Caracterización sistemática de salas limpias

Nov 09, 2023

Microsystems & Nanoengineering volumen 8, Número de artículo: 54 (2022) Citar este artículo

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Las válvulas integradas permiten el control automatizado en sistemas de microfluidos, ya que se pueden aplicar con fines de mezcla, bombeo y compartimentación. Tal automatización sería muy valiosa para aplicaciones en sistemas de órgano en chip (OoC). Sin embargo, los sistemas OoC suelen tener dimensiones de canal en el rango de cientos de micrómetros, que es un orden de magnitud mayor que las válvulas microfluídicas típicas. El proceso de fabricación más utilizado para válvulas integradas de polidimetilsiloxano (PDMS) normalmente abiertas requiere una fotoprotección de reflujo que limita la altura alcanzable del canal. Además, los bajos volúmenes de carrera de estas válvulas dificultan la consecución de caudales de microlitros por minuto, que normalmente se requieren en los sistemas OoC. En este documento, presentamos una 'macroválvula' mecánica fabricada mediante litografía blanda multicapa utilizando moldes directos microfresados. Demostramos que estas válvulas pueden cerrar canales redondeados de hasta 700 µm de alto y 1000 µm de ancho. Además, utilizamos estas macroválvulas para crear una bomba peristáltica con una tasa de bombeo de hasta 48 µL/min y un dispositivo de mezcla y dosificación que puede lograr la mezcla completa de un volumen de 6,4 µL en solo 17 s. Un experimento inicial de cultivo celular demostró que un dispositivo con macroválvulas integradas es biocompatible y permite el cultivo celular de células endoteliales durante varios días bajo perfusión continua y renovación automatizada del medio.

Los órganos en chips (OoC) se definen comúnmente como dispositivos de cultivo celular de microfluidos que contienen dos canales paralelos direccionables de forma independiente que están separados por una membrana porosa. Se pueden cultivar diferentes tipos de células en ambos lados de la membrana, lo que da como resultado una interfase tejido-tejido compleja y específica de órgano1,2. Los dispositivos OoC se consideran una poderosa alternativa a los modelos in vitro y animales convencionales3. Sin embargo, realizar experimentos de cultivo celular en chip no es trivial. Los OoC pueden ser laboriosos y difíciles de usar, ya que requieren experiencia tanto en microfluidos como en cultivo celular4,5.

Para traducir OoC de dispositivos de prueba de concepto a sistemas comerciales, por ejemplo, detección de fármacos y medicina personalizada, es crucial que los sistemas OoC tengan un mayor rendimiento. Los OoC multiplexados son un enfoque prometedor para aumentar el rendimiento de los experimentos OoC5,6. En los últimos años, se han presentado varios sistemas de microfluidos con un mayor nivel de paralelización o rendimiento, pero cada uno de ellos tiene sus propios inconvenientes. Por ejemplo, Mimetas OrganoPlate® es un sistema con 40 a 96 pocillos de cultivo independientes u OoCs7. Sin embargo, requiere muchos pasos de pipeteo para llenar cada chip individual, el área de cultivo celular es pequeña y la configuración requiere el uso de un hidrogel (como barrera semipermeable y/o como sustrato celular). Zakharova et al. mostró un ejemplo de un diseño con una entrada común y ocho salidas paralelas que se puede usar para lograr niveles más altos de rendimiento, pero todavía se necesita mucho manejo manual8.

A menudo se utilizan sistemas con válvulas microfluídicas integradas para reducir la necesidad de manipulación manual de líquidos, como los mostrados por Vollertsen et al.9,10. Estos sistemas suelen utilizar válvulas integradas normalmente abiertas11, ya que las válvulas son fáciles de fabricar y ocupan poco espacio en relación con el ancho del canal en comparación con las válvulas normalmente cerradas12,13. En 2000, Unger et al. presentó una válvula PDMS normalmente abierta que actualmente se usa con frecuencia, también conocida como válvulas estilo Quake12. Estas microválvulas son una herramienta esencial para el control automatizado en microfluídica, ya que se pueden aplicar para mezclar, bombear y multiplexar en una amplia gama de aplicaciones9,10,14,15. Aunque estos sistemas de integración a gran escala de microfluidos (mLSI) permiten un mayor rendimiento, no son compatibles con las dimensiones de canal grandes que se necesitan para acomodar cultivos celulares relevantes en OoC.

El proceso de fabricación original de las válvulas estilo Quake se basa en una fotoprotección de reflujo para lograr canales redondeados para el sellado completo de las válvulas, lo que limita su aplicación a alturas de canal de hasta decenas de micrómetros12. Esto hace que las válvulas no sean adecuadas para la mayoría de las aplicaciones OoC, ya que las OoC a menudo contienen canales de cientos de micrómetros de alto y ancho16,17,18,19,20. Además, los sistemas de cultivo de células en 3D, como los esferoides de células en un chip PDMS, a menudo requieren dimensiones de canal de cientos de micrómetros21. Además, las bombas peristálticas que se fabrican con una fotoprotección de reflujo generalmente solo pueden alcanzar velocidades de flujo de 0,05 µL/min hasta 0,15 µL/min12,14,22,23,24. Sin embargo, las velocidades de flujo que se utilizan normalmente en los OoC son un orden de magnitud superior, entre 0,5 µL/min y 3,3 µL/min16,17,18,19,20,25, que pueden ser incluso mayores en vasos sanguíneos en chips para lograr tensiones de cizallamiento fisiológicamente relevantes. Para transferir las ventajas de la tecnología de chip mLSI a la tecnología OoC, se necesitan nuevos métodos de fabricación para válvulas PDMS normalmente abiertas.

Aunque el uso de PDMS está en debate13,26,27, sigue siendo el material elegido por muchos grupos de investigación:28 es fácil de usar en procesos de fabricación (para fundición, revestimiento de superficies y unión a PDMS o vidrio), permeable a los gases (permitiendo que el oxígeno se difunda a las células), bajo costo y tiene una alta elasticidad (permitiendo la posibilidad de válvulas tipo Quake)13,26,29. Anteriormente, se exploraron nuevos métodos de fabricación que utilizan fotolitografía e impresión 3D para crear válvulas que pueden cerrar canales de cientos de micrómetros de altura. Freitas et al.30 han mostrado un método para fabricar una válvula estilo Quake mediante fotolitografía con una altura y un ancho máximos de aproximadamente 250 y 400 µm, respectivamente. Sin embargo, su método requiere pasos de litografía extrasuaves y la presurización de los canales durante el curado del PDMS30, lo que complica el proceso de fabricación. La impresión 3D también ofrece una alternativa a la fotolitografía para la fabricación de válvulas estilo Quake, como lo muestran Lee et al.31 y Glick et al.32. Sin embargo, estas válvulas están completamente impresas en 3D y no están hechas de PDMS, lo que significa que las válvulas no pueden integrarse directamente en un PDMS OoC31. Glick et al. y Compera et al. ambos muestran una válvula estilo Quake, cerrando un canal de 500 µm de alto y 200 µm de alto, respectivamente, fabricados con moldes directos impresos en 3D32,33. Sin embargo, la impresión 3D de moldes para litografía blanda de PDMS plantea desafíos en términos de compatibilidad de materiales, acabado superficial y la incapacidad de pulir con vapor, límite de resolución, repetibilidad, facilidad de uso y velocidad de fabricación34, y el uso de un fotorreticulador, que puede interferir con el curado de PDMS35,36.

El microfresado es una técnica de creación rápida de prototipos que emerge rápidamente para la fabricación de moldes de microfluidos que ofrece un conjunto único de ventajas sobre la impresión 3D y la fotolitografía. El microfresado es un método de fabricación rápido, versátil, sin sala limpia y, por lo tanto, de bajo costo, que permite geometrías 3D complejas dentro de un molde37. Un molde microfresado hecho de un plástico, como el polimetilmetacrilato (PMMA), es más fuerte y, por lo tanto, más resistente que los maestros fotorresistentes frágiles, que son particularmente vulnerables cuando se obtienen estructuras fotorresistentes relativamente grandes. Además, el microfresado de moldes requiere menos mano de obra que la fabricación de moldes mediante el proceso convencional de fotolitografía con fotorresistencia de reflujo, que también requiere experiencia para lograr resultados reproducibles. Aunque ya se han informado moldes microfresados ​​para macroválvulas de PDMS21,38, los métodos de fabricación correspondientes requieren un molde negativo y una doble fundición de PDMS en PDMS21, o un paso de fundición de tereftalato de polietileno (PET)38. Además, las dimensiones de estos canales redondeados están limitadas por la disponibilidad de herramientas de fresado en forma de cono21,38.

Hasta donde sabemos, somos los primeros en describir un método en el que se utiliza el microfresado para fabricar directamente un molde positivo para una macroválvula PDMS estilo Quake con dimensiones de cientos de micrómetros. Nuestro método propuesto nos permite crear un molde con una estructura vertical con cualquier forma (por ejemplo, cilíndrica o elíptica) y tamaño (alto y ancho) según se desee, sin estar limitado por las formas y tamaños de los molinos cónicos o de bolas disponibles. Dichos moldes positivos directos facilitan y simplifican el proceso de fabricación y minimizan el error potencial causado por la contracción del PDMS en comparación con los métodos de fundición doble21,38. En resumen, los moldes directos microfresados ​​propuestos para fabricar válvulas estilo Quake permiten un enfoque más sencillo para la comercialización de moldes y la multiplexación de PDMS OoC.

En este artículo, mostramos un método de fabricación completamente libre de salas limpias para 'macroválvulas' PDMS estilo Quake mediante el uso de microfresado para fabricar moldes positivos directos. Los canales de control pueden formar tanto puentes para cruzar como válvulas para cerrar canales de flujo redondeados. Además, ofrecemos una guía de diseño de válvulas al caracterizar sistemáticamente las alturas, anchos y presiones de actuación del puente y del canal de la válvula. Las macroválvulas pueden cerrar canales redondeados de hasta 700 µm de alto y 1000 µm de ancho. Se utilizó un diseño de macroválvula (para cerrar un canal redondeado de 400 µm de alto y 1000 µm de ancho) para otros experimentos. Al crear tanto una bomba peristáltica como un dispositivo de mezcla y dosificación, demostramos la efectividad de la macroválvula. La bomba peristáltica puede lograr una tasa de bombeo de hasta 48 µL/min, y el dispositivo de mezcla y medición puede lograr la mezcla completa de un volumen de 6,4 µL en solo 17 s. Se utilizó un segundo diseño de válvula (para cerrar un canal de 200 µm de alto y 1000 µm de ancho) para un experimento de cultivo celular de prueba de concepto que mostraba el cultivo de células endoteliales durante varios días bajo flujo peristáltico en un dispositivo PDMS, demostrando su biocompatibilidad. Este experimento también demuestra el potencial de las macroválvulas para aplicarse en OoC multiplexados y permitir la automatización del cultivo celular en OoC, lo cual es extremadamente relevante para obtener una investigación de OoC de mayor rendimiento y, al mismo tiempo, reducir la necesidad de manipulación manual de líquidos.

Los dispositivos fabricados con macroválvulas integradas (Fig. 1) constaban de tres capas (Fig. 1g): un portaobjetos de vidrio, una capa delgada de PDMS que contenía canales de control que estaban cubiertos por una membrana de PDMS flexible (capa de control) y una capa de PDMS. con un canal de flujo redondeado (capa de flujo). La figura 1a, b muestra un canal de control que cruza un canal de flujo redondeado de 1 mm de ancho y 400 µm de alto. El canal de flujo se llenó con colorante alimentario azul. Si la sección transversal del canal de control con el canal de flujo era suficientemente ancha, la membrana del canal de control se desviaba al presurizarse hacia el canal de flujo y lo cerraba (Fig. 1b, c), cerrando así la válvula. El proceso de fabricación (simplificado) se ilustra en la Fig. 1d-g. Se usaron moldes microfresados ​​directamente para moldear el PDMS para la capa de flujo y recubrir por rotación el PDMS para la capa de control. Después de precurar ambas capas, se pueden alinear y unir a un portaobjetos de vidrio según Unger et al.12.

a, b Imágenes microscópicas vistas desde arriba de: aa capa de control con una válvula abierta y un puente, ba canal de control presurizado con una válvula cerrada y un puente, sin cerrar el canal de flujo. Los canales de flujo redondeados contienen colorante alimentario azul y los canales de control contienen agua. c Ilustración esquemática de una válvula abierta y una cerrada desde una vista transversal en el sitio de la válvula. Al presurizar el canal de control (P ↑ ), la válvula se cierra. d–g Ilustración simplificada del proceso de fabricación. d Se utiliza un molde microfresado con una estructura redondeada vertical para moldear PDMS como capa de flujo. e Se utiliza como capa de control un molde microfresado con estructuras rectangulares (canales de control). El PDMS se puede recubrir por rotación en el molde, lo que da como resultado una fina membrana de PDMS entre el canal de control y el canal de flujo. f El PDMS se puede precurar y las dos capas se pueden alinear posteriormente. g La capa de control se une a un portaobjetos de vidrio. El dispositivo fabricado final consta de tres capas; un portaobjetos de vidrio, la capa de control y la capa de flujo

Para obtener el sellado completo de la válvula, el canal de flujo debe tener un perfil redondeado, idealmente liso. Se tomaron imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM), que mostraban una estructura en forma de escalera en el molde de PMMA (Fig. 2a, b) como resultado del fresado de esta estructura redondeada que sobresale. Con un perfilómetro Dektak (Veeco), se midió el perfil superficial de la estructura redondeada fresada en el molde de PMMA (Información complementaria S.2). Los escalones verticales de la estructura en forma de escalera se midieron en 10 µm. En la Fig. S1 se muestra una sección transversal de un modelo de PDMS del canal de flujo. Para reducir la rugosidad de la superficie del canal, se realizó un tratamiento con cloroformo de 5 minutos de los moldes de PMMA basado en Ogilvie et al.39. (Información complementaria S.1, Solución 1B). Las imágenes SEM (Fig. 2c, d) muestran el efecto suavizante del tratamiento con solvente en la superficie de la estructura sobresaliente redondeada. Este efecto de suavizado también se observó en una medición Dektak del molde tratado (Información complementaria S.2, Fig. S3). Descubrimos que las válvulas no tenían fugas cuando estaban cerradas (límite de detección: 10 nL/min) y se podían usar para bombear independientemente del paso de suavizado adicional. Por lo tanto, no utilizamos el tratamiento con cloroformo para los chips de caracterización sistemática, la bomba peristáltica o el dispositivo de mezcla y dosificación. El alisado se realiza en los moldes para el chip de recirculación que se utiliza para el cultivo celular.

Imágenes SEM del molde de PMMA para el canal de flujo redondeado: antes (a, b) y después (c, d) del tratamiento con disolvente de cloroformo

una vista superior esquemática del chip para la caracterización. Este chip se fabrica en 4 versiones, cada una con un ancho de canal de flujo fijo (250, 500, 750 o 1000 µm). La altura del canal de flujo varía como un % del ancho del canal de flujo, indicado por el gradiente azul. La altura del canal de control se fija según la versión del chip y el ancho del canal de control varía como un % del ancho del canal de flujo. b Se fabricaron 4 versiones del chip, con el ancho de canal de flujo fijo indicado. c Cierres de válvula de las 4 versiones de chip a diferentes presiones de actuación (indicadas por las 4 barras verticales en la parte inferior derecha: 1, 1,25, 1,5, 1,75 bar) (por bar, n = 9 a 12). Los cierres de válvula para las versiones de chip separadas (ancho de canal de flujo de 250, 500, 750 y 1000 µm) se pueden encontrar en la información complementaria S.5

Una caracterización sistemática de válvulas con diferentes dimensiones y/o presiones de línea de control proporciona una herramienta de diseño útil para fabricar dispositivos PDMS con diversas dimensiones y aplicaciones. Esta caracterización sistemática determina el ancho del canal de control requerido para rangos de anchos y alturas del canal de flujo a diferentes presiones de actuación. Se diseñaron y fabricaron cuatro chips de caracterización (cada uno con 25 secciones transversales entre un canal de control y un canal de flujo). Para cada chip, se fijó el ancho del canal de flujo redondeado (250, 500, 750 o 1000 µm de ancho; consulte la Fig. 3a, b). Se examinó un rango de alturas para los canales de flujo, que se dan como un porcentaje (%) del ancho del canal de flujo. Además, se examinaron cinco canales de control con un rango de anchos, también todos expresados ​​como porcentaje (%) del ancho del canal de flujo. Las secciones transversales de los moldes de PDMS de los moldes microfresados ​​se pueden encontrar en la información complementaria S.3 y S.4 para los canales de flujo y control, respectivamente.

Los canales de flujo se llenaron con colorante alimentario azul y se aplicó un rango de presiones de actuación (1, 1,25, 1,5 y 1,75 bar) a los canales de control. Las secciones transversales del canal de control/flujo se observaron bajo un microscopio para detectar la presencia de colorante alimentario azul en el canal de flujo (como se muestra en la Fig. 1b). La Figura 3c muestra el porcentaje de cierre de válvula promediado para las 4 versiones de chip a las diferentes presiones de actuación. La Figura 3c muestra que nuestro método de fabricación propuesto funcionó para cerrar diferentes tamaños de canales de flujo, con alturas de hasta el 70 % del ancho. Con un canal de control angosto (ancho de 10 a 12 % del ancho del canal de flujo), puentear un canal de flujo nunca fue un problema siempre que la altura del canal de flujo fuera superior al 20 % del ancho. Para el cierre, un canal de control tan ancho como el canal de flujo parecía ser el más robusto, aunque tenían la desventaja de una gran huella. Cuando se prefiere una huella pequeña, un ancho de canal de control del 60 % del ancho del canal de flujo también es suficiente con presiones de actuación más altas.

Como los OoC a menudo tienen un canal de 1 mm de ancho con una altura que varía de 150 µm a 1 mm16,17,18,19,20,25, decidimos examinar más a fondo una válvula que se ajuste a estas dimensiones OoC. En el resto de este documento, examinamos el cierre de la válvula de un canal de 1000 µm de ancho y 400 µm de alto, en lo sucesivo denominado "macroválvula".

Se examinó el comportamiento de cierre de la macroválvula aplicando diferentes presiones a los canales de flujo y control. Se usaron dos reguladores de presión para aplicar una presión diferencial (dP) a la entrada y salida del canal de flujo, y se usó un regulador de presión para aplicar presión al canal de control. Se usó un sensor de flujo, en serie con la válvula, para medir el flujo a diferentes presiones (ver Fig. 4a). Al aplicar más de 900 mbar a la línea de control, la válvula podría cerrarse para las cuatro presiones de entrada que van desde 2,5 mbar a 10 mbar.

a Comportamiento de cierre de la macroválvula. Líneas para guía visual. dP = presión diferencial entre las presiones de entrada y salida del canal de flujo, las cuales son variadas e indicadas por los diferentes colores (n = 1). b Tasa de bombeo de la bomba peristáltica a diferentes frecuencias y presiones de actuación con patrón de 6 fases (101, 100, 110, 010, 011, 001). Se observa una relación lineal entre la tasa de bombeo y las frecuencias de actuación para las tres presiones de actuación. 1 barra, R2 = 0,9999 (n = 3); 1,2 bares, R2 = 0,9997 (n = 1); 1,5 bares, R2 = 0,9998 (n = 1). c Ilustración esquemática del patrón de actuación de 6 fases de la bomba peristáltica

También se examinó la fuga de la válvula y se muestra en la información complementaria S.6. En pocas palabras, la fuga promedio de la válvula está en el rango de nL/min, que es solo el 0,1 % del caudal con una válvula abierta, por lo que podríamos concluir que la fuga de una válvula cerrada es insignificante para nuestras aplicaciones.

Se utilizaron tres válvulas consecutivas para crear una bomba peristáltica. La tasa de bombeo de la bomba peristáltica se examinó mediante la actuación de las válvulas con un patrón de 6 fases (101, 100, 110, 010, 011, 001; ilustrado esquemáticamente en la Fig. 4c) a diferentes frecuencias. La Figura 4b muestra la respuesta lineal entre la frecuencia de actuación y la tasa de bombeo para cada presión de actuación. A una frecuencia de 20 Hz, se logró una tasa de bombeo máxima de 47,9 µL/min (ver Fig. 4b). Las mediciones dentro de una bomba fueron reproducibles, como lo indican las barras de error pequeñas y casi invisibles para las mediciones a 1 bar. Otra bomba peristáltica, que se muestra en la Fig. S2, también mostró una respuesta lineal. No se examinaron las frecuencias superiores a 20 Hz, ya que no se pueden lograr con la configuración del bloque de válvulas utilizada, que tenía una frecuencia de conmutación máxima de 20 Hz.

El dispositivo de mezcla y dosificación, que se muestra esquemáticamente en la Fig. 5a, contenía dos entradas, dos salidas y una bomba peristáltica en el chip. El dispositivo de mezcla y dosificación se caracterizó por mezclar colorante alimentario y agua en los canales de flujo del chip. Durante la mezcla, se capturaron imágenes de los fluidos en el chip, que luego se convirtieron en concentraciones usando curvas de calibración, como se explica con más detalle en la sección de Materiales y Métodos.

una vista superior esquemática del dispositivo con una indicación del sitio donde se midió la intensidad. b Imagen del canal antes de mezclar. El ancho del canal (indicado con líneas discontinuas) es de 1 mm. c Imagen del canal después de la mezcla. Tenga en cuenta que este canal es redondeado. Por lo tanto, la intensidad en las esquinas es menor, mientras que la concentración real es constante; consulte la información complementaria S.7 para conocer la calibración correspondiente.d Eficiencia de mezcla a lo largo del tiempo. Se indican los períodos de mezclado y posterior enjuague. Después de 17 s de mezclado, la eficiencia de mezclado se aproxima al 90 %. e, f Concentración calculada a lo largo del ancho del canal (distancia x) antes (e) y después (f) de la mezcla. Se observó una eficiencia de mezclado promedio de 90,4 ± 3,32 % después de 17 s de mezclado (n = 3). Dilución de colorante alimentario al 100% (Entrada B) con agua (Entrada A). g Vista superior esquemática del dispositivo con una indicación (recuadro rojo) del sitio donde se midió la intensidad. h Imagen del dispositivo de mezcla y dosificación al inicio del experimento. i Concentración calculada del colorante alimentario en el canal después de diluir el colorante alimentario al 100 % con agua durante 5 ciclos. Se observa una disminución exponencial en la concentración de colorante alimentario con un ajuste exponencial de y = 102,69e−0,561x con R2 = 0,999 (n = 3 mediciones)

La cantidad de mezcla se puede cuantificar como la diferencia entre los perfiles de concentración después de la mezcla y el caso perfectamente mezclado. Cuando esto se toma como una fracción de la diferencia entre un perfil completamente sin mezclar (una función escalonada) y el mismo caso perfectamente mezclado, llegamos a la formulación de la eficiencia de mezcla informada anteriormente:40

donde N es el número de filas de píxeles, cmedida es la concentración medida a lo largo del canal, \(\bar c\) es la concentración promedio a lo largo del canal y c0 es el perfil de concentración completamente sin mezclar a lo largo del canal. Para este perfil c0, tomamos una función de paso de 0 para la mitad del ancho del canal a 2\(\bar c\) para la otra mitad del ancho del canal como referencia para el estado sin mezclar, como lo describen Johnson et al.40 .

La Figura 5a muestra esquemáticamente el sitio donde se midió la intensidad y se calculó la concentración. La figura 5b, c muestra las imágenes reales antes y después de mezclar, con la concentración calculada a lo largo de la distancia x que se muestra en la figura 5e, f. La eficiencia de mezcla mejoró de 3,46 ± 1,61 % antes de mezclar a 90,4 ± 3,32 % después de 17 s de mezcla. La eficiencia de mezcla también se calculó a lo largo del tiempo, como se muestra en la Fig. 5d. Se puede encontrar una grabación de video del proceso de mezcla en Información complementaria S.8.

El dispositivo de mezcla y dosificación también se usó para realizar una serie de diluciones (Fig. 5g–i). Primero, los canales de flujo del dispositivo que se muestra en la Fig. 5g se llenaron con colorante alimentario y, después de que una válvula cerró el circuito de mezcla, el canal principal se enjuagó posteriormente con agua al 100 % (Fig. 5g, h). Esta agua se mezcló durante 17 s con el colorante alimentario presente en el circuito de mezcla, diluyendo el colorante alimentario, lo que se repitió 5 veces, indicado como ciclos de dilución. Se puede encontrar una grabación de video del rendimiento de la serie de dilución en la Información complementaria S.9. La concentración en el canal se calculó con el mismo método que para los experimentos de mezcla (se explica con más detalle en Materiales y métodos e información complementaria S.7). La concentración en el canal se representa por ciclo de dilución en la Fig. 5i. La serie de dilución muestra un ajuste exponencial (R2 = 0,999), como se esperaba, ya que para cada ciclo, se reemplaza aproximadamente el 37 % del volumen total del circuito.

Tanto el estrés de cizallamiento como la exposición constante a factores de señalización paracrinos juegan un papel importante en la integridad del endotelio cultivado in vitro. Estos dos factores se pueden lograr mediante la recirculación del medio de cultivo celular en un chip, ya sea a través de una bomba fuera del chip41 o una bomba en el chip compuesta por microválvulas24,42. El dispositivo de mezcla y dosificación presentado permite la recirculación del medio en un circuito cerrado. El 'chip de recirculación' tiene un diseño similar al del chip de mezcla y dosificación (Fig. 6a), pero las válvulas tienen 1 mm de ancho y el canal de flujo tiene 1 mm de ancho y 200 µm de alto43. El chip de recirculación se usa para un experimento de prueba de concepto para cultivar células endoteliales durante 96 h bajo flujo peristáltico, aplicando un esfuerzo cortante a las células. Durante estas 96 h, las macroválvulas de la bomba peristáltica se activaron/desactivaron más de 3 × 106 veces en total. La bomba peristáltica se programó para funcionar a 10 Hz con un patrón de activación trifásico (011-101-110), lo que resultó en una velocidad de bombeo de 3,7 µL/min (Fig. 6c, línea de puntos). Este patrón se usó para los experimentos iniciales de cultivo de células para garantizar un volumen constante de medio que recircula en el circuito durante el bombeo, ya que hay el mismo número de válvulas cerradas en cada paso del patrón de bombeo. El mismo chip también pudo lograr tasas de bombeo más altas con el patrón de actuación de 6 fases (Fig. 6c, línea continua). Las células endoteliales formaron una capa celular confluente en el canal de flujo 96 h después de la siembra (Fig. 6b, d).

a Vista superior esquemática del dispositivo con indicaciones de la bomba peristáltica (rojo) y la cámara de la celda (verde). Las flechas blancas indican el bucle de recirculación del medio. b Imagen microscópica de contraste de fase de HUVEC (pasaje número 7) cultivadas en el chip durante 96 h bajo flujo peristáltico constante. La barra de escala representa 1 mm. c Tasa de bombeo medida de la bomba peristáltica en chip a diferentes frecuencias con patrones de actuación de 3 y 6 fases (para ambos, n = 1). d Imagen de fluorescencia de las HUVEC que expresan GFP (verde) con núcleos de células teñidas (NucBlue) y actina F (roja). La barra de escala representa 1 mm43

Nuestro método de fabricación propuesto (ilustrado brevemente en la figura 1d-g y descrito en detalle en la sección Materiales y métodos) proporciona un enfoque para la fabricación de una macroválvula utilizando dos moldes positivos con solo un paso de litografía blanda. Este método se basa completamente en el microfresado, que proporciona varias ventajas sobre el proceso de fotolitografía convencional con una fotorresistencia de reflujo. El microfresado le da al diseñador una gran libertad, ya que permite diferentes alturas dentro de un molde, lo que sería mucho más engorroso para los expertos en fotolitografía, ya que requeriría máscaras y pasos de fabricación adicionales. Además, nuestro método propuesto está completamente libre de salas limpias y los moldes microfresados ​​no requieren imprimación o recubrimiento después de la fabricación. El tiempo necesario para microfresar los dos moldes depende del tamaño del molde y de la cantidad y complejidad de las estructuras en el molde. Para la bomba peristáltica y el dispositivo de mezcla y dosificación que se muestran aquí, la molienda de ambos moldes para un dispositivo tomó 1,5 h y 2 h, respectivamente. Esto es 3 veces más rápido que el proceso de fabricación de la técnica de fotolitografía con un fotoprotector de reflujo, que requiere al menos 6 h para fabricar ambas obleas.

Las dimensiones más grandes de nuestra macroválvula permiten un mayor margen de error para la alineación de las dos capas que las válvulas microfluídicas típicas. La alineación se puede realizar utilizando un microscopio estereoscópico simple, o incluso a simple vista, y no se requiere que el usuario sea extremadamente preciso o experimentado. Las dimensiones (alto y ancho) de los canales y válvulas son un orden de magnitud (10x) más altas que las que se obtienen comúnmente con el método de fotoprotección de reflujo convencional.

Los escalones verticales de la "escalera" de la estructura redondeada de PMMA (Fig. 2a, b) se midieron en 10 µm, que se pueden ajustar mediante un parámetro específico en el software HSMworks (se explica con más detalle en la Información complementaria S.1, Solución 1A) . Debería ser posible una mayor precisión, pero requiere más potencia de cálculo y, por lo tanto, más tiempo de cálculo (y fresado). Otro enfoque para suavizar la estructura redondeada es un tratamiento con solvente de cloroformo basado en Ogilvie et al.39 (Información complementaria S.1, Solución 1B). La figura 2 muestra un claro alisado de la superficie del molde de PMMA debido a este tratamiento con disolvente de cloroformo. Sin embargo, el efecto del tratamiento con disolvente de cloroformo puede depender de varios factores, como el volumen de la placa de Petri utilizada, el volumen y la concentración de cloroformo utilizado y la distancia entre el nivel de líquido de cloroformo y la superficie del molde de PMMA. Esto da como resultado que el tratamiento con solvente requiera optimización antes de que pueda usarse, lo que complica el proceso de fabricación. Descubrimos que no se requerían ambas opciones de suavizado adicionales para cerrar completamente el canal de flujo.

La caracterización sistemática realizada (Fig. 3 e Información complementaria S.3–S.5) proporciona una valiosa herramienta de diseño para fabricar válvulas con varios tamaños y/o aplicaciones. Tenga en cuenta que el cierre de esta válvula depende en gran medida del grosor de la membrana delgada de PDMS entre las capas de control y flujo. Cuando se utiliza una velocidad de centrifugado, una relación de PDMS, un molde de tamaño o una viscosidad de PDMS diferentes, este grosor puede ser diferente, lo que genera diferencias en las características de la válvula (consulte la información complementaria S.1 Problema 2–4). Recomendamos usar la técnica de fabricación propuesta para cerrar canales redondeados con anchos de 500 µm o mayores, ya que tanto la capa de control como la capa de flujo del chip de 250 µm tienen desviaciones porcentuales muy altas tanto en anchos como en alturas (Información complementaria S. 3–S.5).

La fuga de la válvula al aplicar una presión de 20 mbar al canal de flujo y una presión de 1,5 bar al canal de control está en el rango de nL/min, que es solo el 0,1 % del caudal con una válvula abierta y por debajo del límite de detección (10 nL/min) del sensor de flujo utilizado. El tiempo de respuesta del 90 % desde una válvula abierta hasta una válvula cerrada en un 90 % fue inferior a 0,5 s (Fig. S6). Después de estos 0,5 s, el sensor de flujo no es lo suficientemente sensible para medir con precisión. Sin embargo, el caudal se mide fuera del chip PDMS con una macroválvula, lo que puede provocar un retraso en el tiempo de respuesta debido a la inercia del fluido. Para fines de compartimentación en aplicaciones OoC, este tiempo de respuesta y el sellado de la válvula son suficientes.

La figura 4b muestra que la tasa de bombeo aumenta a medida que aumenta la frecuencia de actuación, hasta una frecuencia de 20 Hz, que es la frecuencia máxima de conmutación del colector de válvulas que controla las válvulas de la bomba peristáltica44. El caudal más utilizado para OoC es 0,5 µL/min18,19,25 o 1 µL/min16,17, que puede obtenerse fácilmente con la bomba peristáltica presentada. Informamos una tasa de bombeo máxima de 48 μL/min, que es mucho más alta que las tasas de bombeo informadas para las bombas peristálticas fabricadas por el método de fotorresistencia de reflujo convencional. Las velocidades de bombeo que suelen alcanzar estas bombas van desde 0,05 µL/min hasta 0,15 µL/min12,14,22,23. Se documentan tasas de bombeo de 7,5 µL/min para dispositivos que utilizan válvulas convencionales estilo Quake45. Sin embargo, estas bombas requieren frecuencias muy altas (300–400 Hz) para obtener estas tasas de bombeo, que no se pueden obtener con el colector de válvula de solenoide externo utilizado en esta investigación. Las electroválvulas de alta velocidad, como las utilizadas por Goulpeau et al., podrían resolver este problema. Sin embargo, el tiempo alcanzable del interruptor de presión también está limitado por los volúmenes de actuación (es decir, los volúmenes de la tubería y el canal de control)45.

La figura 4b muestra la respuesta lineal casi perfecta de la frecuencia de activación y su tasa de bombeo resultante. Las bombas separadas muestran tasas de bombeo ligeramente diferentes a diferentes frecuencias y presiones de actuación, pero la linealidad antes mencionada facilita la calibración. Según el caudal deseado, la bomba peristáltica se puede calibrar determinando una presión y frecuencia de actuación adecuadas, descritas en la Información complementaria S.1, Solución 4 (Fig. S2). Dentro de un chip de bomba, se muestra que la gráfica de flujo a frecuencia es muy reproducible (Figs. 4b, 1 barra).

Mostramos que podíamos mejorar la eficiencia de mezcla de 3,46 ± 1,61 % antes de mezclar a 90,4 ± 3,32 % después de 17 s de mezcla (Fig. 5). En comparación, Kondapalli et al. mostraron un dispositivo de mezcla y medición con la aplicación de replegamiento de una proteína en chip24, donde informaron un tiempo de mezcla requerido de 45 s para mezclar completamente. Sin embargo, no se ha informado cuantitativamente sobre la eficacia de la mezcla.

Se considera que una eficiencia de mezcla superior al 90 % indica una distribución uniforme a lo largo del canal46. Sin embargo, en la literatura, los mezcladores de microfluidos son mezcladores pasivos con una estructura de canal específica que provoca la mezcla y, por lo tanto, tienen una sola eficiencia de mezcla para un caudal dado. La eficiencia de mezcla en nuestro sistema es difícil de comparar con la de los mezcladores pasivos en la literatura por dos razones: primero, la mezcla se logra activamente a través de la recirculación y, segundo, el circuito de mezcla contiene un volumen muerto que también se recircula durante la mezcla. Ambos efectos provocan un cambio en la eficiencia de la mezcla con el tiempo. El primer efecto significa que podemos simplemente recircular indefinidamente para lograr eficiencias cada vez mejores. El segundo efecto significa que inicialmente hay algunas oscilaciones en la eficiencia de mezcla medida a medida que recircula el volumen muerto. Para superar esto y aún poder facilitar una comparación con la literatura, caracterizamos el tiempo requerido para que las oscilaciones desaparezcan para que la eficiencia de mezcla alcance el 90%. En la Fig. 5d, vemos que las oscilaciones se extinguen después de 10 s de recirculación, y se alcanza una eficiencia de mezcla de ~90 % después de 17 s.

La serie de dilución que se muestra en la Fig. 5g–i muestra un ajuste exponencial, que es de esperar, ya que el tinte se diluyó con la misma cantidad de agua en cada ciclo. El ajuste muestra un factor de dilución de 0,561, que se aproxima al factor de dilución esperado de 0,584 obtenido al calcular los volúmenes de los canales en el circuito de mezcla (Información complementaria S.10). Se pueden lograr otros factores de dilución ajustando la relación de volumen en el chip.

Con el experimento de cultivo celular de prueba de concepto, demostramos que el dispositivo es biocompatible y permite el cultivo celular de células endoteliales durante varios días. Durante los experimentos iniciales a largo plazo, descubrimos que la unión entre la capa de control y el portaobjetos de vidrio no era lo suficientemente fuerte para resistir la actuación durante más de 24 h. Para resolver esto, agregamos una capa adicional de PDMS debajo de la capa de control, que se describe con más detalle en la sección Materiales y métodos. En nuestro experimento inicial de cultivo celular, demostramos que es posible accionar las válvulas durante 96 h, durante las cuales activamos/desactivamos las válvulas más de 3 × 106 veces.

La bomba peristáltica generó un esfuerzo cortante de aproximadamente 0,01 Pa cuando se accionó a 10 Hz según un patrón trifásico (calculado usando una aproximación del esfuerzo cortante de pared en canales rectangulares47). Esta aún no es una tensión de cizallamiento fisiológicamente relevante para los vasos sanguíneos (>~0,5 Pa)48,49,50; sin embargo, esto se puede resolver reduciendo las dimensiones de la cámara de la celda o usando el patrón de 6 fases que demostró lograr tasas de bombeo mucho más altas. Para otras aplicaciones de órganos en chips, como gut-on-chips, el esfuerzo cortante generado ya es suficiente25.

El proceso de fabricación sin sala limpia presentado basado en el microfresado de un molde positivo directo para macroválvulas PDMS estilo Quake es un método que, hasta donde sabemos, no se ha descrito antes. Mostramos que podemos formar tanto puentes para cruzar como válvulas para cerrar canales redondeados de hasta 700 µm de alto y 1000 µm de ancho. Se realiza una caracterización sistemática de las dimensiones de la válvula y el puente, que es una valiosa herramienta de diseño para dispositivos con dimensiones del orden de cientos de micrómetros (250–1000 µm) que no se pueden lograr con el método de fotorresistencia de reflujo convencional que normalmente se usa para producir Quake -válvulas de estilo. Las dimensiones están ajustadas específicamente para OoC, y los resultados de un experimento de cultivo celular inicial respaldan la conclusión de que las células se pueden cultivar con renovación de medio automatizada durante al menos varios días mediante el uso de esta tecnología de válvula. Además, los grandes volúmenes de carrera de las macroválvulas nos permiten alcanzar tasas de bombeo de hasta 48 µL/min usando bombeo peristáltico. La integración de estas macroválvulas permitirá el multiplexado y control automatizado de las condiciones de cultivo celular en OoCs. Estos parámetros son esenciales para obtener OoC de mayor rendimiento y reducir la necesidad de manipulación manual.

Para cada diseño se diseñaron dos moldes de PMMA en software 3D-CAD (SolidWorks®, 2018) para las capas de control y flujo. Las dimensiones de las estructuras sobresalientes dependían del diseño del chip. Las entradas y salidas estaban en una cuadrícula correspondiente a los estándares del Acuerdo de Taller ISO 23:201651.

Se utilizó HSMworks, software CAD/CAM integrado en SolidWorks®, para programar los pasos de fresado. Específicamente, los ajustes de tolerancia y suavizado en el diseño de la capa de flujo fueron esenciales para obtener una estructura sobresaliente redondeada y suave (consulte la Información complementaria S.1, Solución 1A). El material de partida de PMMA se microfresó (Datron Neo, Alemania) para obtener los moldes positivos. Para la capa de flujo se utilizó un molino de 1 mm de diámetro y para las características más pequeñas de la capa de control se utilizó un molino de 0,4 mm de diámetro. Se puede realizar un tratamiento opcional con solvente de cloroformo de 5 minutos de los moldes de PMMA basado en Oglivie et al.39 (Información complementaria S.1, Solución 1B). Después del microfresado, se puede eliminar el polvo enjuagando los moldes con agua (es opcional el uso de un baño ultrasónico para eliminar eventuales rebabas y polvo) y secándolos con una pistola de nitrógeno. Los moldes de PMMA no necesitan imprimación ni recubrimiento y pueden utilizarse directamente para la fundición de PDMS.

El proceso de fabricación de los dispositivos PDMS, ilustrado en la Fig. 7, se basa en Unger et al.12. Se mezcló PDMS (RTV 615, Permacol BV, Países Bajos) (1:7 (p/p)) para la capa de flujo y (1:20 (p/p)) para la capa de control y posteriormente se desgasificó durante 1,5 h. Se vertió PDMS (1:7 (p/p)) en el molde para la capa de flujo. Para la capa de control, se revistió por rotación PDMS (1:20 (p/p)) sobre el molde de PMMA micromolido durante 60 s, lo que resultó en una membrana de aproximadamente 60 µm de espesor en el sitio de la válvula. La velocidad de giro requerida para esta membrana de 60 µm de espesor dependía del tamaño del molde y de la altura de la capa de control. Las velocidades de giro utilizadas para los diferentes chips se resumen, junto con otros parámetros relevantes para el protocolo de fabricación, en la Información complementaria S.11 (Tabla S6). La capa de control se colocó sobre una superficie plana después de girar durante 20 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual ambas capas se precuraron durante 45 minutos a 60 °C. Después del precurado, las entradas para el canal de flujo se perforaron con un punzón de biopsia de 1 mm (Ted Pella, Inc., EE. UU.). Posteriormente, las dos capas se alinearon y presionaron para unirlas y curarlas durante la noche a 60 °C. Luego, las entradas para los canales de control se perforaron con un punzón de biopsia de 0,75 mm (Harris Uni-core), y la capa de control se unió con plasma a un portaobjetos de vidrio. Los dispositivos finales constaban de tres capas: dos capas de PDMS (flujo y control) y una capa de vidrio.

Ilustración esquemática de los procesos de fabricación de los dispositivos PDMS. *Tenga en cuenta que la velocidad de giro en el paso 3b depende del tamaño del molde de la capa de control de PMMA

Durante el uso de las válvulas para el cultivo celular durante días, se observó delaminación de la capa de control del portaobjetos de vidrio. Para resolver este problema del chip de recirculación, se agregó una capa adicional de PDMS al portaobjetos de vidrio. Se mezcló PDMS (1:10 (p/p), kit de elastómero de silicona Sylgard 184, Dow Corning), se desgasificó y se revistió por rotación sobre un portaobjetos de vidrio a 300 rpm. Esta capa se precuró durante 14 minutos a 60 °C, después de lo cual la capa de control y el portaobjetos de vidrio recubierto con PDMS se trataron con plasma de oxígeno. Después de la unión, el chip se curó por completo a 60 °C. Los resultados preliminares utilizando un método alternativo, como se describe en la Información complementaria S.1, Problema 5, mostraron una mejora prometedora en la confiabilidad y estabilidad de los dispositivos. Este método de fabricación se explorará con más profundidad en el futuro.

La Figura 8a muestra la configuración experimental para probar el comportamiento de cierre de la válvula. Se usaron dos reguladores de presión (Fluigent, serie LINEUP™) para aplicar presiones a la entrada y salida del canal de flujo, y la diferencia en estas presiones es la presión diferencial (dP). Se usó un regulador de presión (Fluigent, serie LINEUP™) para aplicar presión al canal de control. En serie con la válvula se colocó un sensor de flujo (Fluigent, FRP tamaño L).

Configuraciones experimentales para probar el comportamiento de cierre de la válvula, b medir la tasa de bombeo generada por la bomba peristáltica y c medir la eficiencia de mezcla y la serie de dilución

Para la caracterización sistemática, los canales de flujo se llenaron con colorante alimentario azul (JO-LA) y se observó el cierre de la válvula utilizando un microscopio con cámara CCD a color (FLIR Grasshopper 3, U23S6C) para registrar las imágenes. Se utilizó un sistema hecho a medida (Convergence Industry BV, Países Bajos) para la activación de los canales de control.

La figura 8b muestra la configuración experimental para medir la tasa de bombeo peristáltico. Para el accionamiento de las tres válvulas, la presión a los canales de control se aplicó a través de un bloque de válvulas (Festo), que tiene una frecuencia de conmutación máxima de 20 Hz y está controlado por un módulo Easyport (Festo). La bomba peristáltica se accionaba a una determinada frecuencia y presión durante 5 ó 10 minutos. El efluente se recogió en tubos Eppendorf, los cuales se pesaron (Balance SX64, Mettler Toledo) antes y después del bombeo.

Para el dispositivo de mezcla y dosificación (Fig. 8c), se utilizó un sistema hecho a la medida (Convergencia) para la actuación de los canales de control. Los canales de control se accionaron con una presión de 1,5 bar. Para mezclar, las tres válvulas también se accionaron con un patrón de 6 durante 20 ciclos a una frecuencia de 10 Hz. Con un regulador de presión (Fluigent, serie LINEUP™), se aplicó presión a ambas entradas del dispositivo de mezcla y dosificación. Las imágenes se tomaron con una cámara en escala de grises (Grasshopper3 GS3-U3-23S6M, cámara Point Gray).

El procesamiento y análisis de imágenes se realizaron con MATLAB (2017b). Primero, se realizó una corrección de fondo para corregir las variaciones de intensidad general (Información complementaria S.7). Se realizó una sesión de calibración en la que los canales de flujo del dispositivo de mezcla y medición se llenaron con concentraciones conocidas de colorante alimentario diluido en agua para obtener una curva de calibración (Fig. S7). La Fig. S7a muestra que cuando el canal de flujo se llena con colorante alimentario, la intensidad medida difiere a lo largo del ancho del canal (distancia x en la Fig. 5b, c) debido al perfil redondeado del canal de flujo. Para solucionar esto, se estableció una curva de calibración por fila de píxeles. En la Fig. S7b–d se muestran tres curvas de calibración en varios sitios a lo largo del ancho del canal, donde (I0/I) se representa frente a la concentración. Todas las curvas de calibración siguieron un ajuste polinomial de segundo orden. Usando estas curvas de calibración, se pudo calcular la concentración desconocida a lo largo del canal (Fig. 5). Al analizar los marcos de imagen separados del proceso de mezcla, se calculó la eficiencia de la mezcla a lo largo del tiempo (Fig. 5d). La concentración promedio (\(\bar c\)) se calculó por marco de imagen, que se usó para calcular la eficiencia de mezcla en ese marco/punto de tiempo específico.

Se cultivaron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) que expresan proteína fluorescente verde (GFP) (Angio-Proteomie, EE. UU.) en medio de crecimiento endotelial (EGM) (Cell Applications, Inc., CA, EE. UU.) matraz (CELLCOAT®, Greinder Bio-One). Antes del cultivo celular, el chip de recirculación se esterilizó realizando un tratamiento con plasma de oxígeno (40 s, 50 vatios, Femto Science, Cute), y los canales de flujo se enjuagaron con etanol al 70 % (Boom, Países Bajos) y posteriormente con fosfato- solución salina tamponada (PBS, Sigma-Aldrich). Se sembraron HUVEC que expresan GFP (pasaje número 7) en la cámara celular a una densidad de siembra de 4 × 106 células/mL. La bomba peristáltica en chip se programó para ejecutar un patrón de actuación trifásico (011-101-110) a 10 Hz. El medio de cultivo celular en el bucle se reemplazó parcialmente cada 2 h automáticamente. Se abrieron las válvulas en la entrada 1 y la salida, y se cerró la cámara de la celda (Fig. 6a), mientras que la bomba en el chip bombeaba medio fresco en el chip durante 1 minuto.

El experimento de cultivo en chip se llevó a cabo colocando el dispositivo en un sistema de incubación hecho a la medida9 durante 96 h.

Para el análisis de microscopía de fluorescencia, las HUVEC se fijaron con paraformaldehído al 4 % (Sigma Aldrich) en PBS y posteriormente se permeabilizaron con Triton-X al 0,3 % (Sigma Aldrich) en PBS. Las células se tiñeron con 15 µl/ml de AcinRed (Thermo Fisher Scientific) y NucBlue (Thermo Fisher Scientific) en PBS para visualizar los filamentos de actina F y los núcleos celulares, respectivamente. Las imágenes fluorescentes y de contraste de fase se capturaron utilizando un sistema de imágenes de células EVOS FL.

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Los autores agradecen al Ing. Johan Bomer por tomar las imágenes SEM y realizar las mediciones de perfiles de superficie Dektak. Este proyecto fue financiado por una subvención Building Blocks of Life de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), subvención no. 737.016.003 y por la Empresa Conjunta Iniciativa de Medicamentos Innovadores 2 bajo el acuerdo de subvención no. 853988. Esta Empresa Común recibió el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea y EFPIA y JDRF International.

BIOS Lab on a Chip Group, MESA+Institute, Technical Medical Center, Max Planck Institute for Complex Fluid Dynamics, University of Twente, Enschede, Países Bajos

Elsbeth GBM Bossink, Anke R. Vollertsen, Joshua T. Loessberg-Zahl, Loes I. Segerink y Mathieu Odijk

Grupo de Tecnologías Aplicadas de Células Madre, Centro Médico Técnico, Universidad de Twente, Enschede, Países Bajos

Anke R. Vollertsen y Andries D. van der Meer

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EGBMB llevó a cabo los experimentos, fabricó los diseños y contribuyó al análisis de datos y la redacción del manuscrito. ARV llevó a cabo los experimentos y contribuyó al diseño experimental, configuración experimental y redacción del manuscrito. JTZ contribuido al análisis de datos y postprocesamiento y redacción del manuscrito. ADvdM contribuyó a la redacción, edición y supervisión del manuscrito. LIS y MO contribuido al análisis de datos, redacción de manuscritos y supervisión del proyecto. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Elsbeth GBM Bossink o Mathieu Odijk.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Bossink, EGBM, Vollertsen, AR, Loessberg-Zahl, JT et al. Caracterización sistemática de macroválvulas fabricadas sin salas limpias, demostrando bombas y mezcladores para el manejo automatizado de fluidos ajustados para aplicaciones de órgano en chip. Microsyst Nanoeng 8, 54 (2022). https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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Recibido: 13 enero 2022

Aceptado: 18 de marzo de 2022

Publicado: 23 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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