Las imágenes multicolores se forman a 15 fps, donde la tasa de adquisición de imágenes individuales es de 45 fps. Las Figuras 4c1,d1 muestran el movimiento hacia adelante de dos y múltiples esferoides propulsados ​​por microagentes con un campo magnético de 120 mT, respectivamente. La Figura 4e1 muestra un caso representativo para dirigir un esferoide con propulsión de los microagentes cambiando la dirección del campo magnético. La información de la ruta obtenida mediante el seguimiento visual muestra los movimientos de traslación de los esferoides hasta 218 \(\upmu\)m/s (\(\approx\) 1,3 cuerpo-longitud/seg) en la Fig. 4c2,d2,e241. Para visualizar la movilidad rotacional, un esferoide se mueve en el sentido de las agujas del reloj mediante un solo accesorio de microagente con un campo magnético máximo de 36 mT (Fig. 5a1, a4). La información de movimiento del esferoide con microagente se representa como campos vectoriales utilizando el flujo óptico de Lucas-Kanade y se muestra en la Fig. 5a2. Los campos vectoriales y la ruta del microagente adjunto muestran que el esferoide gira alrededor de su eje con una velocidad angular máxima de 1,2 rad/s (Fig. 5a3). La movilidad rotacional y traslacional se visualiza juntas mediante la activación de dos esferoides adheridos con un grupo de microagentes en un campo magnético giratorio de 16 mT a 1 Hz (Fig. 5b1). La figura 5b2 demuestra el campo de movimiento para la rotación de los dos esferoides con el grupo de microagentes. El movimiento de traslación de los esferoides se representa en la Fig. 5b3. Nuestros experimentos muestran que la microscopía multicolor permite visualizar el movimiento simultáneo de múltiples esferoides y microagentes en campos magnéticos variables en el tiempo hasta una velocidad de traslación de 504 \(\upmu\)m/s (\(\approx\) 3.4 cuerpo- longitud/s para un esferoide) a 15 fps. También validamos que los esferoides como un cuerpo orgánico pueden ser activados por microagentes únicos, múltiples y un grupo de microagentes en un entorno de reservorio. Con el fin de inmovilizar un único esferoide para la unión de microagentes y proporcionar un entorno confinado para la microscopía multicolor, se desarrolla un chip de microfluidos.

Traducción de esferoides de células HeLa por microagentes magnéticos en un depósito lleno de medio de cultivo y verde de indocianina. (a1) Propulsión de un solo esferoide por conexión de microagentes. (a2) Microscopía bicolor de lapso de tiempo para la conexión de microagentes al esferoide. (b1) Rotación de un esferoide provocada por la propulsión de microagentes. (b2) Demostración de la rotación del esferoide mediante imágenes de gradiente. (c1, d1) Traducción simultánea de dos y múltiples esferoides por micro-agentes, respectivamente. (e1) Dirigir un esferoide propulsado con microagentes cambiando la dirección del campo magnético. (c2–e2) Información de trayectoria y velocidad de los esferoides en (c1–e1), respectivamente. Barra de escala 100 \(\upmu\)m. Consulte el video adjunto (Parte 1).

Rotación y traducción de esferoides de células HeLa con unión de microagentes en un depósito lleno de medio de cultivo y verde de indocianina. (a1, b1) Actuación de los esferoides con microagente único y en grupo, respectivamente. (a2,b2) Los campos vectoriales superpuestos en las imágenes multicolores de lapso de tiempo muestran el movimiento de rotación de los esferoides analizados utilizando el flujo óptico de Lucas-Kanade. (a3,b3) Perfil de movimiento e información de velocidad de los esferoides. (a4) Descomposición de imagen espectral de la imagen multicolor en el tiempo cero. Barra de escala 100 \(\upmu\)m. Consulte el video adjunto (Parte 1).

Para crear un modelo de tumor simplificado en 3D, se desarrolla un chip de microfluidos que es capaz de inmovilizar un solo esferoide de células HeLa con un diámetro entre 100 y 250 \(\upmu\)m42. El chip contiene una cámara construida con una matriz de pilares en forma de U con un espacio de 80 \(\upmu\)m, que bloquea el escape del esferoide y permite la entrada de microagentes (Fig. 6a1). Durante la inyección, los pilares atrapan el esferoide (Fig. 6a2). Posteriormente, se transfiere una burbuja de aire al chip para inmovilizar el esferoide creando una diferencia de presión entre el interior y el exterior de la matriz de pilares (Fig. 6a3). Por lo tanto, el esferoide se fija en un lugar determinado para experimentos multicolores, a diferencia del posicionamiento aleatorio en el depósito abierto. El chip se llena con 250 \(\upmu\)g/ml de verde de indocianina en el medio de cultivo celular para hacerlo visible en microscopía de fluorescencia. El medio y los microagentes se inyectan sin mover el esferoide debido a la diferencia de presión. La Figura 6b muestra una imagen multicolor de lapso de tiempo para un microagente que pasa entre dos pilares y debajo de un esferoide inmovilizado. La Figura 6c1 muestra una unión de un solo microagente al perforar un esferoide inmovilizado con un campo magnético de 36 mT. Las imágenes dinámicas se realizan a 15 fps durante 395 min para validar que el chip mantiene esferoides a los que se adjuntan microagentes para microscopía multicolor a largo plazo. Las imágenes dinámicas adquiridas revelan que la resistencia al fotoblanqueo del verde de indocianina es menor que la cumarina 6 y CMTPX. La imagen de fluorescencia del chip no es posible debido al fotoblanqueo del verde de indocianina en el minuto 170, donde las caídas de intensidad de píxeles del esferoide y el microagente son del 21,2 % y el 1,6 %, respectivamente (Fig. 6c2,c3). Para recuperar la imagen de fluorescencia del chip, la luz de excitación se apaga durante una hora. La difusión de moléculas de verde de indocianina no blanqueadas desde el exterior del área de imagen hacia el interior durante el tiempo de inactividad permite nuevamente la microscopía multicolor (Fig. 6c4)43. La recuperación de la fluorescencia no se puede realizar en el depósito ya que el medio se evapora por completo debido al calor producido por la luz de excitación (Fig. 3a3,b2,c2). El depósito no está sellado para mostrar la diferencia entre las plataformas microfluídicas abiertas y cerradas en términos de adquisición de imágenes multicolores. Los experimentos realizados en nuestro estudio demuestran que el depósito (como plataforma abierta) y el chip de microfluidos (como plataforma cerrada) pueden emplearse para microscopía multicolor en tiempo real. Sin embargo, la evaporación del medio dentro del depósito inhabilita la adquisición de imágenes multicolores después de cierto tiempo. Un depósito abierto no es un entorno estable para visualizar cambios a largo plazo utilizando imágenes dinámicas multicolores, siempre que no esté sellado con una cámara transparente hermética para evitar la evaporación. Por otro lado, el chip mantiene el medio calentado en su interior para (1) permitir la microscopía a largo plazo y (2) prolongar el tiempo de obtención de imágenes multicolor mediante la recuperación de la fluorescencia. Para verificar que la recuperación de la fluorescencia no afecta la unión, el microagente se mueve aleatoriamente con un campo magnético de 14 mT entre los minutos 264 y 267 (Fig. 6c5). La velocidad máxima para el extremo distal del microagente se mide 67 \(\upmu\)m/s (1,3 cuerpo-longitud/s), y no se observa desprendimiento. La figura 6c6 verifica la unión al mostrar la parte del microagente dentro del esferoide en el minuto 395. Múltiples microagentes se unen a un esferoide inmovilizado con un campo giratorio de 16 mT a 5 Hz (Fig. 6d). Observamos que los microagentes adjuntos forman un grupo con el tiempo como resultado de la interacción dipolo-dipolo (Fig. 6e). Aunque un grupo de microagentes tiene la capacidad de activar esferoides como se muestra en la figura 4b1, el desplazamiento del esferoide se mide 0 \(\upmu\)m durante 137 min. Nuestro experimento muestra que el chip crea un entorno estático para la microscopía multicolor al permitir que se adhieran múltiples microagentes sin mover el esferoide. Validamos experimentalmente que nuestro modelo de tumor proporciona un banco de pruebas controlable y estable para la adquisición de imágenes multicolores de uniones de microagentes individuales y múltiples a un esferoide. Para verificar que la microscopía multicolor puede visualizar microagentes en entornos vascularizados, se utiliza una red vascular en un sistema de microfluidos como banco de pruebas experimental.

Microscopía de fluorescencia multicolor para visualizar los microagentes magnéticos en un entorno microfluídico. (a1) Disposición del chip diseñado para inmovilizar un solo esferoide de células HeLa. (a2) Microagente adherido a un esferoide atrapado. (a3) Inmovilización de un esferoide usando una burbuja de aire. (b) La imagen superpuesta muestra un microagente que viaja bajo un esferoide inmovilizado. (c1) Unión de un microagente a un esferoide inmovilizado. (c2–c4) Recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo de verde de indocianina. (c5) Comprobación de adherencia moviendo magnéticamente el microagente. (c6) Las flechas indican la parte del microagente dentro del esferoide. ( d ) Espacio de trabajo de la configuración utilizada para microscopía y actuación magnética. (e) Formación de un grupo de microagentes unido al esferoide. Barra de escala 100 \(\upmu\)m. Consulte el video adjunto (Parte 2).

La red vascular perfundible in vitro está diseñada mediante el cocultivo de RFP-HUVEC y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea en un sistema de microfluidos. Para la microscopía multicolor, se inyectan en el sistema 250 \(\upmu\)g/ml de verde de indocianina en el medio de cultivo celular y microagentes. La Figura 7a1 muestra una imagen multicolor estática del sistema de microfluidos que presenta la red vascular diseñada y los microagentes. La Figura 7a2 demuestra la vista ampliada del ROI definido en la imagen multicolor y destaca el movimiento de los microagentes en la red vascular por flujo pasivo y atracción magnética con un campo de 70 mT. El Micro-Agente (1) se mueve libremente a lo largo del campo magnético, mientras que los Micro-Agentes (2) y (3) golpean las paredes del lumen después de 33 s. Nuestro experimento muestra que los microagentes se perfunden en la red vascular a través de las aberturas del lumen y se pueden rastrear simultáneamente (Fig. 7a3). La Figura 7b muestra la formación de imágenes multicolores representativas y verifica que los microagentes, la red vascular y el sistema de microfluidos se resuelven espectralmente en tres bandas de espectro distintas. La morfología estructural de la red vascular se visualiza a partir de bandas de espectro dual (592,5–667,5 nm y 817,5–875,5 nm) debido a la difusión del verde de indocianina en el medio de cultivo (Fig. 7b2,b3). Esto permite una visualización completa de la estructura de la vasculatura y delimita claramente el espacio del hidrogel (Fig. 7b4,b5). La movilidad de los microagentes dentro de la red vascular se visualiza en tres conjuntos de experimentos multicolores en condiciones de cultivo sin células. En todos los experimentos, se adquieren imágenes multicolores a 3 fps para minimizar el fotodaño en RFP. La tasa de adquisición de imágenes más alta se puede lograr con condiciones de incubación, ya que los RFP-HUVEC tienen un metabolismo de buen funcionamiento activo para reconstruir las señales de fluorescencia. El primer experimento se lleva a cabo para visualizar un microagente movido por el flujo pasivo (Fig. 7c). La velocidad media del microagente se calcula como 3,3 longitud corporal/seg (25 \(\upmu\)m/s). El segundo experimento está diseñado para visualizar microagentes atraídos magnéticamente contra el flujo pasivo con un campo de 42 mT. La Figura 7d,e muestra las imágenes de lapso de tiempo superpuestas del movimiento de los microagentes con una velocidad promedio de 1,4 longitud corporal/s (17 \(\upmu\)m/s) y 2,5 longitud corporal/s (12 \ (\upmu\)m/s), respectivamente. En el tercer experimento, se visualiza la agregación de tres microagentes que utilizan fuerzas electrostáticas (Fig. 7f1). Los microagentes agregados son movidos por el flujo pasivo con una velocidad promedio de 0,04 longitud corporal/s (4 \(\upmu\)m/s) (Fig. 7f2,f3). Las imágenes multicolores adquiridas revelan que no se produce desagregación durante 186 s (Fig. 7f1, f2). Nuestros experimentos de imágenes demuestran que la microscopía multicolor: (1) proporciona una resolución espaciotemporal para el análisis cuantitativo de los microagentes dentro de la vasculatura, (2) permite la adquisición de imágenes de los microagentes con una longitud mínima de 5 \(\upmu\)m , (3) permite la codificación por colores inequívoca de los microagentes y la morfología vascular diseñada en tiempo real. A continuación, informamos el rendimiento de la microscopía multicolor mediante la visualización de microagentes dentro y fuera de los vasos sanguíneos naturales.

Microscopía de fluorescencia multicolor para visualizar los microagentes magnéticos en una red de vasos perfundibles. (a1) Imagen multicolor de los microagentes marcados con cumarina 6 en una vasculatura formada con RFP-HUVEC en un sistema microfluídico lleno de medio de cultivo y verde de indocianina. (a2) Movimiento de los microagentes por flujo pasivo y tracción magnética con un campo de 70 mT. (a3) Trayectoria y velocidad de los microagentes. ( b ) Formación de imágenes multicolores superponiendo las imágenes adquiridas espectralmente diferentes. (c1,d1–e1) Movimiento de los microagentes en un lumen por flujo pasivo y tracción magnética con un campo de 42 mT, respectivamente. (c2–e2) Imágenes de fluorescencia combinadas de los microagentes y lúmenes. (f1,f2) La agregación y el movimiento de los microagentes en una vasculatura por flujo pasivo, respectivamente. (f3) Velocidad y trayectoria de los microagentes agregados. Barra de escala 100 \(\upmu\)m. Consulte el video adjunto (Parte 3).

La vasculatura de la membrana corioalantoidea (CAM) ex ovo que contiene los vasos sanguíneos jerárquicos de múltiples escalas se utiliza para visualizar los microagentes en un entorno nativo (Fig. 8a1). Las Figuras 8a2,a3 muestran la morfología estructural de la vasculatura visualizada usando microscopía de campo brillante como referencia y microscopía multicolor con autofluorescencia de eritrocitos, respectivamente. La imagen multicolor está formada por la separación espectral de tres características celulares principales: vasculatura, eritrocitos y CAM (Fig. 8a4). Perfundimos la CAM usando DPBS para eliminar completamente los eritrocitos que flotan libremente dentro de las estructuras vasculares. Esta estructura vascular descelularizada permite la libre circulación de microagentes, así como de múltiples soluciones de fluoróforos. Para la tinción, la vasculatura se coloca en una placa de Petri que contiene 250 \(\upmu\)g/ml de verde de indocianina en medio de cultivo, 100 \(\upmu\)g/ml de rodamina B en agua y los microagentes durante una noche. período. Antes de los experimentos de formación de imágenes, el plato que contiene la muestra teñida se lava con DPBS mediante agitación manual durante 15 min para evitar la agregación de los microagentes en la CAM. Se corta una parte circular con un diámetro de 15 mm de la muestra y se transfiere a un depósito de PDMS para microscopía multicolor. La imagen multicolor estática representativa de un vaso sanguíneo bifurcado descelularizado y los microagentes después del lavado con DPBS se muestra en la Fig. 8b1. El ROI (1)–(3) definido en el plano de imagen multicolor resalta los microagentes en la membrana corioalantoidea, en la pared del vaso y dentro del vaso, respectivamente. Para revelar detalles sobre los microagentes y los vasos, la vista ampliada del ROI (1)–(3) se muestra en la Fig. 8b1–b3, respectivamente. La descomposición de la imagen espectral de ROI (2) y (3) verifica que los microagentes y el vaso se toman imágenes de diferentes bandas de espectro, y que hay una diferencia de contraste entre la CAM y la pared del vaso (Fig. 8b2,b3). La diferencia de contraste disminuye en un 90% ya que los poros heterogéneos presentes en la pared del vaso permiten la difusión de rodamina B y verde de indocianina (Fig. 8c, d). Las imágenes multicolores en tiempo real se adquieren a 5 fps con un tiempo de exposición de 66 ms, donde los microagentes son atraídos con un campo magnético de 42 mT. La velocidad media de los microagentes que se mueven fuera y dentro del vaso se calcula como 1 longitud corporal/s longitud/s (8 \(\upmu\)m/s) y 0,5 longitud corporal/s longitud/s (2 \(\upmu\)m/s), respectivamente (Fig. 8c,d). El microagente dentro del vaso se tira hasta que alcanza la pared. El desplazamiento del microagente después de que llega a la pared del vaso se mide como 0 \(\upmu\)m durante 5 min, mientras que los microagentes del exterior viajan a lo largo del campo magnético (Fig. 8d). Nuestro experimento demuestra que la microscopía multicolor proporciona una visualización en tiempo real de los microagentes dentro de los vasos sanguíneos naturales.

Microscopía de fluorescencia multicolor para visualizar los microagentes magnéticos en la membrana corioalantoidea de pollo ex ovo. (a1) Muestra preparada para la visualización de la red vascular utilizando la propiedad de autofluorescencia de los eritrocitos. (a2, a3) Imágenes de campo brillante y multicolor de la red, respectivamente. (a4) Descomposición espectral de ROI en (a3). (b1) Imagen multicolor de los microagentes marcados con cumarina 6 y un recipiente que contiene rodamina B y verde de indocianina. ROI (1)–(3) en (b1) que muestra los microagentes en la membrana, en la superficie del vaso y dentro del vaso, respectivamente. (b2,b3) Vista ampliada y descomposición espectral de ROI (2) y (3), respectivamente. ( c, d ) Movimiento magnético de los microagentes fuera y dentro de los vasos, respectivamente. Barra de escala 100 \(\upmu\)m. Consulte el video adjunto (Parte 4).

En este trabajo, demostramos microscopía de fluorescencia multicolor para visualizar microagentes poliméricos dentro de modelos 3D de tumor en un chip y vasculatura para la aplicación prevista de administración de fármacos dirigida. En comparación con las técnicas de imagen utilizadas en la literatura, los microagentes y los alrededores se resuelven espectralmente en tres bandas de espectro distintas, y se adquiere la visualización codificada por colores de los modelos. Validamos experimentalmente que la microscopía multicolor permite la adquisición de imágenes espectralmente diferentes de microagentes en diferentes relaciones de aspecto, cuerpos orgánicos, medios circundantes de hasta 15 fps y detección de movimiento secuencial de hasta 504 \(\upmu\)m/s de cada espectro banda. Como resultado de la codificación por colores, se obtiene una mayor comprensión de la identificación y discriminación de cada microcomponente. Nuestras mediciones muestran que la microscopía multicolor delimita los compartimentos espaciales en tiempo real para analizar y verificar la funcionalidad de los microagentes. Esperamos que la microscopía multicolor en tiempo real acelere la traducción de los microagentes a la práctica al permitir la visualización clara requerida.

La configuración de electrohilado para la fabricación de microagentes se construye utilizando una fuente de alimentación de alto voltaje (60C24-P250-I5, Advanced Energy, EE. UU.) y una bomba de jeringa (NE-4000, New Era Pump Systems, EE. UU.) (Fig. 1a) . Se utiliza una unidad de adquisición de datos (34972A, 34901A, 34907A, Keysight, EE. UU.) para transferir señales de control a la fuente de alimentación de alto voltaje y recopilar datos de retroalimentación. La configuración se coloca dentro de un recinto hermético para garantizar una fabricación reproducible al proporcionar la misma condición de convección de aire. La solución de polímero para el electrohilado consta de gránulos de poliestireno (430102-1KG, Sigma-Aldrich, EE. UU.) como polímero portador, N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra como disolvente (227056-1L, Sigma-Aldrich, EE. UU.), cumarina 6 ( 442631-1G, Sigma-Aldrich, EE. UU.) como fluoróforo hidrófobo y nanopartículas de óxido de hierro (\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)) (637106-25G, Sigma-Aldrich, EE. UU. ) como material magnético44,45. Para la fabricación de fibras continuas perladas y rectas, soluciones con 30,02% (19,8% poliestireno, 10,0% \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\), 0,2% cumarina 6) y 45,25% (30,1 % poliestireno, 15,0% \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\), 0,2% cumarina 6) relación peso-volumen en DMF, respectivamente. \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) y DMF primero se sonican durante 30 minutos para desagregar las partículas. Posteriormente se añaden gránulos de poliestireno y cumarina 6 a la mezcla y se mezclan usando un mezclador de rodillos (LLG-uniRoller 6, LLG-Labware, Alemania) durante 12 h para lograr una solución homogénea. Para el proceso de electrohilado, la solución de polímero se coloca en una jeringa de plástico y se conecta a través de un tubo de teflón a una aguja de punta roma de calibre 18 (TS18SS-15, Adhesive Dispensing Ltd., Reino Unido). El voltaje de aceleración, la velocidad de alimentación de la solución y la distancia de la punta al colector se establecen en 14 kV, 2,5 ml/h y 16 cm, respectivamente. Se electrohilan 0,04 ml de solución de polímero a la vez, y las mallas de fibra se depositan sobre una hoja de aluminio puesta a tierra a 24 \(^{\circ }\)C y 22% de humedad. El residuo de disolvente de las fibras electrohiladas se elimina secando a temperatura ambiente durante 12 horas. Las figuras 1b1,b2 muestran las morfologías de las mallas de fibras fotografiadas con microscopía electrónica de barrido (JSM-7200F, JEOL, Japón). Las mallas de fibra depositadas se cortan en piezas de 2-3 mm con un bisturí y luego se sumergen en un vial de vidrio que contiene 1% (volumen/volumen) de Tween 80 (P4780-100ML, Sigma-Aldrich, EE. UU.) en agua Milli-Q. Los microagentes magnéticos y fluorescentes se obtienen cortando las fibras con un sonicador (2510, Branson, EE. UU.) durante 2 h (Fig. 1c1). El proceso de molienda de polímeros mediante sonicación acorta aleatoriamente las fibras continuas para obtener microagentes. La configuración de electrohilado también está diseñada para depositar las fibras en el colector con una orientación aleatoria. Esta técnica de fabricación se selecciona para permitir la validación de la adquisición de imágenes multicolor utilizando microagentes con distribución de tamaño aleatoria. Para obtener microagentes con los tamaños deseados, las fibras sintetizadas pueden alinearse con un tambor colector y cortarse con un láser46. Además, el proceso de electropulverización garantiza la fabricación de microagentes en forma de perlas con una distribución de tamaño estrecha. La configuración se puede utilizar para electropulverización sin ninguna modificación47. La Figura 1c2 muestra imágenes de fluorescencia de los microagentes fabricados. El perfil de superficie de un microagente caracterizado mediante microscopía confocal (S Neox, Sensofar, España) se muestra en la Fig. 1c3. Para determinar los rangos de longitud de onda de excitación y emisión óptimos para la microscopía de fluorescencia, el espectro de los microagentes se caracteriza utilizando un espectrofluorómetro (FP-8300, Jasco, Japón).

La solución para el análisis del espectro se prepara disolviendo 2,11 mg de cumarina 6 en 5 ml de DMF. Se diluyen 10 \(\upmu\)l de solución con 690 \(\upmu\)l de DMF en una cubeta de cuarzo (CV10Q700F, Thorlabs, EE. UU.) para la medición. Los espectros de emisión y excitación ultravioleta-visible, el rango de longitud de onda entre 200 y 900 nm, se mide mediante análisis de espectro 2D (Fig. 1d1). Las longitudes de onda máximas de excitación y emisión para la cumarina 6 en DMF se miden como 461 nm y 505 nm, respectivamente. El análisis de espectro 3D se realiza para medir el espectro de emisión en diferentes longitudes de onda de excitación. La solución se excita entre 350 nm y 500 nm con un incremento de 1 nm y los fotones fluorescentes emitidos se recogen en el rango de longitud de onda de 450 nm y 600 nm (Fig. 1d2,d3). Nuestra medición muestra que los fotones de fluorescencia con máxima intensidad se recolectan cuando la excitación y la emisión se realizan con bandas de espectro de 436–477 nm y 497–518 nm, respectivamente. De acuerdo con el análisis de espectro, se seleccionan bandas de 450 a 490 nm y de 500 a 540 nm para excitar la cumarina 6 y recolectar los fotones fluorescentes emitidos para la visualización de los microagentes fabricados, respectivamente. La Figura 1e1 muestra un ejemplo de microscopía de fluorescencia de banda única para el movimiento magnético de un microagente. Se realiza una microscopía multicolor para visualizar los microagentes en un entorno tumoral que contiene esferoides de células HeLa con un diámetro de 200 \(\upmu\)m.

Las células HeLa se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (11-965-092, Fisher Scientific Ltd. Canadá), complementado con suero bovino fetal al 10 % (F7524-500ML, Sigma-Aldrich, EE. UU.) y al 1 % (volumen/volumen ) penicilina-estreptomicina (15-140-122, Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.)29. Las células en 2D se cultivan y pasan al 80 % de confluencia y se realiza un cambio de medio cada 48 horas. Para la formación de esferoides de cáncer 3D, las células se tripsinizan, se resuspenden a una densidad de \(2\times {10}^6\) células/ml y se siembran en agarosa al 3% (peso/volumen) (16500500, ultrapura agarosa, Invitrogen, EE. UU.) matrices de micropocillos que dan como resultado un promedio de 267 células por esferoide. Medio cambio medio se realiza diariamente. En el día 3, los esferoides se recolectan y se tiñen con \(10\,\upmu \hbox {M}\) CellTracker Red CMTPX (C34552, Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) mediante incubación de 45 min en un medio sin suero y lavado. dos veces con medio de cultivo celular. Tanto los cultivos 2D como los 3D se realizan en una atmósfera humidificada con un 5 % de dióxido de carbono a 37\(^\circ\)C. Para el almacenamiento a largo plazo, los esferoides 3D teñidos con CMTPX se fijan a temperatura ambiente con formaldehído al 4% (F8775-25ML, Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 15 minutos y luego se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Para los experimentos de imágenes, los esferoides se inmovilizan y mantienen utilizando el chip de microfluidos desarrollado (Fig. 6a).

El método estándar de litografía blanda se utiliza para fabricar moldes negativos de los chips con una altura de 187 \(\upmu\)m utilizando SU-8 photoresist48. El proceso de salinización se realiza para eliminar fácilmente la capa de polidimetilsiloxano (PDMS) al mejorar la hidrofilicidad de la superficie del moho. Se vierte la mezcla de PDMS 10:1 desgasificado y agente de curado (Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit, Dow Corning, EE. UU.) sobre el molde y se cura a 70 \(^\circ\)C en el horno durante 12 h. Después de eliminar la capa de PDMS curada, se perforan los puertos de entrada y salida. La fabricación del chip se completa al unir la capa de PDMS en un vidrio de microscopio mediante oxidación por plasma. La fuerza de unión se mejora horneando el chip en una placa caliente a 70 \(^\circ\)C durante 4 h. Primero se transfiere un esferoide de una sola célula al chip y se inmoviliza mediante una inyección de burbujas de aire. Los microagentes se mezclan con 250 \(\upmu\)g/ml de verde de indocianina (I2633-25MG, Sigma-Aldrich, EE. UU.) en el medio de cultivo y posteriormente se inyectan en el chip mediante pipeteo. Por lo tanto, se crea un modelo de tumor 3D para la adquisición de imágenes multicolores (Fig. 6a3). Para mostrar que la microscopía multicolor proporciona imágenes resueltas espectralmente para los microagentes en modelos vascularizados, se forma una red vascular perfundible en un canal de microfluidos.

Las células endoteliales de la vena umbilical humana con proteína de fluorescencia roja (RFP-HUVEC) (cAP-0001, Angio-Proteomie, EE. UU.) se cultivan en 2D con medio de crecimiento de células endoteliales 2 (medio EGM-2) C-22111, Promo Cell, EE. UU.) con 1% (volumen/volumen) (v/v) de penicilina-estreptomicina. Paralelamente, se cultivan células madre mesenquimales (PT-2501, Lonza, EE. UU.) en 2D en medio mínimo esencial con modificación eagle-alpha (22571020, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) suplementadas con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (F7524v). , Sigma-Aldrich, EE. UU.), l-glutamina 2 mM (35050061, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), ácido ascórbico 0,2 mM (A8960-5G, Sigma Aldrich, EE. UU.), penicilina-estreptomicina al 1 % (v/v) (15 -140-122, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y 1 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (PHG0261, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Ambos tipos de células se cultivan en una atmósfera humidificada con 5 % de dióxido de carbono a 37 \(^{\circ }\)C y se utilizan entre los pases 4 y 6. Las células se cultivan hasta un 80 % de confluencia antes del desprendimiento y se mezclan en un concentración de \(10\times 10^{6}\) células/ml (relación 1 a 1) en un hidrogel de fibrina en una concentración final de 3 mg/ml (Fibrinogen, 0215112201, MP Biomedicals, EE. UU.) y 3 U de trombina (0215416301, MP Biomedicals, EE. UU.). La mezcla de matriz celular se inyecta en la cámara de hidrogel del puerto de carga de gel del sistema de microfluidos y se deja polimerizar en la incubadora a 37 \(^{\circ }\)C durante 15 min. Antes, el área de la superficie microfluídica se funcionaliza para promover una fuerte interacción del hidrogel con el PDMS y el vidrio mediante la incubación del chip microfluídico después de la oxidación del plasma durante 4 h con bromhidrato de poli-d-lisina (P1024-10MG, Sigma-Aldrich, EE. UU.) con lo siguiente pasos de lavado con agua estéril Milli-Q. Después de la polimerización del hidrogel, los puertos de carga del gel se bloquean con tiras de lámina de sellado de placa de PCR estándar para evitar fugas de fluidos y los canales de flujo junto al canal de hidrogel se llenan con medio EGM-2. La caída de presión de 5 Pa para crear los estímulos mecánicos para la vascularización in vitro se establece conectando dos bombas de jeringa (AL-1600, New Era Pump Systems, EE. UU.) en lados opuestos verticalmente. En la figura complementaria 1 se ilustra una descripción general del sistema de microfluidos para la creación de vascularización in vitro. El puerto de entrada se usa para inyectar el medio EGM-2 y el puerto de salida para extraerlo, mientras que los puertos fluídicos se bloquean con PDMS después de la inicial. relleno. Mediante la aplicación de caudales predeterminados con medio EGM-2 mediante estudios de flujo realizados con COMSOL Multiphysics (versión 5.5, COMSOL AB, Suecia). La caída de presión se mantiene durante 7 días antes de los experimentos. Para la microscopía multicolor, se inyectan 250 \(\upmu\)g/ml de verde de indocianina en el medio de cultivo celular y microagentes en el sistema de microfluidos. La figura 7a1 muestra los microagentes en la red vascular diseñada. Para visualizar los microagentes en los vasos naturales, se utiliza como banco de pruebas la membrana corioalantoidea de pollo ex ovo.

Los embriones de pollo White Leghorn se incuban a 38 \(^\circ\)C y 65 % de humedad durante todo el proceso de cultivo. En el día 10, el contenido del huevo se rompe en placas de Petri de cultivo celular de 60 mm49. Los contenidos de albúmina y yema de huevo se eliminan utilizando pipetas de manipulación de líquidos viscosos. La vasculatura se lava tres veces con una solución de DPBS helada (14190250, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y luego se fija en paraformaldehído al 4 % (1004965000, Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante la noche a 4 \(^\circ\)C durante mucho tiempo. -almacenamiento a plazo. A esto le sigue la incubación con Triton X-100 al 0,3 % (T8787-250ML, Sigma-Aldrich, EE. UU.) en DPBS durante 30 minutos y se lava tres veces con una solución de PBS helada. Para la microscopía multicolor, primero se descelulariza la vasculatura (se eliminan los eritrocitos) y luego se tiñe con rodamina B (K94900-25, Labshop, Países Bajos) y verde de indocianina.

La microscopía multicolor de campo amplio en tiempo real se realiza mediante la excitación de los fluoróforos de tres bandas de espectro diferentes en forma rotativa29. La luz de fluorescencia emitida se recopila sincrónicamente para adquirir imágenes individuales en escala de grises de 8 bits con 1280 \(\times\) 1024 píxeles. Se utilizan objetivos de larga distancia de trabajo 10x y 5x (Plan Apo, Mitutoyo, Japón) para enfocar la luz de excitación en las muestras y recolectar los fotones fluorescentes emitidos, respectivamente. La cumarina 6 y el verde de indocianina se excitan en bandas de espectro de 450 a 490 nm y de 750 a 800 nm, respectivamente. La luz emitida se recoge de 500 a 540 nm para la cumarina 6 y de 817,5 a 875,5 nm para el verde de indocianina, respectivamente. CMTPX, RFP-HUVEC y rodamina B se excitan desde la banda de 554,5 a 589,5 nm, y la luz emitida se recoge en el rango de longitud de onda de 592,5 a 667,5 nm. Los valores de intensidad en las imágenes individuales adquiridas de 500 a 540 nm, de 592,5 a 667,5 nm y de 817,5 a 875,5 nm se representan mediante mapas de color negro-verde, negro-rojo, negro-azul, respectivamente (Figs. 5a4, 7b , 8a4). Las imágenes multicolores se forman superponiendo las imágenes individuales convertidas en color adquiridas en una ronda. Se coloca una matriz ortogonal de cuatro bobinas electromagnéticas con núcleo de hierro con una frecuencia de corte de 110 Hz en el espacio de trabajo del microscopio para mover los microagentes utilizando el campo de rotación (Fig. 6d). Para la disipación de calor, el conjunto de bobinas se monta en un soporte de aluminio mediante collares cónicos. Las bobinas están cubiertas con cinta de cobre para mejorar la transferencia de calor y el aislamiento eléctrico. Se utilizan amplificadores conmutables provistos de una fuente de alimentación de CC (EA-PS 5040-20A, EA Elektro-Automatik, Alemania) para alimentar las bobinas50. Se utiliza un generador de señales (4050B, BK Precision, EE. UU.) para generar señales de referencia para la frecuencia del campo giratorio. Las señales se distribuyen a un controlador de bobina correspondiente mediante una interfaz demultiplexor (74HC4052, Texas Instruments, EE. UU.) mediante la detección del borde descendente mediante un microcontrolador. El campo magnético máximo producido por la matriz de bobinas se mide como 30 mT utilizando un teslameter (3MH3A, Senis AG, Suiza). La fuerza de tracción magnética se genera utilizando dos imanes permanentes de neodimio-hierro-boro (S-45-30-N, Supermagnete, Alemania). El campo magnético máximo y el gradiente generado por los imanes se miden como 120 mT y 5 T/m, respectivamente.

De acuerdo con las pautas holandesas para el cuidado de los animales, la aprobación de IACUC para la experimentación con embriones de pollo no es necesaria a menos que se espere la eclosión. Además, solo los experimentos con embriones de pollo de desarrollo EDD14 y mayores necesitan la aprobación de IACUC. Los embriones utilizados en este estudio estaban todos en las primeras etapas de desarrollo embrionario (EDD10). Los huevos de gallina fertilizados utilizados en este estudio se compraron en granjas avícolas aprobadas en los Países Bajos. Los estudios de cultivo de RFP-HUVEC fueron aprobados por el Ministerio holandés y los experimentos se realizaron en un entorno de laboratorio ML-1, seguido de las políticas universitarias y el protocolo estándar.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer a Pelin Kubra Isgor por presentar la idea de diseño inicial del chip microfluídico. También quisieran agradecer a Efe Bulut, Wouter Abbas, Edwin Morsink, Nick Helthuis, Erik G. de Vries, Michiel Richter, Vasileios Trikalitis y Juan Sevilla por su asistencia técnica y fructíferas discusiones. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación bajo el programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el proyecto ROBOTAR de Grant 638428: dirección de aguja flexible asistida por robot para la entrega dirigida de agentes magnéticos.

Laboratorio de Robótica Quirúrgica, Departamento de Ingeniería Biomecánica, Universidad de Twente, 7522 NB, Enschede, Países Bajos

Mert Kaya, Islam SM Khalil y Sarthak Misra

Laboratorio de Robótica Quirúrgica, Departamento de Ingeniería Biomédica y Centro Médico Universitario de Groningen, Universidad de Groningen, 9713 AV, Groningen, Países Bajos

Mert Kaya, Zhengya Zhang y Sarthak Misra

Laboratorio de Vascularización, Departamento de Ingeniería Biomecánica, Universidad de Twente, 7522 NB, Enschede, Países Bajos

Fabian Stein, Prasanna Padmanaban y Jeroen Rouwkema

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MK desarrolló el microscopio de fluorescencia multicolor, diseñó la configuración de electrospinning y fabricó microagentes. MK y ZZ diseñaron componentes mecánicos en la configuración de electrospinning. MK y FS modificaron y fabricaron el chip de microfluidos. FS formó esferoides de células HeLa y diseñó una red vascular in vitro en el sistema de microfluidos. PP incubó embrión de pollo y preparó ex ovo muestras de membrana corioalantoidea. MK, FS y PP llevaron a cabo experimentos y prepararon el manuscrito. ISMK, JR y SM proporcionaron comentarios científicos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Mert Kaya.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Información complementaria 3.

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Reimpresiones y permisos

Kaya, M., Stein, F., Padmanaban, P. et al. Visualización de microagentes y alrededores mediante microscopía de fluorescencia multicolor en tiempo real. Informe científico 12, 13375 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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Recibido: 22 Abril 2022

Aceptado: 22 de julio de 2022

Publicado: 04 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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